srihartini

Kamis, 21 Februari 2013

Analisis Proksimat

MELAKUKAN ANALISIS PROKSIMAT

Kompetensi ini mencakup kemampuan melakukan pengujian / prosedur secara analisis
proksimat yang diperlukan untuk menganalisisi berbagai mutu bahan/produk pangan. Analisis
Proksimat meliputi :
1. Pengujian kadar air
2. Pengujian kadar abu
3. Pengujian kadar lemak
4. Pengijian kadar protein
5. Pengujian kadar serat
6. Pengujian kadar karbohidrat
Peralatan dan fasilitas yang diperlukan :
a. Peralatan untuk penyiapan sampel meliputi :
 Mortar
 Blender
 Neraca analitik
 Alat ukur volumetric
b. Peralatan pengujian kadar air meliputi :
 Neraca analitik
 Cawan aluminium
 Oven
 Desikator
c. Peralatan pengujian kadar abu meliputi :
 Neraca analitik
 Cawan porselen
 Tanur listrik
 Desikator
d. Peralatan pengujian kadar lemak meliputi :
 Neraca analitik
 Soklet
 Kondensor
 Labu lemak
 Desikator
 Oven

e. Peralatan pengujian kadar protein meliputi :

 Neraca analitik
 Labu kjeldahl
 Alat-alat gelas (Erlenmeyer,buret, pipet volumetric, pipet tetes, labu ukur)
 Destilator
 Kondensor
 Pemanas listrik
 Destructor
f. Peralatan pengujian serat kasar meliputi :
 Neraca analitik
 Pendingin tegak
 Corong Buchner
 Pompa vakum
 Hot plate
 Erlenmeyer

1. PENGUJIAN KADAR AIR

Air bersifat tidak berwarna , tidak berasa, tidak berbau pada kondisi standar,yaitu pada tekanan

100 kPA (1 bar) dan suhu 273,15 K (0 °C). Air merupakan suatu pelarut yang penting, yang
memiliki kemampuan untuk melarutkan banyak zat kimia lainnya, seperti garam-garam, gula,

asam, beberapa jenis gas dan banyak macam molekul organic.

Table dibawah ini menunjukkan kandungan air dalam beberapa pangan :

NO PRODUK PANGAN KANDUNGAN AIR

%

1. Selada ( Lactusa sativa) 95

2. kubis 95
3. Jeruk 92
4. Sari buah apel 87
5. Susu 87
6. Kentang 78
7. Pisang 75
8. Ayam 70
9. Daging 65
10. Keju 37
11. Roti putih 35
12. Madu 20
13. Mentega dan Margarin 16
14. Tepung-tepung 14
15. Tepung gandum 12
16. Beras 12
17. Serbuk susu 4
18. Shortening 0

Penentuan kadar air tergantung dari sifat bahan. Pada umumnya mengeringkan pada suhu

105 – 110 °C selama 3 jam atau sampai didapat berat konstan dalm oven. Selisih berat sebelum

dan sesudah pengeringan adlah banyaknya uap air yang diuapkan.

 Untuk bahan tidak tahan panas seperti yang berkadar gula tinggi, minyak, daging, kecap,

dilakukan pada kondisi vacuum dengan suhu lebih rendah. Kadang – kadang peringatan di

lakukan tanpa pemanasan, bahan dimasukan kedalam ksikator dengan H2SO4 pekat sebagai

pengering hingga didapat berat konstan.

Bahan dengan kadar air tinggi dan mengandung senyawa yang mudah menguap (seperti

susu, sayuran) penentuannya dengan cara destilasi dengan pelarut tertentu misalnya toluene, xilol

dan heptana yang berat jenisnya rendah. Contoh dimasukkan kedalam tabung bola kemudian

dipanaskan. Air dan pelarut menguap, di embunkan dan jatuh pada tabung Aufhuser yang

berskala. Air yang mempunyai berat jenis tinggi berada dibawah sehingga dapat dibaca pada

skala tabung Aufhuser tersebut.

Untuk bahan dengan kadar gula tinggi, kadar airnya dapat diukur dengan menggunakan

refraktometer disamping menentukan padatan terlarutnya pula. Dalam hal ini air dan gula

dianggap sebagai komponen – komponennya yang mempengaruhi indeks refraksi.

1. Penentuan kadar air cara pengeringan ( termogravimetri )

Prinsipnya menguapkan air yang ada dalam bahan dalam cara pemanasan. Bahan di timbang

hingga berat konstan yang dapat diartikan semua air sudah teruapkan. Cara ini relativ mudah dan

murah.
 Penguapan dapat dipercepat dan reaksi yang menyebabkan terbentuknya air atau reaksi lain

dapat di cegah dengan melakukan pemanasan pada suhu rendah dan tekanan vakum. Bahan –

bahan yang mempunyai kadar gula tinggi akan mengalami pengerakan pada permukaan bahan

bila dipanaskan pada suhu ± 100°C.

Suatu bahan yang telah mengalami pengeringan akan bersifat lebih higroskopis dari pada bahan

asalnya. Selama pendinginan sebelum penimbangan,bahan harus slalu di tempatkan dalam ruang

tertutup kering misalnya eksikator atau desikator yang telah diberi zat penyerap air. Penyerap air

atau uap air yang dapat digunakan antara lain kapur aktif, silika gel, asam sulfat, aluminium

oksida, kalium klorida, kalium hidroksida, kalium sulfat atau barium sulfat. Silika gel lebih

sering digunakan karena memberikan perubahan warna saat jenuh dengan air / uap air.

2. Penentuan kadar air cara destilasi ( thermovolumetri )

Prinsip penentuan kadar air dengan cara destilasi adalah menguapkan air dengan „pembawa‟

cairan kimia yang mempunyai titik didih yang lebih tinggi dari pada air tetapi tidak bercampur

dengan air serta mempunyai berat jenis lebih rendah dari pada air. Zat kimia yang sering

digunakan anatara lain toluene, xylem, benzene, tetrakloroetilen dan xylol.

Cara ini baik untuk menentukan kadar air dalam zat yang mempunyai kadar air kecil sehingga

sulit ditentukan secara termogravimetri. Oksidasi senyawa lipid atau dekomposisi senyawaan

gula dapat di hindari dengan cara ini.

3. Penentuan kadar air cara kimiawi

 Penentuan kadar air di tentukan dengan titrasi Karl Fisher yaitu menitrasi sampel dengan larutan

iodin dalam methanol, cara kalsium karbid yang didasarkan pada reaksi antara kalsium karbid

dan air yang menghasilkan gas asetilen

4. Penentuan kadar air dengan metode fisis

Penentuan kadar air dengan cara ini ditentukan dengan nerdasarkan tetapan dielektrikum,

konduktifitas listrik ( daya hantar listrik ) dan resonansi nuklir magnetic ( NMR )

LEMBAR KERJA I
A. ANALISIS KADAR AIR DENGAN METODE OVEN
Metode : Metode Oven. SNI 01 – 2891 – 1992 butir 5.1, cara uji makanan
dan
Minuman
Prinsip : Kehilangan bobot pada pemanasan 105°C dianggap sebagai
kadar
Air yang terdapat pada sampel
Alat : 1. Neraca analitik
2. Botol timbang
3. Spatula
4. Oven
5. Desikator
6. krustang
Bahan : 1. Sampel bakso daging

Cara Kerja :
1. Panaskan botol timbang pada oven pada suhu 105°C selama 1 jam
2. Dinginkan dalam desikator selama ½ jam
3. Timbang dan catat bobotnya
4. Ulangi sampai diperoleh bobot konstan
5. Timbang contoh sampel bakso daging sebanyak 1 – 2 gram pada botol timbang tertutup yang
telah didapat bobot konstannya
6. Panaskan dalam oven pada suhu 105°C selama 3 jam
7. Dinginkan dalam desikator selama ½ jam
8. Timbang botol timbang yang berisi contoh tersebut
9. Ulangi pemanasan dan penimbangan hingga diperoleh bobot konstan

Perhitungan :

( Wo + Ws) - Wi
% Air = X 100
Ws

Wo = berat botol timbang kosong (gram)

Wi = berat botol timbang + sampel setelah pengeringan (gram)
Ws = berat sampel

Table data
Kode Wo Ws Wi % Air Rata-Rata

B. Analisis Kadar Air dengan Metode Destilasi

Metode : Metode destilasi. SNI 01 – 2891 – 1992 butir 5.2, Cara Uji
Makanan dan minuman
Prinsip : Pemisahan azeotropik air dengan pelarut organic
Alat : 1. Neraca analitik
 2. Labu didih 500 mL
3. Alat Aufhauser
4. Pemanas listrik
Bahan : 1. Sampel
2. Xylol atau toluene

Cara Kerja :
 Timbang dengan seksama 5 – 10 gram sampel, masukkan kedalam labu didih dan tambahkan
300 mL xylol serta batu didih
 Sambungkan dengan alat aufhauser dan panaskan diatas pemanas listrik selama 1 jam dihitung
sejak mulai mendidih. Setelah 1 jam matikan pemanas listrik dan biarkan alat aufhauser
mendingin
 Bilas alat pendingin dengan xylol murni atau toluene
 Baca volume air

Perhitungan
V
% Air = X 100
W
W = berat contoh (gram)
V = volume air yang dibaca pada alat aufhauser (mL)

Table data
Kode W V % Air Rata-rata

2. ANALISIS KADAR SERAT

Istilah serat makanan (dietary fiber) harus dibedakan dengan istilah serat kasar (crude fiber) yang

biasa digunakan dalam analisa proksimat bahan pangan. Serat kasar adalah bagian dari pangan
 yang tidak dapat dihidrolisis oleh bahan-bahan kimia yamg digunakan untuk menentukan kadar

serat kasar yaitu asam sulfat (H2SO4 1,25 %) dan Natrium Hidroksida (NaOH 3.25%).sedangkan

serat makanan adalah bagian dari pangan yang tidak dapat dihidrolisis oleh enzim-enzim

pencernaan.

Serat yang tidak larut dalam air ada 3 macam yaitu sellulosa, hemiselulosa, dan lignin.

Sedangkan serat yang larut dalam air antara lain pectin, musilase, dan lignin. Ada beberapa

metode analisis serat yaitu :

1. Metode crude fiber

2. Metode deterjen

3. Metode enzimatis

Metode analisis dengan menggunakan deterjen (acid deterjen fiber,ADF,atau neutral deterjen

fiber, NDF) merupakan metode gravimetri yang hanya dapat mengukur komponen serat yang

tidak larut .

PENENTUAN SERAT KASAR

Didalam analisa penentuan serat kasar diperhitungkan banyaknya zat-zat yang tidak larut dalam

asam encer atau basa encer dengan kondisi tertentu. Langkah-langkah dalam analisa :

 Deffating yaitu menghilangkan lemak yang terkandung dalam sampel menggunakan pelarut

lemak

 Digestion terdiri dari dua tahap yaitu pelarutan dengan asam dan pelarutan dengan basa. Kedua

macam proses digesti ini dilakukan dalam keadaan tertutup pada suhu terkontrol (mendidih) dan

sedapat mungkin dihilangkan dari pengaruh luar.penyaringan harus segera dilakukan setelah

digestion selesai,karena penundaan penyaringan dapt mengakibatkan rendahnya hasil analisa

karena terjadi perusakan serat lebih lanjut oleh bahan kimia yang dipakai. Untuk bahan yang
banyak mengandung protein sering mengalami kesulitan dalam penyaringan , maka sebaiknya

dilakukan digesti pendahuluan dengan menggunakan enzim proteolitik. Residu yang diperoleh

dalam pelarutan menggunakan asam dan basa merupakanserat kasar yang mengandung ± 97 %

selulosa dan lignin. Serat kasar sangat penting dalam penilaian kualitas bahan makanan karena

angka ini merupakan indeks dan menentukan nilai gizi bahan makanan. Selain itu kandungan

serta kasar dapat digunakan untuk mengevaluasi suatu proses pengolahan,misalnya proses

penggilingan atau proses pemisahan antara kulit dan kotiledon dengan demikian persentase serat

kasar dapat dipakai untuk menentukan kemurnian bahan atau efisiensi suatu proses.

