BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Enzim adalah suatu protein yang dapat mempercepat reaksi metabolisme. Dalam
tubuh makhluk hidup terdapat enzim guna untuk mempercepat reaksi-reaksi yang
terjadi didalam tubuh, enzim tidak ikut bereaksi sehingga pada akhirnya enzim akan
kembali dalam bentuk semula. Sehingga enzim dapat disebut sebagai biokatalistator.
Enzim dapat ditemukan pada tumbuhan dan makhluk hidup lainnya. Secara umum
enzim dibagi menjadi tiga golongan diantaranya amylase, lipase, dan selulose
(Karmana, Oman. 2007).

1.2 Rumusan Masalah

Enzim merupakan biokatalisator yang dimana dapat mempercepat reaksi dengan
mengubah substrat awal hingga menjadi molekul lain. Enzim memiliki banyak fungsi
dalam kehidupan sehari-hari contohnya protease pada berbagai industri seperti
deterjen. Tekstil, pengolahan susu, dan pengolahan limbah. Enzim dapat ditemukan
pada semua makhluk hidup. Tumbuhan memiliki enzim, contohnya bromelin pada
getah nenas, papain pada getah papaya, lisozim dari putih telur dan lainnya ( Yunita
Putri S., 2012 ). Pada praktikum ini akan mengisolasi enzim yang terdapat pada
sekam padi dan bekatul dengan variabel tetap yaitu rasio sampel-air dan starter,
variabel bebas yaitu kadar pH dan urea, serta variabel terikat yaitu aktivitas enzim.

1.3 Tujuan Pecobaan

1. Mengisolasi enzim dari sekam padi dan bekatul
2. Menguji aktivitas enzim sekam padi dan bekatul
3. Membandingkan aktivitas enzim sekam padi dan bekatul berdasarkan kadar
pH dan urea

1.4 Manfaat Percobaan

1. Mahasiswa dapat mengisolasi enzim dengan metode fermentasi
2. Mahasiswa mampu menentukan nilai aktivitas enzim pada sampel sekam padi
dan bekatul
3. Mahasiswa mampu membuat grafik hubungan antara aktivitas enzim vs waktu
inkubasi, aktivitas enzim vs pH, aktivitas enzim vs kadar urea, aktivitas enzim
vs sampel yang digunakan

1
 BAB II
TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Pengertian Umum

Enzim atau biokatalistator adalah katalistator organik yang dihasilkan oleh sel.
Enzim dibutuhkan dalam kehidupan dikarenakan semua reaksi metabolisme dikatalis
oleh enzim. Reaksi-reaksi enzimatik dibutuhkan oleh mikroorganisme untuk
memperoleh nutrisi dalam keadaan terlarut yang dapat diserap ke dalam sel, sehingga
memperoleh enegi untuk biosintesis, perkembangbiakan, pergerakan dan lain-lain
(Rauf, Mukhlis 2011).

2.2 Penggolongan Enzim

Enzim dapat dibagi menjadi beberapa golongan. Setiap enzim memiliki nomor
“EC” yang sudah ditetapkan oleh Enzyme Comission pada tahun 1961 (diperbaharui
tahun 1992). Klasifikasi tidak memperhitungkan asam amino, struktur protein, atau
mekanisme kimia.
Berdasarkan jenis reaksi yang dikatalis, enzim dapat digolongkan sebagai berikut
(Kavitha R, 2015) beserta contoh – contohnya (Herthyna, Np, 2011):

Tabel 2.1 Penggolongan Enzim

No Kelas Reaksi-Reaksi yang Dikatalis Contoh

1 Oksidoreduktase Transfer elektron dari satu Laccase, Katalase
substrat ke yang lain
2 Transferase Mengkatalis transfer grup Glutation-S-
reaksi Transferase

3 Hidrolase Reaksi hidrolisis Pululanase,

α-Amilase
4 Liase Menghilangkan gugus
fungsional dari substrat, serta Pektin Liase
membentuk ikatan ganda
5 Isomerase Reaksi isomerisasi, termasuk Xylosa Isomerase
rasemisasi dan cis-trans isomer
6 Ligase Reaksi sintesis ikatan C-X,
serta penguraian ATP D-Alamin Ligase

