Pengembangan Energi Baru dan Terbarukan

Pengembangan Energi Bioenergi

USULAN KEGIATAN PENELITIAN

PENELITIAN DOSEN MUDA

PRETREATMENT MIXED CULTURE BACTERIA

PADA TIPE FERMENTASI ETANOL LIMBAH CAIR PABRIK MINYAK
SAWIT

Tim Peneliti

KETUA : Ivnaini Andesgur, ST, M. Sc NIDN. 0016047703

Sumber Dana : PNBP 2017 (mohon dicek lagi Bu Andes)

FAKULTAS TEKNIK
UNIVERSITAS RIAU
FEBRUARI TAHUN 2017

i
RINGKASAN RENCANA PENELITIAN
Produksi minyak sawit Indonesia merupakan terbesar di dunia dengan total produksi 320 jutan ton
pada tahun 2016. Limbah ini berpotensi untuk dimanfaatkan sebagai substrat pembentukan etanol
karena memiliki konsentrasi senyawa organik (COD) > 25.000 mg/L. Hasil penelitian sebelumnya
menunjukkan pretreatment pemanasan dan aerasi berulang terhadap biomassa/inokulan berhasil
meningkatkan pembentukan etanol dari proses asidogenesa glukosa. Namun demikian
pengaruhnya terhadap limbah cair industri minyak sawit yang terdiri dari pati, minyak/lemak dan
protein belum banyak dipelajari.

Penelitian yang akan dilakukan saat ini bertujuan untuk mempelajari pengaruh pretreatment
inokulan terhadap pembentukan etanol dan asam lemak volatil. Pretreatment yang akan dilakukan
pada inokulan adalah dengan proses pemanasan pada temperatur 35, 75 dan 100 oC dan aerasi
berulang selama 25, 12 dan 6 jam.

Penelitian ini memberikan kontribusi ilmiah dalam pengembangan proses biokimia tahap
asidogenesa untuk mengendalikan dan mengendalikan jalur (pathway) biodegradasi limbah cair
minyak sawit terhadap pembentukan etanol dan asam lemak volatile. Selain itu, penelitian ini akan
berdampak pada peningkatan nilai ekonomis limbah cair agro industri dengan merekoveri etanol,
di mana selama ini limbah tersebut belum dimanfaatkan secara optimal.

ii
 HALAMAN PENGESAHAN PENELITIAN
1. Judul
2. Ketua Peneliti
a. Nama Lengkap
b. Jenis Kelamin
c. NIDN
d. Jabatan structural
e. Jabatan Fungsional
f. Fakultas/Program Studi
g. Alamat Kantor
h. Telp/Fax
i. Alamat Rumah
j. Hp/telp/E-mail
Anggota (1)
a. Nama Lengkap
b. Jabatan Fungsional
c. NIDN
Jangka Waktu Penelitian
Pembiayaan
- Dana diusulkan/disetujui
- Sumber Dana Penelitian
Mengetahui
Dekan Fakutas Teknik
(Prof. Dr.Adrianto Ahmad, MT)
NIP 19581018 198703 1 001
Pretreatment Bakteri Kultur Tercampur Anaerob pada Tipe
:
Fermentasi Etanol Limbah Cair Pabrik Minyak Sawit
:
: Ivnaini Andesgur, ST., M.Sc
: Perempuan
: 0020048407
: IIIb
: Asisten Ahli
: Teknik/Teknik Lingkungan
: Kampus Bina Widya Km. 12,5 Simpangbaru, Pekanbaru
0761-66595/076166595
Jl. Rowobening 1 No. 7 Arengka Atas Kel. Sidomulyo Barat .
:
Tampan, Pekanbaru
081328040133/ivnainiandesgur@ymail.com,
ivnaini.andesgur@unri.ac.id
:
: Zulfansyah, ST, MT
Lektor
:
: Tahun ke 1dari rencana 2 tahun
:
: Rp 20.000.000 (dua puluh juta rupiah)
: DIPA LPPM UNIVERSITAS RIAU Tahun 2017
Pekanbaru, 08 Februari 2017
Ketua Tim Pengusul,
( Ivnaini Andesgur, ST.,M.Sc )
NIP. 19840420 201212 2 001
Menyetujui,
Ketua LPPM Universitas Riau
(Prof. Dr. Almasdi Syahza, SE.,MP)
NIP. 19600822 199002 1002
iii
 DAFTAR ISI