LEMBAR KERJA II
PENENTUAN SERAT KASAR
Metode : SNI 01-2891 – 1992 butir 7.1, Cara uji makanan dan minuman
Prinsip : Ekstraksi contoh dengan asam dan basa untuk memisahkan serat
Kasar dan bahan lainnya
Alat : 1. Neraca analitik
2. spatula
3. Labu ukur 100 mL
4. Corong Buchner
5. Pipet tetes
6. Gelas ukur
7. Erlenmeyer
8. Kondensor
9. Oven
10. Hotplate
 11. Pompa vakum
12. Desikator
Bahan : 1. H2SO4 1,25 %
2. NaOH 3,25 %
3. kertas saring Whatman
4. Aquadest
5. Etanol 96 %

Cara Kerja :

1. Timbang dengan seksama 2-4 gram cuplikan, bebaskan lemaknya dengan cara ekstraksi dengan

cara soxlet atau dengan cara mengaduk,mengenaptuangkan contoh dalam pelarut organic

sebanyak 3 kali. Keringkan contoh dan masukkan ke dalam Erlenmeyer 500 mL.

2. Tambahkan 50 mL larutan H2SO4 1,25 %, kemudian didihkan selama 30 menit dengan

menggunakan pendingin tegak.

3. Tambahkan 50 mL NaOH 3,25 % dan didihkan lagi selama 30 menit

4. Dalam keadaan panas saring dengan corong Buchner yang berisi kertas saring tak berabu

Whatman 54, 41, atau 541 yang telah dikeringkan dan diketahui bobotnya.

5. Cuci endapan yang terdapat pada kertas saring berturut-turut dengan H2SO4 1,25 % panas, air

panas dan etanol 96 %

6. Angkat kertas saring beserta isinya, masukkan kedalam kotak timbang yang telah diketahui

bobotnya, keringkan pada suhu 105°C dinginkan dan timbang sampai bobot tetap.

7. Bila ternyata serat kasar lebih besar 1 % , abukan kertas saring beserta isinya, timbang sampai

bobot tetap.

Berat residu = berat serat kasar

 Wi - Wo
% Serat kasar = X 100 %
Ws
Wo : berat kertas saring
Wi : berat kertas saring + residu setelah dikeringkan
Ws : berat contoh

Table pengamatan
Kode Wo Ws Wi % protein Rata-rata

3 ANALISIS KADAR LEMAK

Lemak dan minyak merupakan salh satu kelompok yang ternasuk golongan lipida.sifat

yang khas dan mencirikan golongan lipida adalah daya larutnya dalam pelarut organic

(ether,benzene,kloroform)atau sebaliknya ketidaklarutannya dalam pelarut air.

Analisa lemak dan minyak lebih mudah dianalisa karena molekul lemak dan lemak relative lebih

kecil dan kurang kompleks dibandingkan dengan molekul karbohidrat dan protein.

Analisa lemak dan minyak umum yang dilakukan pada bahan makanan digolongkan

dalam 3 kelompok tujuan :

1. Penentuan kadar lemak atau minyak yang terdapat pada bahan makanan atau pertanian.

2. Penentuan kualitas minyak murni sebagai bahan makanan yang berkaitan dengan proses

ekstraksinya atau ada tidaknya pemurnian lanjutan seperti penjernihan (refining), penghilangan

bau (deodorizing), penghilangan warna (bleaching) dan lain-lain.

3. Penentuan sifat fisis atau kimia khas yang mencirikan sifat minyak tertentu.

Ekstraksi merupakan salah satu cara untuk menentukan kadar lemak dalam suatu bahan. Sebagai

senyawa hidrokarbon lemak dan minyak pada umumnya tidak larut dalam air tetapi larut dalam

pelarut organic.pelarut yang umum digunakan untuk ekstraksi lemak adalah heksan, ether dan

klroroform

Berikut ini contoh beberapa jenis bahan pelarut yang sesuai untuk ekstraksi lemak yaitu :

a. Senyawa trigliserida yang bersifat nonpolar akan mudah diekstraksi dengan pelarut nonpolar

misalnya heksan atau petroleum eter.

b. Glikolipida yang polar akan mudah diekstraksi dengan alcohol yang polar.

c. Lesitin akan mudah larut dalam pelarut yang sedikit asam misalnya alcohol.

d. Fospolipida yang bersifat polar dan asam akan mudah larut dalam kloroform yang sedikit polar

dan basa. Senyawa ini tidak larut dalam alcohol.

Petoleum ether atau heksan adalah bahan pelarut lemak nonpolar yang paling banyak digunakan

karena harganya relative murah, kurang berbahaya terhadap kebakaran dan ledakan serta lebih

selektif untuk lemak nonpolar.

Ada 2 cara penentuan kadar lemak berdasarkan jenis bahan yang akan ditentukan :

1. Bahan Kering

Untuk penentuan lemak dari bahan kering, bahan dibungkus atau ditempatkan dalam thimble lalu

dikeringkan dalam oven untuk menghilangkan airnya. Pemanasan dilakukan secepatnya dan

dihindari suhu yang terlalu tinggi. Ekstraksi lemak dari bahan kering dapat dilakukan secara

terputus-putus atau berkesinambungan. Ekstraksi secara terputus dilakukan dengan soklet atau
 alat ekstraksi ASTM (American society testing material ). Sedangkan secara berkesinambungan

dengan alat goldfisch atau ASTM yang telah dimodifikasi.

2. Bahan Cair

Penentuan lemak dari bahan cair dapat menggunakan botol Babcock atau dengan Mojonnier

LEMBAR KERJA III

I. Analisis Lemak dengan Metode Ekstraksi Langsung
Prinsip : Ekstraksi lemak bebas dengan pelarut non polar
Alat : 1. Kertas saring
2. Labu lemak
3. Alat soxlet
4. Pemanas listrik
5. Oven
6. Neraca analitk
7. Kapas bebas lemak
 8. Kaca arloji
9. Krustang

Bahan : n-Heksana (C6H14)

Cara Kerja :

1. Timbang dengan seksama 1-2 gram sampel masukkan kedalam selongsong kertas yang dilapisi

kapas

2. Sumbat selongsong kertas berisi contoh tersebut dengan kapas

3. Keringkan pada oven pada suhu 80°C selama kurang lebih 1 jam, kemudian masukkan kedalam

alat soxlet yang dihubungkan dengan labu lemak yang telah dikeringkan dan diketahui

bobotnya.(timbang labu sebelum dipakai)

4. Ekstrak dengan heksana atau pelarut lemak lainnya selama lebih kurang 6 jam

5. Suling heksana (1 ½ kali dari isi tabung soxlet) dan keringkan ekstrak lemak dalam oven

pengering pada suhu 105 °C

6. Dinginkan dalam desikator dan timbang

7. Ulangi hingga tercapai berat konstan.

Table data
NO Wo Ws Wi % lemak Rata-rata

Perhitungan :
Wi – Wo
Kadar lemak = X 100 %
 Ws

Ws = bobot contoh (gram) (sebelum dikeringkan )

Wi = bobot labu + lemak setelah diekstraksi (gram )
Wo = bobot labu lemak sebelum ekstraksi (gram)

II. Analisa Lemak dengan Metode Weibull

Prinsip : Ekstraksi lemak dengan pelarut non polar setelah contoh dihidrolisis dalam suasana
Asam untuk membebaskan lemak yang terikat
Alat : 1. Kertas saring
2. Labu lemak
3. Alat soxlet
4. Pemanas listrik
5. Oven
6. Neraca analitik
7. Kapas bebas lemak
8. Gelas piala

Bahan : 1. n-heksana
2. HCl 25%

Cara Kerja :
1. Timbang dengan seksama 1-2 gram contoh kedalam gelass piala.
2. Tambahkan 30 mL HCl 25%dan 20 mL air serta beberapa batu didih.
3. Tutup gelas piala dengan kaca arloji dan didihkan selama 15 menit.
4. Saring dalam keadaan panas dan cuci dengan air panas hingga tidak bereaksi asam lagi,cek
dengan lakmus,bila asam kertas saring berwarna hitam, maka terus tambah air panas.
5. Keringkan kertas saring beserta isinya pada suhu 100-105°C.
6. Masukkan kedalam selongsong kertas yang dialasi kapas.
7. Masukkan kedalam alat soxlet yang dihubungkan dengan labu lemak yang telah dikeringkan dan
diketahui bobotnya.
8. Ekstrak dengan heksana atau pelarut lemak dalam oven pengering pada suhu 105°C
9. Dinginkan dalam eksikator dan timbang
10. Ulangi hingga tercapai konstan

Table Data
NO Wo Ws Wi % lemak Rata-rata

Perhitungan :

Wi – Wo
Kadar lemak = X 100%
Ws
Ws = Bobot contoh (gram)
Wi = Bobot labu + lemak setelah ekstraksi (gram)
Wo = Bobot labu lemak sebelum ekstraksi (gram)

4. ANALISIS KADAR ABU

Abu adalah zat organic sisa hasil pembakaran suatu bahan organic. Kandungan abu dan

komposisinya tergantung pada macam bahan dan cara pengabuannya. Beberapa sampel kadar

abu dalam bebrapa bahan dapat dilihat pada table berikut :

 NO BAHAN ABU (%)
1. Susu 0,5 – 1,0
2. Susu kering tidak berlemak 1,5
3. Buah-buahan segar 0,2 – 0,8
4. Buah-buahan yang dikeringkan 3,5
5. Biji kacang-kacangan 1,5 – 2,5
6. Daging segar 1
7. Daging yang dikeringkan 12
8. Daging ikan segar 1-2
9. Sayur -sayuran 1

Kadar abu berhubungan erat dengan mineral suatu bahan. Mineral dalam suatu bahan ada ada

dua macam garam yaiti garam organic dan garam anorganik. Garam organic seperti garam-

garam asam malat, oksalat, asetat, pektat. Sedangkan garam anorganik yaitu garam fosfat,

karbonat, klorida, sulfat dan nitrat.

Komponen mineral suatu bahan sangat bervariasi baik macam dan jumlahnya. Sebagi

gambaran dapat dikemukakan beberapa sampel sebagai berikut :

a. Kalsium (CA)
Kalsium relative tinggi pada susu dan hasil olahannya, serellia,kacang-kacangan, telur, ikan, dan
buah-buahan. Sebaliknya bahan yang kandungan kalsiumnya sedikit adalh gula, pati dan minyak.
b. Fosfor (P)
Bahan yang paling banyak mengandung fosfor adalah susu dan olahannya, daging, ikan, daging
unggas, telur dan kacang-kacangan.
c. Besi (Fe)
Bahan yang kaya mineral besi adalah tepung gandum, daging unggas, ikan, seafood, telur.
Sedangkan makanan yang mengandung besi adalah susu dan olahannya, buah-buahan dan sayur-
sayuran.
d. Natrium (Na)
 Bahan yang banyak mengandung natrium adalah garam yang banyak digunakan sebagai
ingredient (bumbu), salted food.
e. Kalium (K)
Bahan yang banyak mengandung mineral kalium ialah susu dan hasil olahannya, buah-buahan,
serelia, daging, ikan, unggas, telur, dan sayur-sayuran.
f. Magnesium (Mg)
Bahan yang mengandung Magnesium adalah kacang-kacangan, serelia, sayuran, buah-buahan
dan daging.
g. Belerang (S)
Belerang banyak terdapat dalam bahan yang kaya akan protein seperti susu, daging, kacang-
kacangan, telur.
h. Kobalt (Co)
Bahan yang kaya mineral kobalt adalah sayur-sayuran dan buah-buahan.
i. Seng (Zn)
Bahan makanan hasil laut (seafood), merupakan bahan yang banyak mengandung unsure seng.

a. Analisis kadar Abu

Penentuan konsitituen mineral adalah bahan hasil pertanian dibedakan menjadi dua tahapan yaitu
:
1. Penentuan abu (total larut dan tidak larut)
2. Penentuan individu komponen

1. Penentuan Kadar Abu Secara Langsung (cara kering)

Penentuan kadar abu secara langsung (cara kering) adalah dengan mengoksidasikan semua zat

organic pada suhu yang tinggi, yaitu sekitar 500 – 600 °C dan kemudian melakukan

penimbangan zat yang tertinggal setelah proses pembakaran tersebut. Sampel yang akan

diabukan ditimbang sejumlah tertentu tergantung macam bahannya. Beberapa sampel bahan dan

jumlah berat yang diperlukan dapat dilihat pada table berikut :

 Bahan Berat Bahan (gr)
Ikan dan hasil olahannya,biji-bijian dan makanan ternak 2
Padi-padian, susu, dan keju 3-5
Gula, daging dan sayuran 5 - 10
Jelly, sirup, jam dan buah kering 10
Juice, buah segar, buah kalengan 25
anggur 50

2. Penentuan Kadar Abu Secara Tidak Langsung (cara basah)

Pengabuan basah terutama digunakan untuk digesti sampel dalam usaha penentuan elemen runut

(trace elemen) dan logam-logam beracun. berbagai cara yang ditempuh untuk memperbaiki cara

kering yang biasanya memerlukan waktu yang lama serta adanya kehilangan karena pemakaian

suhu tinggi yaitu antara lain dengan pengabuan cara basah. Pengabuan cara basah ini prinsipnya

adalah memberikan pereaksi kimia tertentu kedalam bahan sebelum dilakukan pengabuan.