2
 Golongan enzim Liase yaitu golongan enzim yang dapat mengkatalis reaksi
pemutusan ikatan kimia dari suatu molekul. Contoh subkelas 2 pemutusan ikatan
karbon-oksigen dan subkelas 3 memutuskan ikatan karbo-nitrogen. Golongan enzim
Liase merupakan enzim yang diisolasi pada praktikum isolasi enzim kali ini. Sub-
subkelasnya digolongkan bergantung pada molekul yang tereliminasi. Contoh
enzimnya adalah :
a. Pektin Liase (EC 4.2.2.10)
Pekti liase merupakan subkelas yang bekerja pada polisakarida yang
mampu mendegradasi molekul pektin yang banyak pada sel tanaman.
Enzi mini memotong pektin dengan mekanisme β-eliminasi yang
menghasilkan 4,5-oligogalakturonida tidak jenuh.
(Herthyna, Np, 2015).

2.3 Metode Isolasi Enzim

Isolasi enzim dapat dilakukan dengan 3 metode
a. Dialisis
Digunakan untuk menghilangkan komponen molekul rendah dari larutan
protein. Dialisis didasarkan pada fakta yaitu ukuran molekul protein yang
besar menyebabkan molekul tidak dapat melewati pori-pori membran semi-
permeabel, sedangkan zat molekul rendah dapat terdistribusi secara seimbang
di dalam maupun luar membrane. Dengan mengulangi pertukaran larutan
eksternal, maka kondisi di tabung dialysis (pH, kosentrasi garam) akan sama
dengan larutan disekitarnya.
b. Fraksinasi
Merupakan cara separasi dengan menambahkan garam seperti ammonium
sulfate untuk memfraksinasi dan mengendapkan protein besar dan konsentrasi
sampel encer. Metode fraksinasi dilakukan karena protein tidak larut di
larutan dengan konsentrasi garam tinggi.
c. Ultra Sentrifugasi
Metode separasi dengan memanfaatkan gaya sentrifugal protein yang
memiliki keanekaragaman massa dan densitas. Metode separasi ini
memisahkan protein dengan massa atau densitas besar dengan yang kecil.
Protein besar akan mengendap sendangkan protein kecil tidak sehingga dapat
di kumpulkan untuk analisa lebih lanjut ( Korayem, 2009 ).

3
2.4 Faktor yang Mempengaruhi Kinerja Enzim
Banyak faktor yang dapat mempengaruhi kinerja enzim. Faktor-faktor tersebut
menentukan efektivitas kinerja suatu enzim. Kerja enzim akan maksimal apabila
factor pendukung berada pada kondisi optimum.
Berikut faktor-faktor yang mempengaruhi aktivitas enzim:
a. Konsentrasi / jumlah enzim
Efektivitas kerja enzim akan bekerja dengan baik apabila konsentrasi
enzim ditingkatkan, dikarenakan konsentrasi enzim berbanding lurus
dengan efektivitas kerja enzim.
b. pH (keasaman)
Setiap enzim bekerja pada pH tertentu. Enzim dapat bekerja optimal
dalam keadaan asam dan ada yang optimal dalam keadaan basa.
Namun secara umum enzim bekerja optimal pada pH netral.
c. Produk Akhir
Reaksi enzimatis sangat terkait dengan substrat dan produk akhir.
Terdapat suatu keadaan dimana produk akhir dapat menurunkan
produktivitas kerja enzim.
d. Substrat
Enzim akan bekerja dengan baik dengan bantuan substrat. Substrat
yang cocok dengan spesifitas enzim akan mempercepat kerja enzim.
e. Suhu
Sama seperti pH, dalam suhu optimum enzim akan bekerja dengan
baik.
f. Waktu
Saat substrat bereaksi dengan substrat, waktu reaksi tersebut
menentukan aktivitias kerja enzim. Lama waktu reaksi maka kerja
enzim semakin optimum
( Aziz Pradhana, 2008 )

2.5 Perhitungan Aktivitas Enzim

Pertambahan konsentrasi substrat akan meningkatkan kecepatan reaksi. Tetapi
saat batas konsentrasi tertentu tidak terjadi kenaikkan kecepatan reaksi walaupun
konsentrasi substrat telah ditambah. Michaleis-Menten memiliki hipotesis tentang
terjadinya kompleks enzim-substrat.

