PEMERIKSAAN BILIRUBIN DIRECT DAN BILIRUBIN TOTAL

A. Tujuan : Untuk mengetahui kadar Bilirubin Direct (D) dan Bilirubin Total (T)
B. Metode : Jendrassik / Grof
C. Prinsip :
Bilirubin bereaksi dengan Diazotized Sulphanilic Acid (DSA) membentuk zat warna merah
azo. Absorbans zat warna ini pada 546 nm sebanding dengan konsentrasi bilirubin dalam
sampel. Glucuronides bilirubin yang larut dalam air bereaksi langsung dengan DSA yang
mana albumin yang terkonjugasi dalam bilirubin indirect hanya akan bereaksi dengan DSA,
dibantu adanya accelerator (zat pemercepat).
Bilirubin total = bilirubin direct + bilirubin indirect.
D. Reaksi : Asam sulfanilic + natrium nitrit DSA
Bilirubin +DSA DIRECT azobilirubin
Bilirubin + accelerator TOTAL azobilirubin
E. Bahan : Serum atau plasma heparin.
Hindari hemolisis. Sampel harus terlindungi dari sinar.
Stabilitas : Bilirubin stabil selama 3 hari bila disimpan terlindung dari sinar pada 2-8°C.
F. Reagen :
1. 1 x 100 ml reagen Bilirubin Total (tutup putih)
Asam sulfanilic 14 mmol/l
Asam hydroclorit 250 mmol/l
Caffeine (accelerator) 200 mmol/l
Natrium benzoate 420 mmol/l
2. 1 x 9 ml reagen T-Nitrit (tutup putih)
untuk pengukuran Bilirubin Total
Natrium nitrit 14 mmol/l
3. 1 x 100 ml reagen Bilirubin Direct (tutup merah)
Asam sulfanilic 14 mmol/l
Asam hydroclorit 250 mmol/l
4. 1 x 9 ml reagen D-Nitrit (tutup merah)
untuk pengukuran Bilirubin Direct
Natrium nitrit 0.9 mmol/l
G. Alat :
1. Micropipet
2. Tip biru dan tip kuning
3. Tabung reaksi
4. Fotometer
H. Cara Kerja :
a. Persiapan reagen dan stabilitas
1. Kedua reagen dan larutan nitrit siap pakai.
2. Stabil sampai tanggal kadaluarsa bila tidak dibuka dan disimpan pada 15-25°C.
b. Pemeriksaan
Panjang gelombang : 546 nm
Celah optik : 1 cm
Suhu : 20-25°C
Pengukuran : terhadap blanko sampel
c. Prosedur
1. Bilirubin Total
Pipet ke dalam cuvet Blanko sampel Sampel
Reagen, bilirubin total (1) 1000 µl 1000 µl
Reagen T-Nitrit - 40 µl
Campur dengan baik, inkubasi selama 5 menit.
Sampel 100 µl 100 µl
Campur, inkubasi pada suhu kamar selama 10 sampai 30 menit.
Ukur absorbans sampel terhadap blanko sampel (∆A546)

2. Bilirubin Direct
Pipet ke dalam cuvet Blanko sampel Sampel
Reagen, bilirubin direct (3) 1000 µl 1000 µl
Reagen D-Nitrit - 40 µl
Campur dengan baik, inkubasi selama 2 menit.
Sampel 100 µl 100 µl
Campur, inkubasi pada suhu kamar selama 5 menit tepat.
Ukur absorbans sampel terhadap blanko sampel (∆A546)
I. Interpretasi Hasil :
Linearitas : Pemeriksaan linear sampai 25 mg/dl. Untuk konsentrasi bilirubin melebihi 25
mg/dl, encerkan sampel 1 + 4 dengan garam fisiologis (0.9%) dan ulangi pemeriksaan.
Kalikan hasil dengan 5.
J. Perhitungan :
Hitung konsentrasi bilirubin total dan direct dengan menggunakan faktor 13.0
Konsentrasi bilirubin (mg/dl) = ∆A546 x 13.0
(mg/dl) x 17.1 = (µmol/l)
K. Nilai Rujukan :
Bilirubin total mg/dl µmol/l
Pada kelahiran, sampai 5 85.5
5 hari, sampai 12 205.0
1 bulan, sampai 1.5 25.6
Dewasa, sampai 1.1 18.8
Bilirubin direct
Dewasa, sampai 0.25 4.3