Berbagai bahan kimia yang sering digunakan untuk pengabuan basah ini dapat disebutkan

sebagai berikut :

a. Asam sulfat dapat membantu mempercepat terjadinya reaksi oksidasi.

b. Campuran asam sulfat dan kalium sulfat dapat digunakan untuk mempercepatb dekomposisi

sampel. Kalium sulfat dapat menaikkan titik didih asam sulfat sehingga suhu pengabuan menjadi

tinggi dan proses pengabuan dapat dipercepat.

c. Campuran asam sulfat dan asam nitrat dapat mempercepat pengabuan, kedua asam merupakan

oksidator kuat yang dapat menurunkan suhu digesti bahan pada kisaran 350°Csehingga

komponen yang menguap dan terdekomposisi pada suhu tinggi dapat dipertahankan dalam abu.

d. Asam perklorat dan asam nitrat dapat digunakan untuk bahan yang sangat sulit mengalami

oksidasi. Penambahan perklorat sebagi oksidator dapat mempercepat pengabuan, namun

 perklorat sebagai bahan yang bersifat explosive cukup berbahaya. Penambahan asam nitrat dan

perklorat membutuhkan waktu relative singkat untuk pengabuan yaitu 10 menit.

Sebagaimana cara kering, setelah pengabuan selesai, bahan diambil dari muffle (tanur) lalu

dimasukkan dalam oven bersuhu 105°C sekitar 15 – 30 menit selanjutnya masukkan kedalam

eksikator sampai dingin kemudian dilakukan penimbangan. Apengabuan diulangi lagi sampai

diperoleh berat abu yang konstan. Perbedaan pengabuan cara kering dan basah

 Cara kering digunakan untuk penentuan total abu dalam suatu bahan makanan dan hasil

pertanian, sedangkan cara basah untuk elemen runut (trace elemen)

 Cara kering untuk penentuan abu yang larut dan tidak larut dalam air serta abu yang tidak larut

dalam air serta abu yang tidak larut dalam asam memerlukan waktu yang relative lama

sedangkan cara basah memerlukan waktu yang cepat.

 Cara kering memerlukan waktu yang relative tinggi, sedangkan cara basah dengan suhu relative

rendah.

 Cara kering digunakan untuk sampel yang relative banyak, sedangkan cara basah sebaiknya

untuk sampel yang sedikitdan memerlukan pereaksi yang agak berbahaya.

 LEMBAR KERJA IV

A. PENENTUAN KADAR ABU TOTAL

Metode : SNI 01 – 2891 – 1992 butir 6.1. Cara uji makanan dan minuman

Prinsip : Pada proses pengabuan zat-zat organic diuraikan menjadi air

dan

CO2 tetapi bahan organic tidak

Alat : 1. Neraca Analitik

2. Cawan porselen

3. Spatula

4. Kawat kasa

5. Kaki tiga

6. Lampu spiritus

7. Krustang

8. Muffle/tanur

9. Eksikator

Bahan : 1. Sampel

Langkah Kerja

 Timbang dengan seksama 2 -3 gram sampel kedalam sebuah cawan porselen atau (platina) yang

telah diketahui bobotnya. Untuk sampel cairan, uapkan terlebih dahulu diatas penangas air

sampai kering.
 Arangkan diatas nyala pembakar, lalu abukan dalam tanur listrikpada suhu maksimum 550°C

sampai pengabuan sempurna (sekali-kali pintu tanur dibuka sedikit,agar oksigen bisa masuk)

 Dinginkan dalam eksikator,lalu timbang sampai bobot tetap

Perhitngan
W1 – W2
% Abu = X 100 %
W

W = bobot sampel sebelum diabukan (gram)

W1 = bobot sampel + cawan sesudah diabukan (gram)

W2 = bobot cawan kosong

Table Pengamatan

Kode W W1 W2 % abu Rata-rata

B. PENENTUAN KADAR ABU SULFAT

Metode : SNI 01- 2891 – 1992 butir 6.2 cara uji makanan dan minuman

Prinsip : Pengukuran abu yang diendapkan sebagai sulfat

Alat : 1. Neraca analitik

2. Cawan porselen

3. Spatula

4. Kawat kasa
 5. Kaki tiga

6. Lampu spiritus

7. Krustang

8. Muffle/tanur

9. Eksikator

10. Pipet tetes

Bahan : 1. Sampel

2. H2SO4 pekat

Langkah Kerja

 Larutkan abu bekas penentuan kadar abu dengan penambahan 25 mL HCl 10 %

 Didihkan selama 5 menit

 Saring larutan dengan menggunakan kertas saring bebas abu dan cuci dengan aquadest sampai

Bebas klorida

 Keringkan kertas saring dalam oven

 Masukkan kedalam cawan porselen (platina) yang telah diketahui bobotnya dan abukan.

 Dinginkan dalam eksikator,lalu timbang sampai bobot tetap

Perhitungan :

W1- W2

% Abu = X 100 %

W = bobot sampel sebelum diabukan (gram)

W1 = bobot sampel + cawan sesudah diabukan (gram)

W2 = bobot cawan kosong (gram)

Table Pengamatan
Kode W W1 W2 % Abu Rata-rata
5. ANALISIS KADAR PROTEIN
Protein dalam bahan biologi biasanya terdapat dalam bentuk ikatan fisis yang
renggang atau dengan ikatan kimia yang lebih erat dengan karbohidrat atau lemak. Dengan
adanya pemanasan protein dalam bahan makanan akan mengalami perubahan dan membentuk
persenyawaan dengan bahan lain. Pemanasan atau perlakuan yang lebih dapat merusak protein
sehingga mengubah nilai gizi. Analisa protein bertujuan menera jumlah kandungan protein
dalam bahan makanan secara empiris (tidak langsung) yaitu melalui kandungan N yang ada
dalam bahan, serta penentuan secara absolut (langsung) dengan pemisahan,pemurnian atau
penimbangan protein. Namun penentuan secara langsung sangat sukar serta membutuhkan waktu
yang lama,ketrampilan tinggi dan biaya yang mahal namun dapat memberikan hasil yang lebih
tepat.
Penentuan jumlah protein secara empiris yang umum dilakukan adalah dengan
menentukan jumlah Nitrogen (N) yang dikandung bahan makanan,cara ini dikembangkan oleh
Kjeldahl ilmuwan Denmark tahun 1883.
Dalam penentuan protein,seharusnya hanya nitrogen yang berasal dari protein saja
yang ditentukan. Tetapi secara teknis sulit dilakukan karena jumlah kandungan senyawa lain
selain protein dalam bahan biasanya sangat sedikit,sehinggapenentuan jumlah N total tetap
dilakukan untuk mewakili jumlah protein yang ada. Penentuan secara Kjeldahl ini sering disebut
kadar protein kasar (crude protein).
Dasar perhitungan protein menurut Kjedahladalah hasil penelitian dan

pengamatanyang menyatakan bahwa umumnya protein alamiah mengandung unsure N rata-rata

16 % (dalam protein murni). Apabila jumlah unsure N diketahui dengan berbagai cara maka

jumlah protein dapat diperhitungkan dengan

Jumlah N x 100/16 atau

 Jumlah N x 6,25

Untuk campuran senyawa-senyawa protein yang belum diketahui komposisi unsure penyusunnya

secara pasti, maka factor perkalian 6,25 inilah yang dipakai. Sedangkan untuk protein tertentu

yang telah diketahui komposisinya dengan tepat maka perkalian factor yang lebih tepat yang

dipakai . contoh

 5,70 untuk protein gandum

 6,38 untuk protein susu

 5,55 untuk gelatin (protein terlarut)

Penentuan protein berdasarkan jumlah N menunjukkan protein kasar karena selain protein juga

terikut senyawa N yang bukan protein misalnya urea, nitrit, asam amino, amida, purin dan

pirimidin.

Analisa protein cara Kjeldahl dibagi menjadi 3 tahap yaitu Destruksi, Destilasi, dan

Titrasi :

 Sampel didestruksi dengan adanya asam kuat dengan bantuan katalis yang akan mengubah

nitrogen amin menjadi ion ammonium.

 Ion ammonium diubah menjadi gas ammonium yang selanjutnya dipanaskan dan didestilasi.Gas

ammonium yang telah ditampung dalam larutan penampung yang larut kembali menjadi ion

ammonium.

 Sejumlah ammonia yang telah ditampung ditentuka melalui titrasi dengan larutan baku dan

selanjutnya dibuat perhitungan

1. Tahap Destruksi

Sampel dipanaskan dalam asam sulfat pekat sehingga terjadi destruksi menjadi unsure-unsurnya.

Elemen karbon dan hydrogen teroksidasi menjadi CO, CO2, dan HgO. sedangkan nitrogen (N)

dalam sampel akan diubah menjadi (NH4)2SO4. Untuk mendestruksi 1 gram protein diperlukan 9

gram asam sulfat, sedangkan untuk 1 gram lemak diperlukan 17,8 gram asam sulfat. Untuk

mempercepat proses destruksi sering ditambahkan katalisator berupa campuran Na2SO4 dan H2O

(20 :1). Gunning menganjurkan penggunaan K2SO4 atau CuSO4 dapat mempercepat proses

destruksi. Tiap 1 gram K2SO4 dapat menaikkan titik didih 3°C. suhu destruksi 370 - 410°.

2. Tahaap Destilasi

Dalam tahap destilasi , ammonium sulfat yang larut dalam air diubah menjadi ammonia

(NH3)yang berbentuk gas dengan penambahan NaOH sampai alkalis (pH dinaikkan) dan

dipanaskan.

Asam standar yang dapat dipakai adalah asam klorida atau asam borat 4 % dalam jumlah yang

berlebihan.

 Apabila asam klorida sebagai penangkap ammonia maka reaksi yang terjadi selama destilasi
adalah sebagai berikut
NH3 + HCl NH4Cl
 Apabila asam borat sebagai penangkap ammonia maka reaksi yang terjadi selama destilasi
adalah sebagai berikut :
NH3 + HBO2 NH4BO2
3. Tahap Titrasi

 Apabila penampung destilat digunakan asam klorida maka sisa asam klorida yang tidak

bereaksi dengan ammonia dititrasi dengan NaOH standar (0,1). Akhir titrasi ditandai dengan

tepat perubahan warna larutan menjadi merah muda dan tidak hilang selama 30 detik bila
 menggunakan indicator fenolftalein. Selisih jumlah titrasi blanko dan sampel merupakan jumlah

ekivalen nitrogen.

HCl + NaOH NaCl + H2O

mL NaOH (blanko – sampel)

%N = x N. NaOH x 14,008 x 100%
Berat sampel (g) x 1000

 Apabila penampung destilasi digunakan asam borat maka banyaknya asam borat yang bereaksi

dengan ammonia dapat diketahui dengan titrasi menggunakan asam klorida 0,1 N dengan

indicator campuran (brom kresol hijau dan metal merah). Akhir dari titrasi ditandai dengan

perubahan warna biru menjadi merah muda. Selisih jumlah titrasi sampel dan blanko merupakan

jumlah ekivalen nitrogen.