RINGKASAN RENCANA PENELITIAN .............................................................................. ii

HALAMAN PENGESAHAN PENELITIAN ......................................................................... iii
DAFTAR ISI ........................................................................................................................ iv
DAFTAR GAMBAR ............................................................................................................... vi
DAFTAR TABEL .................................................................................................................... vi
Daftar Lampiran ...................................................................................................................... vii
A. LATAR BELAKANG PENELITIAN ............................................................................. 1
B. RUMUSAN MASALAH ................................................................................................. 2
C. Maksud dan Tujuan Penelitian......................................................................................... 3
D. LUARAN DAN MANFAAT PENELITIAN .................................................................. 3
E. TINJAUAN PUSTAKA .................................................................................................. 4
E.1 Proses Pengolahan Anaerob ........................................................................................... 4
E.2 Fase Asidogenesa Proses Biodegradasi Anaerob ........................................................... 5
E.2.1 Tipe Fermentasi Etanol ....... ............. 6
E.2.2 Tipe Fermentasi Laktat ....... ............. 7
E.2.3 Tipe Fermentasi Butirat ....... ............. 7
E.2.4 Tipe Fermentasi Propionat ....... ............. 8
E.2.5 Fermentasi Format ....... ............. 8
E.2.6 Fermentasi Asetat ....... ............. 8
E.3 Penelitian Terdahulu ....................................................................................................... 9
E.3.1 Penambahan Ion Logam ....... ............. 9
E.3.2 Pengaruh Tekanan Parsial Biogas ....... ........... 10
E.3.3 Pretreatment Pemanasan dan Aerasi Berulang ....... ........... 10
F. METODE PENELITIAN............................................................................................... 11
F.1 Limbah cair yang digunakan dalam penelitian ............................................................. 11
F.2 Sumber inokulan dan Pretreatment ............................................................................... 12
F.3 Bioreaktor dan Rencana Penelitian ............................................................................... 12
F.4 Percobaan pengaruh pretreatment pembentukan etanol ............................................... 13
F.5 Analisis Data ................................................................................................................. 14
iv
G. JADWAL KEGIATAN ................................................................................................. 15
H. Rekapitulasi Biaya ......................................................................................................... 15
I. SUSUNAN ORGANISASI dan PEMBAGIAN TUGAS TIM PENELITI ................... 15
J. JUSTIFIKASI ANGGARAN PENELITIAN ................................................................ 15
K. LAMPIRAN ................................................................................................................... 16
L. DAFTAR PUSTAKA .................................................................................................... 17

v
 DAFTAR GAMBAR
Gambar E.1 Jalur utama metabolisme selama fermentasi anaerob oleh kultur campuran
dari substrat kompleks. ..................................................................................... 5
Gambar F.1 Rangkaian reaktor penelitian .......................................................................... 12
Gambar F.2 Diagram Alir Metodologi Penelitian .............................................................. 13

DAFTAR TABEL
Tabel E.1 Pengaruh Penambahan Ion Logam Terhadap Pembentukan Etanol ................. 9
Tabel E.2 Pengaruh pretreatment pemanasan terhadap pembentukan etanol ................. 11
Tabel E.3 Pengaruh pretreatment aerasi berulang terhadap pembentukan etanol ........... 11
Tabel F.1 Matriks penelitian pretreatment inokulan untuk pembentukan etanol ............ 13