Kompleks enzim-substrat diperoleh karena adanya kontak antara enzim dengan

substrat yang terjadi pada sisi aktif enzim. Apabila konsentrasi substrat rendah, sisi

4
aktif enzim akan menampung sedikit substrat dan begitupula apabila konsentrasi
substrat diperbesar maka makin banyak substrat yang bergabung dengan sisi aktif
enzim. Hal ini menyebabkan kecepatan reaksi makin besar dikarenakan konsentrasi
kompleks enzim-substrat ikut bertambah.

Michaelis dan menten berkesimpulan bahwa kecepatan reaksi bergantung pada

konsentrasi kompleks enzim-substrat [ES], sebab apabila tergantung pada konsentrasi
substrat [S], maka penambahan konsentrasi substrat akan menghasilkan pertambahan
reaksi yang apabila digambarkan akan menunjukan garis lurus. Jadi secara umum
reaksi dengan enzim ditulis sebagai berikut (poedjiadi dan supriyanti, 2006):

𝑘1 & 𝐾2 𝐾3
E+S⇔ ES → E + P

K1,k2 dan k3 masing-masing ialah tetapan kecepatan reaksi pembentukan

kompleks ES, tetapan (konstanta) kecepatan reaksi pembentukan kembali E dan S,
dan tetapan (konstanta) kecepatan reaksi penguraian kompleks ES menjadi enzim dan
hasil reaksi. Kecepatan reaksi pembentukan kompleks ES ialah:

V1 = K1[E][S]

V1 = K1([E0]-[ES])[S] (1)

[E0] = konsentrasi enzim total

[E0] – [ES] menyatakan konsentrasi enzim yang masih bebas dan [S] ialah
konsentrasi substrat. Kecepatan penguraian kompleks ES menjadi E dan S kembali
adalah :

V2 = K2[ES] (2)

Sedangkan kecepatan penguraian ES menjadi E dan p ialah :

V3 = K3 [ES] (3)

Jadi kecepatan penguraian ES ialah :

V2 + V3 – k2[ES] + k3 [ES] (4)

Dalam keadaan keseimbangan maka kecepatan pembentukan ES sama dengan

kecepatan penguraian ES, jadi :

0 = k1([E0]- [ES]) [S] – k2 [ES] + k3 [ES] atau (5)

K1([E0] – [ES]) [S] = (k2 + k3) [ES] (6)

𝑘1([𝐸0]−[𝐸𝑆])[𝑆]
Sehingga [ES] = (7)
𝑘2+𝑘3

5
[ES] (k2 + k3) = k1[E0][S] – k1[ES][S]

[ES](k1 + k3) = K1 [ES][S] = k1[E0][S]

[ES] ((k2 + k3) + k1 [S]) = k1 [E0][S]

1
𝑘1[𝐸0][𝑆] 𝑘1
Sehingga: [ES] = x 1
(𝑘2+𝑘3)
𝑘1

Km ialah konstanta michaelis-menten

Dari persamaan (7) dapat diperoleh konsentrasi kompleks enzim substrat sebagai
berikut :

[𝐸0] [𝑆]
[ES] = 𝑘𝑚+[𝑆] (8)

Kecepatan permulaan terjadinya hasil reaksi P sebanding dengan konsentrasi ES atau:

V = k3 [ES] (9)

Apabila konsentrasi substrat sangat besar sehingga semua enzim membentuk

kompleks enzim-substrat, maka kecepatan reaksi ialah maksimal dan dapat
dinyatakan sebagai berikut:

Vmaks = k3 [E0] (10)

Harga [ES] dalam persamaan (8) dimasukan ke dalam persamaan (9), maka
diperoleh:

[𝐸0][𝑆]
V = k3 𝑘𝑚+[𝑆] [11]

Dengan jalan memasukan persamaan (10) ke dalam persamaan (11) maka diperoleh:

𝑣𝑚𝑎𝑘𝑠 [𝑆]
V= [12]
𝑘𝑚+[𝑆]

Persamaan (12) disebut persamaan michaelis-menten. Penentuan harga Km dari

suatu reaksi dapat dipakai beberapa macam cara. Bisa menggunakan grafik kecepatan
reaksi konsentrasi substrat seperti dibawah :

6
 Gambar 2.1 Hubungan Antara Konsentrasi Substrat dan Kecepatan Reaksi
Enzimatis

1
Dari persamaan (12) bisa diketahui apabila harga V = 2 Vmaks maka Km = [S].

Hal ini berarti Km sama dengan konsentrasi substrat (dalam satuan mol per liter)
yang menghasilkan kecepatan reaksi sebesar setengah dari kecepatan maksimum.