NH4BO2 + HCl NH4Cl + HBO2

mL HCl ( sampel – blanko)

%N = x N. HCl x 14.008 x 100%
Berat sampel (g) x 1000

Setelah diperoleh %N selanjutnya dihitung kadar proteinnya dengan mengalikan suatu

factor. Besa r perkalian N menjadi protein tergantung pada persentase N yang menyusun

proteindalam suatu bahan. Besarnya factor perkalian untuk beberapa bahan disajikan dalam table

berikut :

Tabel factor konversi N beberapa bahan pangan

 Bahan Faktor Konversi
Bir, sirup, biji-bijian, ragi 6,25
Buah-buahan, the, anggur,malt 6,25
Makanan ternak 6,25
beras 5,95
Roti,gandum,macaroni,mie 5,70
Kacang tanah 5,46
kedele 5,75
kenari 5,18
susu 6,38
gelatin 5,55

LEMBAR KERJA V
PENENTUAN N TOTAL DENGAN METODE SEMIMIKRO KJELDAHL
Metode : Semimikro Kjeldahl. SNI 01- 2891- 1992 butir 7 Cara uji makanan
dan
Minuman
Prinsip : Senyawa Nitrogen diubah menjadi ammonium sulfat oleh H2SO4
pekat
 Amonium su;fat yang terbentuk diuraikan dengan NaOH. Amoniak yang
Dibebaskan diikat dengan asam borat kemudian dititer dengan larutan baku
Asam.

Alat : 1. Neraca Analitik

2. Spatula
3. Labu Kjeldahl
4, Digestor
5. Labu ukur 100 mL
6. Corong saring
7. Pipet tetes
8. Pipet volum 5 mL
9. Erlenmeyer
10.Alat Destilasi
11. Buret
12. Pipet ukur 25 mL
13. pipet ukur 10 mL

Bahan : 1. Selenium campuran

2. asam sulfat pekat
3. Brom kresol hijau
4. Metil merah
5. Indikator fenolftalein
6. NaOH 30 %
7. Asam Borat 2 %
8. HCl 0,01 N
9. Aquadest
Langkah Kerja
1. Timbang dengan seksama 0,51 gram sampel, masukkan kedalam labu kjeldahl 100 mL
2. Tambahkan 2 gram campuran selenium dan 25 mL H2SO4 pekat
3. Panaskan diatas penangas listrik atau api pembakar sampai mendidih dan larutan menjadi jernih
kehijauan ( ± 2 jam )
4. Biarkan dingin, kemudian encerkan dan masukkan kedalam labu ukur 100 mL. tera sampai batas
5. Pipet 5 mL larutan dan masukkan kedalam alat penyulingan, tambahkan 5 mL NaOH 30 % dan
beberapa tetes indicator fenolftalein.
6. Suling selam lebih kurang 10 menit, sebagai penampung gunakan 10 mL asam borat 2 % yang
telah dicampur indicator campuran.
7. Bilas ujung pendingin dengan aquadest
8. Titer dengan HCl 0,01 N
9. Kerjakan penetapan Blanko

Perhitungan :
( V1 – V2) x N HCl x 0,014 x fk x fp x 100
Kadar Protein =
W

V1 = volume titrasi sampel

V2 = volume titrasi blanko
N HCl = volume HCl yang telah distandarisai
fk = factor konversi
fp = factor pengenceran
W = berat sampel

Table Pengamatan
Kode W V1 V2 N HCl fk fp % Protein Rata-rata

LEMBAR KERJA VI
 Penentuan N Total dengan Metode Gunning

Metode : Gunning
Prinsip : Senyawa Nitrogen diubah menjadi Amonium Sulfat oleh H2SO4 pekat.
Ammonium sulfat yang terbentuk diuraikan dengan NaOH. Amoniak yang
Dibebaskan diikat dengan asam klorida dan kemudian dititer dengan larutan baku
NaOH.

Alat : 1. Neraca analitik

2. SpatulaS
3. Labu Kjeldahl
4. Digestor
5. Pipet tetes
6. Pipet Volume 5 mL
7. Erlenmeyer
8. Alat destilasi
9. Buret
10. Pipet Ukur 25 mL
11. Pipet ukur 10 mL

Bahan : 1. K2S
2. Na2SO4 anhidrat
3. Asam sulfat pekat
4. CuSO4
5. Fenolftalein
6. NaOH 45 %
7. Zn
8. NaOH 0,1 N
9. HCl 0,1 N
10. Aquadest
Langkah Kerja

 Timbang 0,7 – 3,5 gram cuplikan, masukkan kedalam labu Kjeldahl 100 mL.

 Tambahkan 10 gram K2S atau Na2SO4 anhidrat dan 15 – 25 mL H2SO4 pekat. Bila destruksi

sukar dilakukan tambahkan 0,1 – 0,3 gram CuSO4 dan digojok.

 Panaskan diatas penangas listrik atau api pembakar mula-mula dengan api kecil dan setelah asap

hilang, api dibesarkan sampai mendidih dan larutan menjadi jernih kehijauan (± 2 jam)

 Biarkan dingin , kemudian encerkan dan tambahkan 200 mL aquadest dan 1 gram Zn serta larutan

NaOH 45 % sampai cairan bersifat basa.

 Destilasi sampai semua amoniak menguap. Destilat ditampung dalam Erlenmeyer yang berisi 100

mL HCl 0,1 N yang telah diberi beberapa tetes indicator fenolftalein 1 %. Destialsi berakhir

setelah volume mencapai 150 mL atau tidak lagi bersifat basa.

 Kelebihan HCl 0,1 N dalam destilat dititrasi dengan larutan baku NaOH 0,1 N.

 Kerjakan penetapan Blanko.

Perhitungan :

(V2 – V1) x N NaOH x 14,008 x fk

Kadar Protein = x 100
W x 10
V1 = Volume titrasi sampel
V2 = Volume titrasi blanko
N NaOH = Normalitas NaOH yang telah distandarisasi
Fk = factor konversi
W = berat sampel

Table Pengamatan
kode W V1 V2 N NaOH fk % Protein Rata-rata

6. ANALISIS KADAR KARBOHIDRAT

A. KARBOHIDRAT

Karbohidrat adalah polihidroksialdehid atau polihidroksiketon. Nama karbohidrat

digunakan pada senyawa-senyawa dengan rumus empiris CnH2nOn yaitu karbon yang
mengalami hidratasi.
Dialam karbohidrat merupakan hasil sintesis dari CO2 dan H2O dengan bantuan sinar matahari
dan hijau daun (klorofil). Hasil fotosintesa ini kemudian mengalami polomerisasi menjadi pati
dan senyawa-senyawa bermolekul besar lain yang menjadi cadangan makanan pada tanaman.
Secara alami ada tiga bentuk karbohidrat penting yaitu ;
1. Monosakarida
2. Oligosakarida
3. Polisakarida
Monosakarida merupakan karbohidrat yang paling sederhana. Monosakarida sedikit
dijumpai dialam karena tidak digunakan sebagai cadangan makanan seperti polisakarida.
Monosakarida untuk makanan dan obat-obatan seperti glukosa dan fruktosa sering dibuat dari
jagung , ketela dan lain-lain.
 Bentuk umum oligosakarida adalah disakarida yang terjadi dari proses kodensasi dua
molekul monosakarida,contoh adalah sukrosa. Mono dan disakarida memiliki rasa manis. Oleh
karena itu disebut sugar atau gula. Glukosa (gula anggur) dan fruktosa (gula buah) merupakan
contoh monosakarida yang banyak dijumpai dialam. Contoh –contoh dari disakarida antara lain
sukrosa (gula tebu,bit) dan laktosa (gula susu).
Polisakarida merupakan kelompok karbohidrat yang paling banyak dijumpai dialam
yang terbentuk dari ratusan bahkan ribuan unit monosakarida. Sebagian polisakarida
membentuk struktur tanaman yang tidak larut misalnya selulosa dan hemiselulosa. Sebagian lagi
membentuk senyawa cadangan berbentuk pati dalam tanaman atau glikogen pada sel-sel hewan.

B. Analisa Karbohidrat
Ada berbagai cara untuk menentukan banyaknya karbohidrat dalam suatu bahan antara lain
dengan
 Cara kimia
 Cara fisik
 Cara enzimatik (biokimia)
 Cara kromatografi
Berbagai cara diatas dilakukan untuk mengetahui jumlah kuantitatif dalam rangka
menentukan komposisi suatu bahan makanan, penentuan sifat fisis, atau kimiawinya yang
berkaitan dengan kekentalan, kelekatan, stabilitas larutan dan tekstur hasil olahannya.
Penentuan karbohidrat yang paling mudah adalah dengan cara perhitungan kasar (proximat
analysis) atau disebut juga Carbohydrate by Difference. Yang dimaksud dengan proximate
analysis adalah suatu analisis dimana kandungan karbohidrat termasuk serat kasar diketahui
bukan melalui analisis tetapi melalui perhitungan sebagai berikut :
% karbohidrat = 100% - % (protein + lemak + abu + air)
Perhitungan Carbohydrate by Difference adalah penentuan karbohidrat dalam makanan
secara kasar, hasilnya biasanya dicantumkan dalam daftar komposisi bahan makanan.

C. Uji Kuantitatif Karbohidrat

Penentuan karbohidrat yang termasuk polisakarida maupun oligosakarida memerlukan
perlakuan pendahuluan yaitu hidrolisa terlebih dahulu sehingga diperoleh monosakarida. Untuk
 keperluan ini maka bahan dihidrolisa dengan asam atau enzim pada suatu keadaan tertentu.
Penetuan monosakarida yang dihasilkan dapat ditentukan dengan cara sebagai berikut :

1. Cara Kimiawi
a. Metode oksidasi dengan Cupri
Metode ini berdasarkan reduksi cupri oksida menjadi kupro oksida dengan adanya gula reduksi.
Pereaksi metode ini terdiri atas campuran kupri sulfat, Na-karbonat dan asam sitrat (pereaksi
Luff) atau campuran cupri sulfat danapan kupri oksid K-Na-tartrat (pereaksi soxhlet) K-Na-
tartrat berfungsi mencegahpengendapan cupri oksida dalam larutan pereaksi. Kupri sulfat
berfungsi sebagai oksidator. Kupri sulfat dengan gula reduksi akan mengalami reduksi yang
menghasilkan endapan berwarna merah bata. Jumlah endapan kupro oksida ekivale dengan
banyaknya jumlah gula reduksi dalam sampel.kupro oksida yang terbentuk dapat diketahui
dengan cara peninbangan setelah pengeringan atau melarutkan kembali kupro oksida dan
selanjutnya dititrasi. Penentuan gula reduksi dalam larutan yang sering dilakukan adalah sebagai
berikut :
1. Cara Luff Schoorl
2. Cara Munson Walker
3. Cara Lane-Eynon
b. Metode Oksidasi dengan larutan ferisiannida alkalis
c. Metode Iodometri

2. Cara Enzimatis
a. Cara Kromatografi
3. Cara Fisis

1. Cara Luff Schoorl

Penentuan gula dengan cara Luff Schoorl yang ditentukan bukan kuprooksida yang mengendap
tetapi dengan menentukan kuprioksida dalam larutan sebelum sebelum direaksikan dengan gula
reduksi (titrasi blanko) dan sesudah direaksikan dengan sampel gula reduksi (titrasi sampel).
 Titrasi menggunakan Na-tiosulfat. Selisih titrasi blanko dengan titrasi sampel ekiuvalen dengan
kuprioksida yang terbentuk dan juga ekuivalen dengan jumlah gula reduksi yang ada dalam
bahan atau larutan.

2. Cara Munson Walker

Menentukan banyaknya kuprioksida yang terbentuk dengan penimbangan atau melarutkan
kembali dengan asam nitrat lalu mentitrasinya dengan tiosulfat. Jumlah kuprioksida yang
terbentuk ekuivalen dengan gula reduksi dalam larutan.

3. Cara Lane-Eynon
Penetuan gula dengan menitrasi pereaksi Soxhlet (larutan CuSO4, K-Na-tartrat) dengan gula
yang akan dianalisis. Banyaknya larutan sampel yang dibutuhkan untuk menitrasi pereaksi
soxhlet menunjukkan banyaknya gula dalam sampel dengan melihat table Lane-Eynon.