Cara lain untuk menentukan harga Km maupun Vmaks ialah dengan membuat
grafik antara 1/V dengan 1/[S], seperti contoh dibawah ini ( Rosyida irawati,2016 ) :

Gambar 2.2 Kurva hubungan 1/[S] dan 1/V Aktivitas Enzim Selulase

7
 BAB III
METODE PERCOBAAN

3.1 Rancangan Praktikum

3.1.1 Skema Rancangan Percobaan
pH :
Variabel 1 = 5
Beaker Glass Variabel 2 = 5
Variabel 3 = 5
Variabel 4 = 9
Oven t = 1 jam T = 90 oC

Endapan I dibuang

Filtrat I

Centrifuge t = 20 menit 𝜔 = 2500rpm

Endapan II dibuang

Filtrat II

Larutan Enzim

Gambar 3.1 Skema rancangan praktikum

3.1.2 Variabel Operasi

Tabel 3.1 Jenis-Jenis Variabel dan Indikator yang Terpengaruhi

Jenis Variabel Indikator

Tetap sampel
Rasio , starter
air

Bebas pH, urea

Terikat aktivitas enzim

3.2 Metode percobaan

3.2.1 Bahan yang digunakan

a. Sekam padi
b. Bekatul
c. NaoH

8
 d. Aspergillus niger
e. Glukosa
f. MgSO4
g. KH2PO4
h. CaCL2
i. NaCL
j. Urea
k. Aquadest
l. CMC

3.2.2 Alat yang digunakan

a. Beaker glass
b. Corong buchner
c. Kuvet
d. Kertas Saring
e. Kompor Listrik
f. Buret
g. Statif & klem
h. Pompa vakum
i. Shaker
j. Termometer
k. Gelas Ukur
l. Pengaduk
m. Timbangan
n. Erlenmeyer penghisap
o. Indikator pH
p. Inkubator

3.3 Gambar Alat

Tabel 3.2 Gambar alat
No Nama Alat Gambar Alat
1. Beaker glass

9
2. Corong buchner

3. Kuvet

4. Kertas Saring

5. Kompor Listrik

6. Buret

7. Statif & klem

8. Pompa Vakum

9. Shaker

10
10. Termometer

11. Gelas Ukur

12. Pengaduk

13. Timbangan

14. Erlenmeyer
Penghisap

15. Indikator pH

16. Inkubator

11
3.4 Cara kerja
3.4.1 Persiapan Bahan Baku

1. Haluskan bahan sekam padi dan bekatul yang diperoleh dengan

mortar, setelah halus timbang 30 gram (sesuai variabel), masukan
dalam beaker glass.
2. Bahan direndam ke dalam larutan NaOH 0,5M (sesuai variable),
kemudian dipanaskan pada suhu 90°C selama 1 jam (sambil diaduk).
3. Setelah itu keringkan menggunakan oven pada suhu 110°C selama 1
malam

3.4.2 Pembuatan Starter

1. Media inokulum dibuat dengan menyiapkan larutan media volume
tertentu dalam erlenmeyer . media terdiri dari 2 gr glukosa, 0,2 gr
NaCl, 0,4 gr KH2PO4, 0,04 gr Ca2CL, 0,34 gr MgSO4, setelah itu
tambahkan Aspergillus niger ke dalam campuran. Tutup erlenmeyer
menggunakan alumunium foil
2. Starter diinkubasi menggunakan Shaker pada temperatur ruangan
selama 1 malam

3.4.3 Fermentasi
1. Sampel dicampur menggunakan air dengan rasio sampel-air 7 ml
untuk semua variabel, kemudian diaduk
2. Atur nilai pH 5, 5, 5, 9 masing-masing variabel secara berurutan
3. Tambahkan urea 0,2 gr, 0,6 gr, 0,2 gr, 0,2 gr pada masing-masing
variabel secara berurutan
4. Tambahkan starter 30 ml pada untuk semua variabel
5. Fermentasi dilakukan secara aerob selama 1 malam

3.4.4 Analisa Hasil

1. Hasil dari fermentasi disentrifugasi pada kecepatan 2500 rpm dalam
waktu 20 menit
2. Atur kadar pH 5, 5, 5, 9 pada masing-masing variabel secara
berurutan
3. Filtrat yang diperoleh, dicampur dengan CMC 25 ml dengan
perbandingan volume filtrate 1:1
4. Cairan diinkubasi selama 1 malam