LEMBAR KERJA VII

1. Metode : Luff Schoorl

2. Prinsip : Hidrolisis Karbohidrat menjadi monosakarida yang dapat mereduksi
Cu2+ menjadi Cu+ Kelebihan Cu2+ dapat dititer secara iodometri.
3. Alat dan Bahan
Alat :
 Neraca analitik
 Erlenmeyer 500 mL, 250 mL
 Pendingin tegak
 Labu ukur
 Corong
 Buret
 Hot plate
 Pipet gondok 10 mL, 25 mL
 Gelas ukur
 Pipet tetes
 Kertas saring

Bahan
 HCl 3 %
 NaOH 30 %
 CH3COOH 3 %
 KIO3
 Kertas lakmus
 Larutan KI 20%
 Larutan H2SO4 25%
 Larutan H2SO4 4N
 Larutan tiosulfat 0,1 N
 Indicator kanji / amilum 0,5 %
 Table Luff Schroorl

4. Pembuatan Larutan

a. Pereaksi Luff Schoorl

Larutkan 143,8 gr Na2CO3 anhidrat dalam 300 mL air suling. Sambil diaduk tambahkan 50 gr
asam sitrat yang telah dilarutkan dengan 50 mL air suling. Tambahkan 25 gr CuSO45H2O yang
telah dilarutkan dengan 100 mL air suling. Pindahkan larutan tersebut kedalam labu ukur 1 liter,
tepatkan sampai tanda batas dengan air suling dan kocok. biarkan semalam dan saring bila perlu.
Larutan Luff Schoorl harus mempunyai pH 9,3 – 9,4.
b. Larutan KI 20%
Timbang 20 gr KI dengan air suling sampai 100 mL.

c. Larutan amilum 0,5%

Timbang 0,5 gr amilum, larutkan dengan air suling panas sampai 100 mL.

5. Pembakuan larutan tiosulfat 0,1 N

Timbang 0,1 gr KIO3 kedalam larutkan dengan 25 mL air suling. Tambahkan 5 mL larutan KI
20% dan 5 mL H2SO4 2N. titrasi cepat dengan larutan tiosulfat 0,1 N sampai larutan berwarna
kuning. Tambahkan 5 mL amilum 0,5% lanjutkan titrasi sampai larutan biru menjadi tidak
berwarna.

6. Penentuan Karbohidrat
a. Timbang dengan seksama lebih kurang 5 gr cuplikan kedalam Erlenmeyer 500ml
b. Tambahkan 200 ml larutan HCl 3% didihkan selama 3 jam dengan pendingin tegak.
c. Dinginkan dan netralkan dengan larutan NaOH 30% (dengan kertas lakmus atau fenolftalein)
dan tambahkan sedikit CH3COOH 3% agar suasana sedikit asam.
d. Pindahkan isinya kedalam labu ukur 500 mL dan impitkan hingga tanda batas , kemudian saring.
e. Pipet 10 mL saringan kedalam Erlenmeyer 500 mL, tambahkan 25 mL larutan Luff (dengan
pipet) dan beberapa butir batu didih serta 15 mL air suling.
f. Panaskan campuran tersebut dengan nyala yang tetap. Usahakan agar larutan dapat mendidih
dalam waktu 3 menit (gunakan stop watch). Didihkan terus selama 10 menit dihitung dari saat
mulai mendidih dan gunakan stop watch) kemudian dinginkan dalam bak yang berisi es.
g. Setelah dingin tambahkan 15 mL larutan KI 20%, dan 25 mL H2SO4 25% perlahan-lahan.
h. Titer secepatnya dengan larutan tio 0,1 N (gunakan larutan indicator amilum0,5%)
i. Kerjakan juga Blanko.

7. Table data
a. Standarisasi larutan tiosulfat 0,1 N
NO W KIO3 V Na2S2O3 (mL) N NA2S2O3 N Rata-
 rata

b. Analisa sampel
% rata-
Ws V Na2S2O3 (mL) Mg gula tabel % KH
rata

8. Perhitungan

Mg gula x N tio/0,1 x fp
Kadar karbohidrat = x 100% x 0,9
Ws x 1000

Ws = bobot cuplikan (mg)

Mg gula = glukosa yang terkadang untul mL tio yang dipergunakan
(mg)
Table Luff Schoorl
Fp = factor pengenceran

I.STERILISASI
Sterilisasi adalah suatu usaha untuk membebaskan alat-alat atau bahan-bahan dari segala
macam bentuk kehidupan, terutama mikroba.
Dalam praktek sterilisasi alat-alat atau media dapat dikerjakan secara mekanik (misalnya dengan
cara penyaringan), secara kimia (menggunakan desinfektan), atau secara fisik (dengan
pemanasan, sinar Ultra violet, sinar X dan lain-lain).
Cara sterilisasi yang digunakan tergantung kepada macam dan sifat bahan yang disterilkan
(misalnya ketahanan terhadap panas, bentuk bahan yang disterilkan : Padat, cair, atau gas).
1. Sterilisasi Secara Fisik
Sterilisasi secara Fisik merupakan sterilisasi yang sering dipakai.Sterilisasi dengan cara ini ada 5
cara :
a. Pemijaran
b. Udara panas
c. Uap air bertekanan
d. Uap air panas
e. Sinar Radio aktif

a. Pemijaran
Cara ini dipakai untuk sterilisasi jarum platina/Ose yang terbuat dari Platina atau Nikrom.
Caranya dengan membakar alat-alat etrsebut diatas lampu spirtus/Bunsen sampai pijar.

b. Udara Panas/Kering
Alat yang dipakai adalah hot air sterilizer/ovin dipakai untuk sterilisasi alat-alat dari gelas seperti
Erlenmeyer, petridish, tabung reaksi,pipet dan lain-lain. Bahan-bahan seperti kapas, kertas, kain
juga dapat disterilkan dengan alat ini. Suhu yang digunakan berkisar 170 - 180° C selama 2 – 3
jam. Lamanya sterilisasi dengan cara ini tergantung pada jumlah alat-alat yang disterilkan dan
ketahanannya terhadap panas.

c. Uap Panas
Bahan-bahan yang disterilkan dengan cara ini umumnya adalah “ Media” yang tidak tahan
terhadap “suhu tinggi” : alatnya disebut alat sterilisasi Arnold.

Caranya : Sterilkan bahan pada suhu 100° C selama 80 menit untuk mematikan sel vegetative
mikroorganisme kemudian diinkubasikan selama 24 jam pada suhu kamar untuk menumbuhkan
spora-spora. Ulangi cara tersebut untuk ke 3 kalinya pada bahan dengan suhu dan waktu yang
sama. Dengan cara ini diharapkan akan benar-benar menjadi steril.

d. Uap Air Panas Bertekanan

Alat yang digunakan namanya “ autoklaf “ ( picesum cooker ) . Sterilisasikan dengan cara ini
merupakan cara sterilisasi yang paling baik jika di bandingkan dengan cara – cara lainnya. Alat –
 alat dan bahan – bahan yang dapat di sterilkan dengan cara ini adalah alat – alat dan bahan –
bahan yang tidak akan rusak karena pemanasan dan tekanan tinggi .
Caranya : autoklaf diisi air kira – kira 1,5-2 liter kemudian di panaskan . Alat dan bahan yang
akan di sterilkan dimasukkan ke dalam autoklaf . Apabila media yang akan di sterilkan dalam
tabung reaksi atau Erlenmeyer, perlu di tutup rapat dengan kapas kemudian di bungkus dengan
sampul setelah itu tutup autoklaf , di pasang dan skrup – skrup nya di kencangkan . Keran
pengatur tempat keluar nya uap air di biarkan terbuka sampai uap air keluar . Hal ini di maksud
agar – agar di dalam alat – alat tersebut tidak ada udara lagi yang dapat mengacaukan pembacaan
suhu atau tekanan , selanjutnya keran pengatur keluarnya uap air di tutup dan di biarkan sampai
tekanan di dalam naik. Suhu atau tekanan yang digunakan tergantung dari alat/bahan yang
digunakan adalah 15-20 psi ( 1,5 -2 atm ) dan waktu 15 – 30 menit . Apabila sterilisasi sudah
selesai maka listrik / apinya dimatikan . Keran uap di biarkan sampai angka 0 baru kemudian
autoklaf di buka .

2. Sterilisasi Secara Mekanik

 Saringan
Bahan – bahan cair yang sangat peka terhadap pemanasan ( misalnya : serum darah ) atau media
cair yang relative tidak tahan terhadap pemanasan yang tinggi harus di sterilkan dengan cara
penyaringan untuk keperluan ini dipakai alat yang disebut penyaring bakteri ( filter bakteri ) .

a. Penyaring Bekefeld
Alat penyaringanya terbuat dari tanah diatomac dengan 3 porositas V ( Viet = Kasar ) ,N (
Normal ) , W ( Weing = halus ) yang biasa dipakai yang mempunyai porositas N dan W.

b. Penyaring Chamberland
Alat saringannya terbuat dari porselen yang dilapisi email. Porositasnya filter L1,L2,L3…,L13.
Dimana : L1 paling kasar
L2 paling halus
Yang biasanya dipakai L3
c. Penyaring Seitz (penyaring asbes)
 Alat penyaring terbuat dari baja tahan karat yang dilengkapi dengan saringan asbes selulosa yang
dapat diganti.
d. Penyaring Mendler
Penyaring ini terbuat dari 60-80 % diatomae, 10-15 % plaster of paris
(CaSO4).H2O.Perbandingan ini tergantung dari besar kecilnya pori yang diinginkan.
e. Penyaring Fritted Glass
Penyaring ini terbuat dari serbik gelas (fritted glass) yang halus didalam cetakan yang berbentuk
cakram (disk) kemudian dipanaskan sampai suhu tinggi sehingga cakram berpori. Porositasnya
ada 5 tingkat yaitu
EC (ekstra kasar), C (kasar), M (medium), UF (ekstra halus), F (halus).
e. Penyaring Asbes
Asbes ditekan menjadi bentuk cakram tipis dengan dijepit melalui logam yang rata.
f. Penyaring Jenkin
Penyaring ini menggunakan lapisan logam karet penghubung dan balok penyaring yang terbuat
dari porselen.
g. Penyaring Ultra
Digunakan untuk memisahkan koloid-koloid. Penyaring Ultra menggunakan koloidon dan
digunakan untuk memisahkan virus.

3. Sterilisasi Secara Kimia

Bahan kimia yang sering digunakan adalah
a. Fenol
Fenol dan turunannya (metal fenol dan dimetil fenol) bersifat merobek membrane sel dan
mendenaturasikan protein, yang mengakibatkan mikroorganisme menjadi mati.
b. Alkohol
Alkohol dapat mendenaturasikan protein dan melarutkan lemak sehingga dinding sel rusak dan
plasma membengkak mengakibatkan mikroorganisme mati.Etanol sangat efektif pada
konsentrasi 50-70%.

c. Halogen
 Jenis halogen yang sering digunakan untuk sterilisasi adalah Yodium, dan klor serta senyawanya
contoh kaporit (NaOCl).

Kepekaan dan Keaktifan zat kimia terhadap Mikroorganisme

Keaktifan
NO Bahan Konsentrasi

Tinggi
1. Formalin + Alkohol 8 % + (60-70%)

Sedang tinggi
2. Formalin 3-8 %

Sedang
3. Yodium tinklor 0,6 – 70 %

Sedang
4. Alkohol 70 – 90 %

Sedang
5. Kaporit 4–5%

Rendah sedang
6. Fenol 0,5 – 3 %

II. MEDIA

Media adalah suatu bahan yang terdiri dari campuran zat-zat hara (nutrient) yang berguna
untuk membiakkan mikroba. Dengan menggunakan berbagai media dapat dilakukan isolasi,
perbanyakan, pengujian sifat-sifat fisiologis dan perhitungan jumlah mokroba.
Supaya mikroba dapt tumbuh dengan baik dalam suatu media maka suatu media harus
memenuhi syarat-syarat antara lain :
1. Harus mengandung semua zat hara yang mudah digunakan oleh mikroba
2. Harus mempunyai tekanan osmose, tegangan permukaan dan pH yang sesuai dengan
kebutuhan mikroba yang ditumbuhkan.
 3. Tidsk mengandung zat-zat yang dapat menghambat pertumbuhan mikroba.
4. Harus dalam keadaan steril sebelum digunakkan, agar mikroba yang diinginkan dapat tumbuh
baik.