12
 5. Sebelum inkubasi dilakukan uji kadar glukosa dan analisa hasil tanpa
variabel waktu
6. Sesudah inkubasi, dilakukan uji kadar glukosa dan analisa hasil
dengan variabel waktu 6 menit , 21 menit, 36 menit, 51 menit

3.5 Uji Kadar Glukosa

1. Membuat larutan glukosa standar dengan melarutkan 1,25 gram glukosa
dalam 500ml aquades. Ambil 5 ml glukosa standar, kemudian
diencerkan sampai 25 ml dan diambil 5 ml. Lakukan standarisasi
glukosa dengan mencampurkan 5 ml glukosa encer, 5 ml fehling A, dan
5 fehling B. Campuran ini dipanaskan sampai 60°C, dan di titrasi
dengan larutan glukosa standar sampai warna biru hampir hilang.
Tambahkan dua tetes indikator MB. Lanjutkan titrasi sampai warna
merah bata yang tidak hilang setelah pengocokan catat kebutuhan
titran(F)
2. Ambil 5 ml sampel, lalu encerkan hingga 25 ml. Ambil 5ml sampel
encer, dan tambahkan 5ml fehling A, 5ml fehling B serta 5 ml glukosaa
standar. Atur pH campuran hingga netral. Kemudian lakukan
pemanasan campuran sampai 60°C dan titrasi dengan larutan glukosa
standar sampai warna biru hampir hilang. Tambahkan dua tetes
indikator MB. Lanjutkan titrasi sampai warna merah bata yang tidak
hilang setelah pengocokan. Catat kebutuhan titran(M)

𝑉𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑉𝑝𝑒𝑛𝑔𝑒𝑛𝑐𝑒𝑟𝑎𝑛
(𝐹 − 𝑀) ×
𝐶= 𝑉𝑡𝑖𝑡𝑟𝑎𝑠𝑖 × 𝑉𝑑𝑖𝑎𝑚𝑏𝑖𝑙 × 2,5
𝑉𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙

Glukosa standar = 2,5 gram dalam 1 liter = 2,5 mg/ml

Semua satuan volume memakai ml
Maka C (konsentrasi-glukosa) harus bersatuan mg/ml

𝐶 1000 1 𝑢𝑛𝑖𝑡
𝑎𝑘𝑡𝑖𝑣𝑖𝑡𝑎𝑠 𝑒𝑛𝑧𝑖𝑚 = × ×
𝑇 𝐵𝑀 1𝜇𝑚𝑜𝑙

Dimana :
C = konsentrasi glukosa per mL ekstrak enzim
T = waktu inkubasi (menit)
1 unit enzim = besarnya aktivitas enzim yang dibutuhkan untuk membebaskan 1
μmol glukosa per menit per ml enzim

13
 DAFTAR PUSTAKA

Aziz, Pradhana, 2008. Enzim dan Faktor-Faktor Yang Mempengaruhi Laju Kerja
Enzim. FIK Biochemical Experiment Class.

Irawati, Rosyida, 2016. Karakterisasi pH, Suhu dan Konsentrasi Substrat Pada
Enzim Selulase Kasar yang Diproduksi Oleh Bacillus circulans. FMIPA
Universitas Islam Negeri Maulana Malik Ibrahim Malang.

Karmana, Oman. 2007. Cerdas Belajar Biologi untuk Kelas XII SMA/MA Program
IPA.Bandung: Grafindo Media Pratama.

Kavitha, R., 2015. Classification and Nomenclature of Enzymes. Department of

Pharmacutics. SRM College of Pharmacy SRM University.

Korayem, 2009. Isolation of Protein.

http://www.aun.edu.eg/molecular_biology/Final%20Protein/Korayem/Kor
ayem_Lectures/02%20Protein%20Isolation.pdf. Diakses pada tanggal 30
Agustus 2018.

Putri, Yunita S., 2012. Skrining dan Uji Aktivitas Enzim Protease Bakteri dari
Limbah Rumah Pemotongan Hewan. Skripsi thesis, Universitas Airlangga.

Rauf, Mukhlis, 2011. Enzim. https://www.scribd.com/doc/51456761/ENZIM.

Diakses pada tanggal 30 Agustus 2018.

14