A. Macam – Macam Media

Media dapat di golongkan berdasarkan atas :
1. Media berdasarkan susunan zat kimia
2. Media berdasarkan sifatnya
3. Media berdasarkan konsistensinya / wujudnya / fasa
4. Media berdasarkan fungsinya / kegunaannya

1. Media berdasarkan susunan zat kimia

a. Media Anorganik yaitu media yang tersusun dari bahan-bahan anorganik
b. Media Organik yaitu media yang tersusun dari bahan-bahan organic
c. Media sintetik (media buatan) yaitu media yang susunan kimianya diketahui denhgan pasti,
media ini umumnya digunakan untuk mempelajari kebutuhanmakanan suatu mikroorganisme
contoh media Bushel HaS2.
d. Media non sintetik adalah media yang tidak diketahui pasti susunan kimianya dan biasanya
terdiri dari bahan-bahan alami seperti kentang, nutrient kaldu, dan telur. Media ini biasanya
digunakan untuk menumbuhkan dan mempelajari taksonomi mikroorganisme.

2. Media berdasarkan sifatnya

a. Media umum yaitu suatu media yang dapat digunakan untuk pertumbuhan dan perkembangan
bermacam-macam mikroorganisme, contoh media kentang.
b. Media khusus yaitu media yang hanya digunakan untuk menumbuhkan macam-macam
nikroorganisme saja contoh EMB agar (Eosin Metyl Blue) untuk menumbuhkan Escherichia
coli.
c. Media Eklusif yaitu media yang hanya bias ditumbuhi oleh suatu jenis mikroorganisme sedang
mikroorganisme lainnya mati.
3. Media berdasarkan Konsistensinya / wujudnya / fasa
a. Media cair yaitu media yang berbentuk cair
b. Media Padat yaitu media yang berbentuk padat. Media ini dapat berupa bahan organi alamiah
misalnya terbuat dari kentang, wortel, dengan ditambahkan agar-agar sebagai zat pemadat atau
juga dari bahan anorganik masalnya silica gel.
c. Media semi padat atau semi solid yaitu media padat yang dpat dicairkan. Media ini dalam
keadaan panas berebntuk cair sedangkan dalam keadaan dingin berbentuk padat, contoh media
agar dan media broth (kaldu).

4. Media berdasarkan Fungsinya / Kegunaannya

Pembuatan media ini dimaksudkan untuk tujuan khusus yaitu pengenalan, perhitungan, dan
isolasi mikroorganisme tipe-tipe tertentu. Contoh media ini antara lain :
a. Media Diperkaya yaitu media yang ditambah dengan zat-zat tertentu misalnya serum darah,
ekstrak tanaman. Media ini digunakan untuk menumbuhkan mikroorganisme yang bersifat
heterotrof.
b. Media Selektif yaitu media yang ditambahi zat kimia tertentu untuk mencegah pertumbuhan
mikroorganisme lainnya atau media ini dapat memberikan nutrient yang cukup untuk
prtumbuhan mikroorganisme lainnya yang tidak diharapkan contoh media yang mengandung
Kristal violet untuk menumbuhkan bakteri Gram.
c. Media Difrensial yaitu media yang ditambahi zat kimia tertentu yang menyebabkan suatu
mikroorganisme membentuk pertumbuhan untuk mengadakan perubahan tertentu dapat
dibedakan tipe-tipenya. Contoh media agar darah untuk membedakan baketri Hemolitik dan
Nonhemolitik.
d. Media Penguji (assay / asei) yaitu media dengan susunan tertentu yang digunakan untuk
pengujian vitamin-vitamin, asam amino dan antibiotic.
e. Media Perhitungan Jumlah Mikroorganisme yiatu media spesifik yang digunakan untuk
menghitung jumlah mikroorganisme dalam suatu bahan.
Beberapa contoh media Diperkaya, Media Selektif, dan Media Difrensial
1. Agar Darah / Blood Agar

Media Difrensial yang digunakan untuk membedakan beberapa bakteri pathogen, dan bakteri

hemolitik.

2. Endo Agar
 Media yang digunakan untuk menumbuhkan bakteri yang hidup diusus.

3. EMB (Eosin Methylen Blue)

Media yang digunakan untuk menumbuhkan bakteri yang termasuk golongan Entero

Bakteriaceae dan campuran species-species bakteri berbentuk Koloform.

4. Mac Conkey Agar

Digunakan untuk seleksi dan penumbuhan bakteri Entero bakteri dan bakteri gram.

5. Brilliant Green Agar

Untuk menumbuhkan bakteri Gram, Enterobakteriaceae salmonella

6. GLBB

Untuk menumbuhkan bakteri gram dan enterobakteriaceae

7. Manitol Salt Agar (MSA)

Untuk mendeteksi asam yang dihasilkan oleh Staphylococcus.

8. Axida Dextrose Broth (ADB)

Untuk bakteri Gram +

9. Violet Red Bilentuk bakteri Gram –

10. Salmonella Shigella Agar (SSA)

Untuk bakteri Gram – dan Enterobakteriaceae

11. Selenit Broth untuk isolasi Salmonella

12. Gram Negatif Broth (GNB)

Untuk menumbuhkan bakteri Salmonella dan Shigella

13. Deoxycholate Citrat Agar (DCA) untuk mengisolasi spesies dari kelompok Enterobakteriaceae

salmonella

14. TSI (Triple Sugar Iron) untuk membedakan jenis Enterobakteriaceae.

 LANGKAH - LANGKAH PEMBUATAN MEDIA
1. Mencampur Bahan
Garam dan bahan-bahan lain dilarutkan dalam Aquades kemudian dipanaskan dalam penangas
air sehingga larut.
2. Menyaring Medium
Beberapa media kadang-kadang perlu disaring dengan kertas saring, kain dan kapas. Untuk
media agar atau gelatin penyaringan harus dilakukan sewaktu media masih panas.
3. Menentukan dan Mengatur pH
Penentuan pH suatu media cair dapat dilakukan secara kolori metri dengan menggunakan kertas
indicator universal dan komparator blok secara potensiometrik menggunakan pH meter.
4. Memasukkan Media Dalam Wadah
Sebelum media disterilkan kedalam tabung reaksi steril atau ketempat lain yang steril kemudian
ditutup dengan kapas dan bagian kapasnya dibungkus kertas sampul (perkamen) supaya jangan
basah waktu disterilkan.

5. Sterilisasi Media
Sterilisasi tergantung pada jenis media yang digunakan.

Beberapa Media Yang Digunakan Untuk Identifikasi

A. Endo Agar
Persenyawaan utama dalam media ini adalah Lactosa, Na Sulfit, Basicfuhsin. Sifat pertumbuhan
pada koloni Endo Agar adalah untuk bakteri yang memfermentasikan Lactosa terlihat koloni
berwarna merah metalikdan dikelilingi media yang berwarna kemerahan.Untuk bakteri yang
tidak memfermentasikan Lactosa maka koloni terlihat warna terang, tembus tak berwarna dan
dikelilingi oleh media yang berwarna merah

B. Brilliant Green Agar

 Media ini banyak digunakan untuk Isolasi dan Identifikasi Salmonella dari tinja dan bahan

makanan. Indikator yang digunakan adalah fenol yang berwarna merah dalam suasana basa dan

berwarna kuning dalam suasana asam.

Sifat Pertumbuhan Koloni pada Agar

Sifat Pertumbuhan
NO Jenis Bakteri Koloni

1. Koloni berwarna
merah muda

Salmonella dikelilingi oleh

medium berwarna
2. Koloni berwarna
merah
merah tanpa

Proteus penyebaran

3. Koloni berwarna
merah dengan

Pseudomonas permukaan menjorok

kebagian dalam

III. ISOLASI MIKROBA

Populasi mikroorganisme yang ada di alam sekitar kita ini ssangatlah besar dan cukup
kompleks. Beratus spesies mikroba menguasai setiap bagian tubuh kita. Mereka terdapat dalam
jumlah yang cukup basar. Sebagai contoh, sekali kita bersin dapat menebarkan beribu- ribu
mikroorganisme. Satu gram tinja dapat mengandung jutaan bakteri. Alam di sekitar kita, baik itu
tanah, air, maupun udara juga dihuni oleh kumpulan mikroorganisme Penelitian yang layak
mengenai mikroorganisme dalam berbagai habitat ini memerlukan teknik untuk memisahkan
populasi campuran yang rumit ini, atau yang biasanya dikenaldengan istilah biakan campuran,
 menjadi spsies yang berbeda- beda yang bikenal dengan istilah biakan murni. Biakan murni in
teerdiri dari satu populasi sel yang semuanya berasal dari satu sel induk(Pelczar, 1986).
Mikroorganisme dapat diperoleh dari lingkungan air, tanah, udara, suubstrat yang
berupa bahan pangan, tanaman dan hewan. Jenis mikroorganismenya dapat berupa bakteri,
khamir,kapang dan sebagainya. Populasi dari mikroba yang ada di linkungan ini sangatlah
beraneka ragam sehingga dalam mengisolasi diperlukan beberapa tahap penanaman sehingga
berhasil diperoleh koloni yang tunggal. Koloni yang tunggal ini kemudian yang akan
diperbanyak untuk suatu tujuan penelitian misalnya untuk menngisolasi DNA mikroba yang
dapat mendeteksi mikroba yang telah resisten terhadap suatu antibiotik. Atau untuk mengetahui
mikroba yang dipakai untuk bioremediasi holokarbon (Ferdiaz, 1992). Pemindahan bakteri dari
medium lama ke medium yang baru atau yang dikenal dengan istilah inokulasi bakteri ini
memerluakn banyak ketelitian. Terlebih dahulu kita harus mengusahakan agar semua alat- alat
yang akan digunakan untuk pengerjaan medium dan pengerjaan inokulasi benar- benar steril. Hal
ini untuk menghindari terjadinya kontaminasi, yaitu masuknya mikrooba lain yang tidak
diinginkan sehingga biakan yang tumbuh di dalam medium adalah benar-benar biakan murni
(Dwidjoseputro, 1990). Di dalam keadaan yang sebenarnya dapat dikatakan bahwa tidak ada
bakteri yang hidup secara tersendiri terlepas dari spesies yang lainnya. Kerap kali bakteri
patogen kedapatan bersama- sama dengan bakteri saprob. Untuk menyendirikan suatu spesies
dikenal beberapacara, yaitu (Dwidjoseputro, 1990) :
1. Dengan pengenceran
Cara ini pertama kali dilakukan oleh Lister pada tahun 1865. Ia berhasil memelihara
Streptococcuslactis dalam piraan murni yang diisolasi dari sampel susu Yang sudah masam.
Suatu sampel dari suatu suspensi yang berupa campuran bermacam- macam spesies diencerkan
dalam suatu tabung yang tersendiri. Dari hasil pengenceran ini kemudian di ambil kira- kira 1
mL untuk diencerkan lebih lanjut. Jika dari pengenceran yang ketiga ini diambil 0,1 mL untuk
disebarkan pada suatu medium padat, kemungkinan besar kita akan mendapatkan beberapa
koloni yang akan tumbuh dalam mdium tersebut, akan tetapi mungkin juga kita hanya akan
memperoleh satu koloni saja. Dalam hal yang demikian ini dapat kita jadikan piaraan murni. Jika
kita belum yakin, Bahwa koloni tunggal yang kita peroleh tersebut merupakan koloni yang
murni, maka kita dapat mengulang pengenceran dengan menggunakan koloni ini sebagai sampel.
2. Dengan penuangan
Robert Koch (1843- 1905) mempunyai metode yang lain, yaitu dengan mengambil sedikit
sampel campuran bakteri yang mudah diencerkan, dan sampel ini kemudian di sebar di dalam
suatu medium yang terbuat dari kaldu dan gelatin encer. Dengan demikian dia memperoleh suatu
piaraan adukan. Setelah medium tersebut mengental maka selang beberapa jam kemudian
nampaklah koloni- koloni yang masing- masing dapat dianggap murni. Dengan mengulang
pekerjaan di atas, maka akhirnya akan diperoleh piaraan murni yang lebih terjamin.

Ada beberapa metode yang biasanya dilakukan untuk menanam biakan di dalam medium
diantaranya adalah (Lay, 1994) :
1. Metode cawan gores
Metode ini mempunyai dua keuntungan yaitu menghemat bahan dan waktu. Namun untuk
memperoleh hasil yang baik diperlukan keterampilan yang lumayan yang biasanya diperoleh dari
pengalaman. Metode cawan gores yang dilakukan dengan baik kebanyakan akan menyebabkan
terisolasinya mikroorganisme yang diinginkan. Dua macam kesalahan yang umum sekali
dilakukan adalah tidak memanfaatkan permukaan medium dengan sebaik- baiknya untuk
digores sehingga pengenceran mikroorganisme menjafi kurang lanjut dan cenderung untuk
menggunakan inokulum terlalu banyak sehingga menyulitkan pemisahan sel- sel
yang digores.
2. Metode cawan tuang
Cara lain untuk mempeeroleh biakan koloni murni dari populasi campuran mikroorganisme ialah
dengan mengencerkan eksperimen dalam medium agar yang telah dicairkan dan didinginkan
yang kemudian di cawankan. Karena konsentrasi sel- sel mikroba di dalam eksperimen pada
umumnya tidak diketahui sebelumnya, maka pengenceran perlu dilakukan beberapa tahap
sehingga sekurang- kurangnyya satu di antara cawan – cawan tersebut mengandung koloni-
koloni terpisah baik di atas permukaan maupun di dalam agar. Metode ini memboroskan waktu
dan bahan namun tidak memerlukan keterampilan yang terlalu tinggi. Proses
pemisahan/pemurnian dari mikroorganisme lain perlu dilakukan karena semua pekerjaan
mikrobiologis, misalnya telaah dan identifikasi mikroorganisme, memerlukan suatu populasi
yang hanya terdiri dari satu macam mikroorganisme saja. Teknik tersebut dikenal dengan
Isolasai Mikroba.
Terdapat berbagai cara mengisolasi mikroba, menurut (Admin, 2008) :
 1) Isolasi pada agar cawan
Prinsip pada metode isolasi pada agar cawan adalah mengencerkan mikroorganisme sehingga

diperoleh individu spesies yang dapat dipisahkan dari organisme lainnya. Setiap koloni yang

terpisah yang tampak pada cawan tersebut setelah inkubasi berasal dari satu sel tunggal. Terdapat

beberapa cara dalam metode isolasi pada agar cawan, yaitu:

 Metode gores kuadran, dan metode agar cawan tuang

 Metode gores kuadran. Bila metode ini dilakukan dengan baik akan menghasilkan terisolasinya

mikroorganisme, dimana setiap koloni berasal dari satusel.

 Metode agar tuang. Berbeda dengan metode gores kuadran, cawan tuang menggunakan medium

agar yang dicairkan dan didinginkan (50oC), yang kemudian dicawankan. Pengenceran tetap

perlu dilakukan sehingga pada cawan yang terakhir mengandung koloni-koloni yang terpisah di

atas permukaan/di dalam cawan.

2) Isolasi pada medium cair

Metode isolasi pada medium cair dilakukan bila mikroorganisme tidak dapat tumbuh pada agar

cawan (medium padat), tetapi hanya dapat tumbuh pada kultur cair. Metode ini juga perlu

dilakukan pengenceran dengan beberapa serial pengenceran. Semakin tinggi pengenceran

peluang untuk mendapatkan satu sel semakin besar.

3) Isolasi sel tunggal

Metode isolasi sel tunggal dilakukan untuk mengisolasi sel mikroorganisme berukuran besar

yang tidak dapat diisolasi dengan metode agar cawan/medium cair. Sel mikroorganisme dilihat

dengan menggunakan perbesaran sekitar 100 kali. Kemudian sel tersebut dipisahkan dengan
 menggunakan pipet kapiler yang sangat halus ataupun micromanipulator, yang dilakukan secara

aseptis.

LEMBAR KERJA VIII

JUDUL : Teknik Isolasi Mikroba

ALAT DAN BAHAN

1. Alat
Alat yang digunakan pada praktikum ini adalah cawan petri, bunsen, enkas, ikubator, ose dan
mikropipet.
2. Bahan
Bahan yang dipergunakan pada percobaan ini adalah Biakan Escherichia coli, Biakan
Staphylococcus aureus, biakan Lactobacillus, Larutan tanah, medium nutrient agar padat,
aquadest, spiritus, alkohol, swab dan korek api

Cara Kerja
Adapun cara kerja dari percobaan ini adalah :

1. Isolasi mikroba di sekitar kita

o Cawan petri yang berisi medium NA diberi label masing- masing sesuai perlakuan.
o Kemudian dengan menggunakan swab, mengambil kotoran gigi, kotoran belakang
o Sebelum dilakukan pengerjaan dalam enkas, terlebih dahulu mensterilkan tangan dengan
menggunakan alkohol 70%.
o Setelah itu masing- masing sampel dimasukkan ke dalam cawan petri yang telah berisi medium
NA.
o Melidahapikan mulut/ pinggir cawan petri dengan maksud agar bakteri yang melekat mati.
o Kemudian membungkus cawan petri dengan menggunakan kertas lalu menginkubasi ke dalam
inkubator selama 24- 48 jam. Mengamti perubahan yang terjadi.
2. Isolasi mikroorganisme dari substrak cair

o Cawan petri yang berisi medium NA diberi label masing- masing sesuai perlakuan. Lalu

memasukkannya kedalam enkas bersama dengan Biakan Escherichia coli, Staphylococcus

aureus, dan Lactobacillus pada media cair.

o Sebelum melakukan pengerjaan dalam enkas, terlebih dahulu mensterilkan tangan dengan

mengunakan alkohol 70%.

o Mengambil masing- masing biakan bakteri dengan menggunakan mikropipet sebanyak 0,1 mL,

lalu diratakan pada permukaan medium sesuai dengan label.

o Melidahapikan mulut/ pinggir cawan petri dengan maksud agar bakteri yang melekat mati.

3. A.Isoalsi dengan cara penuangan

o Cawan petri steril, masing- masing diberi label sesuai perlakuan lalu meletakkan di dalam enkas

bersama dengan medium NA yang cair.

o Sebelum melakukan pengerjaan dalam enkas, terlebih dahulu mensterilkan tangan dengan

mengunakan alkohol 70%.

o Mengambil masing- masing biakaan bakteri dengan menggunakan mikropipet sebanyak 1 mL.

o Melidahapikan cawan petri terlebih dahulu kemudian memasukkan biakan bakteri ke dalam

cawan petri steril lalu menuangkan medium NA cair.

o Menutup cawan petri kemudian melidahapikan dann menggoyangkan dengan cara memutar agar

merata.

o Medium setelah padat lalu menginkubasi sdelama 24- 28 jam dengan posisi terbalik pada suhu

37°C.

3. B. Isolasi dengan cara taburan

o Cawan petri yang berisi medium NA masing- masing diberi label sesuai perlakuan,lalu

meletakkannya di dalam enkas.

o Sebelum melakukan pengerjaan dalam enkas, terlebih dahulu mensterilkan tangan dengan

mengunakan alkohol 70%.

o Dengan menggunakan ose lurus, mengambil biakan bakteri lalu menaburkannya di atas medium

NA padat secara merata.

o Menutup cawan petri lalu melidahapikan dan membungkus dengan kertas, menginkubasi selama

24-28 jam dengan posisi terbalik pada suhu 37°C.

4. Isolasi mikroorganisme dari substrak padat

o Memasukkan cawa petri steril ke dalam enkas, kemudian sebelum melakukan pengerjaan dalam

enkas, terlebih dahulu mensterilkan tangan dengan mengunakan alkohol 70%.

o Mengambil larutan tanah yang telah homogen dengan menggunakan mikropipet lalu

memasukkannya ke dalam cawan petri steril lalu menuangkan medium NA.

o Menutup cawan petri lalu melidahapikan dan membungkus dengan kertas, menginkubasi selama

24-28 jam dengan posisi terbalik pada suhu 37°C.

5. Isolasi bakteri dari kultur campuran

o 4 buah tabung reaksi yang masinng- masing berisi 2 medium agar tegak dan 2 medium agar mirig

dimasukkan ke dalam enkas, setelah diberi label.

 o Sebelum melakukan pengerjaan dalam enkas, terlebih dahulu mensterilkan tangan dengan

mengunakan alkohol 70%.

o Dengan menggunakan ose lurus, mengambil biakan bakteri lalu menusukkan ke dalam medium

lalu di tutup.

o Dengan mengunakan ose bulat, mengambil biakan bakteri dan masing- masing digoreskan secara

zig- zag pada medium agar miring lalu di tututp

o Membungku tabung reaksi dengan kertas dan menginkubasinya selama 24- 72 jam dan

mengamati masing- masing perbedaannya.

IV. PENGUJIAN AIR

Air merupakan sumber kehidupan bagi mahluk hidup tidak terkecuali bagi Mikroba. Air
untuk keperluan keluarga dan industry khususnya industry pangan mempunyai persyaratan
tertentu, diantaranya adalah tidak boleh mengandung bakteri pathogen yang dapat diuji secara
Mikrobiologis.
Disamping untuk keperluan rumah tangga dan industry, air yang bersal dari limbah
industrypun
Harus diteliti dan diuji agar tidak menimbulkan pencemaran bagi daerah sekitarnya.
Air mempunyai peranan yang sangat penting bagi kehidupan umat manusia dan fungsinya bagi
kehidupan tidak pernah dapat digantikan oleh senyawa lain. Tubuh manusia terdiri dari 65% air
atau sekitar 47 liter air / orang dewasa. Setiap hari sebanyak 2,5 liter air harus diganti dengan air
 yang baru. Diperkirakan dari sejumlah air yang harus diganti sebanyak 1,5 liter berasal dari air
minum dan sekitar 1,0 liter berasal dari bahan makanan yang dikonsumsi.
Karena air merupakan bagian terpenting bagi kehidupan manusia maka persyaratan mutu air
yang pantas diminum perlu ditelaah, demikian pula air limbah industry, perlu diperiksa
keadaannya sebelum dibuang ke sungai atau perairan bebas lain. Dalam hal ini pengujian air
secara mikrobiologis perlu dilakukan agar air terbebas dari mikroba.

1. UJI KOLIFORM

Bakteri koliform digunakan sebagai indicator adanya polusi kotoran dan kondisi sanitasi

terhadap air,susu dan makanan dan minuman lainnya. Adanya bakteri koliform dalam makanan

atau minuman menunjukkan kemungkinan adanya mikroorganisme yang bersifat

enteropatogenik atai enterotoksigenik yang berbahaya bagi kesehatan.

Untuk mengetahui koliform dalam suatu contoh biasanya digunakanmetode MPN (Most

Probable Number) dengan cara fermentasi tabung ganda. Metode ini lebih baik disbandingkan

dengan metode hitung cawan TPC (Total Plate Count) karena lebih sensitive dan dapat

mendeteksi koliform dalam jumlah yang sangat rendah dalam contoh. Uji kualitattif koliform

secara lengkap terdiri dari :

a. Uji Penduga

b. Uji Penguat

c. Uji Lengkap

Uji penduga juga merupakan uji kuantitatif koliform menggunakan metode MPN

a. Uji Penduga Koliform (MPN Koliform)

 Ada dua cara yang dapat digunakan dalam menghitung MPN koliform secara sensitif dalam air,

yaiyu metode 7 tabung dan 15 tabung. Pengambilan contoh pada metode ini sebanyak 10 mL

untuk tabung seri pertama, terutama untuk contoh-contoh yang diduga kandungan koliformnya

kecil, sehingga apabila contoh yang diambil terlalu ktode ini sebanyak 10 mL untuk tabung seri

pertama, terutama untuk contoh-contoh yang diduga kandungan koliformnya kecil, sehingga

apabila contoh yang diambil terlalu kecil mungkin koliformnya tidak dapat terdeteksi.

Jumlah contoh Jumlah tabung Jumlah medium pertabung

pertabung durham +
Tabung durham
MPN 7 tabung
10 mL 5 10 mL (konsentrasi ganda )
1,0 mL 1 10 mL (konsentrasi ganda)
0,1 mL 1 10 mL (konsentrasi ganda)
MPN 15 tabung
10 mL 5 10 mL (konsentrasi ganda)
1,0 mL 5 10 mL (konsentrasi ganda)
0,1 mL 5 10 mL (konsentrasi ganda)

Untuk analisa air, dalam uji penduga digunakan medium lactose broth (kaldu laktosa). Inkubasi

dilakukan pada suhu 35 derajat. Celcius selama 24 jam, dan tabung dinyatakan positif jika

terbentuk gas sebanyak 10% atau lebih dari volume di dalam tabung durham. Tabung yang tidak

menunjukkan pembentukan gas diperpanjang lagi inkubasinya selama 48 jam. Jika tetap tidak

terbentuk gas , dihitung sebagai tabung nrgatif. Jumlah tabung yang positif dihitung pada

masing-masing seri.

b. Uji Penguat Koliform ( MPN Penguat)

 Terbentuknya gas dalam Lactose broth tidak selalu menunjukkan jumlah bakteri koli karena

mikroba lainnya juga ada yang memfermentasi lactose dengan membentuk gas, seperti bakteri

asam lactate dan beberapa khamir tertentu. Oleh karena itu perlu dilakukan uji penguat pada agar

EMBA (eosin methylene blue agar) dengan menggunakan jarum ose contoh dari tabung MPN

yang menunjukkan uji penduga positif (terbentuk gas) masing-masing diinokulasikan pada agar

cawan EMBA dengan cara goresan kuadran. Semua cawan diinkubasikan pada suhu 35oC

selama 24 jam. Jumlah cawan EMBA pada masing-masing pengenceran yang menunjukkan

adanya koliform dihitung.

c. Uji Lengkap Koliform

Dari pertumbuhan koloni pada agar cawan EMBA dipilih masing-masing koloni yang mewakili

koloni fekal (mempunyai diameter 0.5 – 1,0 mm dan berwarna gelap dengan sinar hijau metalik /

keemasan), dan satu koloni yang mewkili koliform non fekal (diameter 1,0 – 3, 0 mm, berwarna

merah muda dan bagian tengah berwarna gelap seperti mata ikan).

Uji lengkap dilakukan untuk melihat apakah isolate diambil benar merupakan bakteri koliform.

Dari masing-masing koloni dibuat pewarnaan gram dan sisanya masing-masing dilarutkan

kedalam 3 mL larutan pengencer steril. Dari suspense bakteri tersebut diinokulasikan dengan

menggunakan jarum ose kedalam tabung berisi lactose broth dan tabung durham dan digoreskan

pada agar miring Nutrien Agar (NA). tabung diinkubasikan pada suhu 35oC selama 24 jam dan

48 jam, dan diamati adanya pertumbuhan dan pembentukan gas didalam lactose broth. Koloni

yang menunjukkan reaksi pewarnaan gram negative berbentuk batang dan membentuk

gasdidalam lactose broth merupakan uji lengkap adanya koliform.

 Untuk mengetahui adanya bakteri koliform pada bahan atau contoh pengujian cukup sampai

disini, akan tetapi jika akan dideteksi jenis koliform yang ada dalam contoh bisa dilakukan uji

IMVIC (Indol Methyl, Voges – Proskaeur, dan Citrate).

LEMBAR KERJA IX

JUDUL : Pengujian Kualitas Air Secara Uji Koliform

TUJUAN : Menguji kualitas air dengan menggunakan metode
MPN (Most Probable Number)
ALAT DAN BAHAN : 1. ALAT
 Tabung reaksi
 Tabung durham
 Jarum ose
 Cawan petri
 Incubator
 Kaca preparat
 Lampu spiritus
 Mikroskop
 Botol pengencer
: 2. BAHAN
 Medium lactose cair
 Medium EMBA
 Contoh air
 Larutan cristal violet
 Larutan mordan
 Alcohol 95%
 Larutan safranin
 Aquadest
 Kertas tisu/isap
KESELAMATAN KERJA
Pakailah jas praktikum selama praktek dilakukan. Bekerjalah secara aseptis selama kegiatan

praktek karena bekerja dengan menggunakan bakteri yang bersifat pathogen dan jagalah selalu

alat-alat dan area kerja dalam keadaan bersih dan setelah selesai maka, alat-alat kerja dan area

kerja,serta tangan harus dibersihkan agar tidak terkontaminasi oleh bakteri tersebut. Buang

semua bahan / media yang tidak digunakan lagi pada tempat yang disediakan.

CARA KERJA
Uji Penduga Koliform (MPN Koliform)
1. Ambilah 7 buah tabung reaksi berisi media lactose cair + tabung durham
2. 5 buah tabung ditambah 10 mL contoh air. air, 1 tabung ditambah 0,1 mL.
3. Inkubasikan pada suhu 35oC selama 24 jam. Tabung dinyatakan positif jika terbentuk gas dalam
tabung durham. Tabung yang tidak menunjukkan pembentukan gas diperpanjang lagi
inkubasinnya sampai 48 jam, jika tetap tidak terbentuk gas dihitung sebagai tabung negative.

Uji Penguat Koliform

1. Dengan jarum ose, contoh dari tabung MPN yang menunjukkan uji penduga positif (terbentuk

gas) masing-masing diinikulasikan pada cawan yang berisi media EMBA dengan goresan

kuadran.

2. Inkubasikan pada suhu 35oC selama 24 jam.

3. Amati pertumbuhan pada cawan petri.

 Uji Lengkap Koliform
1. Dari pertumbuhan pada agar cawan EMBA, dipilih masing-masing satu koloni yang mewakili

koliform fekal dan koliform nonfekal.

2. Dari masing-masing koloni dibuat pewarnaan Gram,dan sisanya masing-masing dilarutkan

kedalam 3 mL larutan pengencer steril.

3. Dari suspense bakteri tersebut masing-masing diinokulasikan dengan menggunakan jarum ose

kedalam tabung yang berisi lactose cair dan tabung durham.

4. Tabung diinkubasikan pada suhu 35oC selama 24 jam dan 48 jam, dan diamati adanya

pembentukan gas dalam lactose cair.

5. Koloni yang menunjukkan reaksi pewarnaan gram negative berbentuk batang dan membentuk

gas didalam lactose cair merupakan uji lengkap adanya koloni koliform.

ZAT – ZAT ADITIF PADA MAKANAN

Bahan makanan yang diproses secara besar-besaran dalam industry umumnya ditambahkan zat
zat tertentu kedalamnya. Penambahan zat –zat itu dilakukan dengantujuan tertentu , misalnya :
a. Untuk meningkatkan mutu. Karena dikhawatirksn terjadinya kerusakanzat-zat yang ada dalam
bahan selama dalam pemrosesan,maka ditambahkan vitamin-vitamin tertentu.
b. Menyedapkan rasa dan memberi aroma.
c. Untuk menghambat proses pembusukan.
d. Memberi warna agar bahan makanan menjadi lebih menarik dan Nampak masih segar.
Zat-zat atau campuran zat yang ditambahkan dalam bahan makanan waktu pembuatan,
penyimpanan, dan pengepakan disebut zat aditif.
Penambahan zat –zat aditif pada makanan diperbolehkan selama zat-zat yang ditambahkan ini
tidak membahayakan dan tidak merugikan pemakai. Beberapa fungsi zat aditif yang sering
digunakan pada bahan makanan antara lain :
1. Pengawet
Pengawet adalah yang ditambahkan pada pada bahan makanan agar makanan tetap segar, baud
an rasa tidak berubah. Zat-zat yang sering digunakan sebagai pengawet antar lain :
a. Butil Hidroksi Anisola (BHA) dan Butil Hidroksi Toluena (BHT).
BHA dan BHT ditambahkan pada makanan kaleng sebagai zat anti oksidan, bertujuan untuk
mencegah terjadinya peristiwa oksidasi oleh oksigen di udara. Penambahan BHA dan BHT pada
kentang menyebabkan kentang lebih tahan lama.
b. Natrium Benzoat, asam benzoate, asam propionate, gas SO2. Zat-zat ini dapat mencegah
pembusukan karena mikroba-mikroba. Asam benzoate dan asam propionate dapat membantu
member rasa asam pada makanan, misalnya sari buah,. Natrium benzoat dapat menyebabkan
warna daging tetap merah segar (tidak pucat).

2. Pemberi rasa (penyedap rasa)

Pemberi rasa atau pnyedap rasa ialah zat yang ditambahkan pada makanan agar makanan lebih
sedap rasanya atau mwemberi rasa tertentu misalnya pemanis. Zat-zat yang biasa digunakan
sebagai pemberi rasa antara lain :
a. Monosodium Glutamat (MSG)
Zat ini ditambahkan pada makanan untuk member rasa gurih pada makanan. MSG misalnya
terdapat pada vetsin.

b. Sakarin, Dulsin, dan Natrium Siklamat

Zat-zat ini ditambahkan pada makanan untuk member rasa manis sebagai pengganti gula tebu.
Sakarin mempunyai derajat kemanisan 500 x gula tebu. Dulsin mempunyai derajat kemanisan
250 x gula tebu.
c. Penambah Aroma
Zat-zat yang digunakan kedalam makanan agar aroma dari makanan tetap seperti masih segar.
Hal ini dapat terjadi karena mungkin dalam proses pengolahan aroma aslinya menjadi hilang
atau berkurang. Sering pula zat penambah aroma dimasukkan dalm makanan untuk tiruan
 saja.Umumnya zat-zat penambah aroma yang sering digunakan adalah senyawa-senyawa dari
golongan Ester.

d. Penambah Gizi
Zat-zat yang ditambahkan disini bertujuan untuk meningkatkan nilai gizi dari bahan makanan.
Hal ini dapat terjadi karena mungkin dalam proses pengolahan mineral-mineral dari vitamin
yang ada pada makanan tersebut terbuang atau terurai karena pencucian dan sebagainya. Zat
aditif yang ditambahkan untuk meningkatkan nilai gizi bahan makanan antara lain :
 Vitamin A, B, D, misalnya pada susu
 Vitamin C pada sari buah
 Mineral-mineral tertentu seperti Ca2+, Mg2+, Fe3+ pada berbagai jenis minuman atau makanan
kaleng
 Yodium pada garam

e. Pewarna
Zat pewarna ditambahkan pada makanan / minuman dengan tujuan menambah daya tarik pada
konsumen. Zat pewarna yang sering digunakan pada makanan hasil industry dibedakan menjadi :

1. Bahan Pewarna Alami

Bahan pewarna ini diperoleh dari tumbuh-tumbuhan (nabati ) seperti warna hijau dari klorofil
(daun suji), warna coklat dari gula yang dihanguskan, warna ungu dari kulit anggur, warna
kuning dari wortel, dan lain-lain.Umumnya zat pewarna alami tidak menimbulkan efek samping
yang merugikan pemakai.
2. Bahan Pewarna Sintesis
Bahan pewarna sintesis yaitu bahan pewarna yang dibuat manusia. Ada 8 zat warna yang
diperkenankan oleh badab FDA (Food and Drug Administration) yaitu :
1. Alluna merah
2. Eritrosin
3. Biru brilian FCF
4. Indigo karmin
5. Kuning sumzet
6. Tartrazin
7. Hijau fast FCF
8. Benzyl violet
Pemakaian zat warna yang berlebihan dapat membahayakan pemakainya . Diduga pemakaian zat
warna yang berlebihan dapat menimbulkan Karsinogen (penyebab kanker) Tentu saja ke- 8 zat
pewarna yang diperkenankan untuk dipakai telah diuji sebelumnya dan dinyatakan tidak
membahayakan pemakainya.

f. Pengatur pH
Salah satu factor yang menentukan stabil atau tidaknya komponen zat-zat dalam makanan adalah
pH dari cairan dalam makanan tersebut. Zat biasa yang digunakan untuk menstabilkan pH
larutan pada makanan adalah Natrium Karbonat.

Diposkan oleh hartini srikui di 01.05

Kirimkan Ini lewat EmailBlogThis!Berbagi ke TwitterBerbagi ke FacebookBagikan ke Pinterest

Tidak ada komentar:

Poskan Komentar

Posting Lebih Baru Posting Lama Beranda

Langganan: Poskan Komentar (Atom)

Mengenai Saya

hartini srikui
Lihat profil lengkapku

Arsip Blog
 ▼ 2013 (5)
o ▼ Februari (5)
 Analisis Proksimat
 Hamabatan dalam Komunikasi
 Membuat Hidup Menjadi Lebih Indah

Template Picture Window. Gambar template oleh Juxtagirl. Diberdayakan oleh Blogger.