vi
DAFTAR LAMPIRAN

vii
A. LATAR BELAKANG PENELITIAN
Bioetanol merupakan bahan bakar nabati cair yang paling banyak digunakan (Demirbas, 2005)
dan dapat mengurangi ketergantungan terhadap bahan bakar fosil, mengurangi polusi udara dan
perubahan iklim global akibat penumpukan karbon dioksida (Wu dkk., 2007; Murdiyatmo, 2006;
Demirbas, 2005). Ketersediaan bahan baku yang murah dan tidak tergolong sebagai bahan pangan
manusia merupakan salah satu kendala dalam industri etanol (Alam dkk., 2009; Murdiyatmo,
2006), yang saat ini menggunakan ubi kayu, molasses, jagung dan gula (Tjakrawan, 2008; Dillon
dkk., 2008). Untuk mengatasi permasalahan tersebut dapat dilakukan pemanfaatan limbah cair
yang mengandung senyawa organik konsentrasi tinggi hasil aktivitas agro industri, seperti limbah
cair industri minyak sawit, yang memiliki konsentrasi chemical oxygen demand (COD) di atas
4.000 mg/L melalui proses anaerob (Grady dkk., 1999). Keberadaan limbah cair ini sangat banyak
di Indonesia yang merupakan produsen utama minyak mentah sawit dengan produksi pada tahun
2016 sebesar 320 juta ton CPO. Proses basah yang digunakan untuk produksi minyak mentah sawit
membutuhkan 5 – 7,5 ton air/ton minyak sawit dan lebih dari 50 % dari air tersebut akan berakhir
sebagai limbah cair (Ahmad dkk., 2003).

Sebagai produk tahap asidogenesa, etanol yang dihasilkan dari oleh bakteri kultur tercampur akan
disertai berbagai produk lainnya seperti asam asetat, laktat, butirat, propionat dan valerat (Andrio
dkk., 2015; Andrio dkk., 2013, Ren dkk., 2007), sehingga untuk mengoptimalkan pembentukan
etanol perlu dilakukan upaya untuk menekan produk asam-asam tersebut. Beberapa metoda yang
telah dilakukan adalah dengan pengaruh rentang pH (Wu dkk., 2016; Andrio dkk., 2015, Temudo
dkk., 2008; Ren dkk., 2007), penambahan trace element (Yu dkk., 2001; Yenigün dkk., 1996;
Moon dkk., 2011; Rogers dkk., 2006; Presecki dan Racki, 2004), mengendalikan tekanan parsial
hidrogen (Syafila dkk., 2010; Kim dkk. 2006; Mizuno dkk. 2000). Meskipun dapat meningkatkan
produksi etanol, metoda-metoda tersebut membutuhkan pemakaian bahan kimia dan gas secara
kontinyu.

Untuk mengatasi permasalahan tersebut, pada penelitian ini akan dilakukan perlakuan
pendahuluan (pretreatment) terhadap inokulum bakteri kultur tercampur untuk meningkatkan
pembentukan etanol dari limbah cair produksi minyak sawit. Bakteri kultur tercampur terdiri dari
berbagai konsorsium bakteri dengan fungsi masing-masing yang saling terkait dan keberadaan

1
konsorsium bakteri tertentu dapat bervariasi (Wu dkk., 2014). Perlakuan terhadap inokulum dapat
memberikan pengaruh yang berbeda terhadap pembentukan etanol dan asam-asam volatil dari
berbagai substrat (Lee dan Lee, 2014; Wong dkk., 2014; Wu dkk., 2014; Ren dkk., 2008).
Mohammadi dkk (2011) melakukan pretreatment limbah cair industry minyak sawit, namun
demikian pengaruhnya terhadap pembentukan etanol masih terbatas dan perlu ditelili lebih lanjut.

B. RUMUSAN MASALAH
Mikro organisme yang terdapat pada seed sludge lebih menguntungkan dari pada kultur murni
karena kemampuannya lebih adaptif terhadap tekanan lingkungan seperti substrat terbatas,
perubahan pH, temperatur dan keragaman mikroflora di dalam seed sludge menyebabkan terjadi
interaksi sinergis untuk meningkatkan degradasi substrat. Pretreatment terhadap inokulum bakteri
anaerob bertujuan untuk mempercepat tahapan hidrolisis dan meningkatkan biodegradasi anaerob
sehingga meningkatkan pembentukan biogas, terutama H2 (Kim et al., 2003; Zhu and Beland,
2006; Mohan et al., 2007; Ren dkk., 2008) yang pembentukannya berkaitan dengan tipe fermentasi
butirat maupun etanol (Zhang dkk., 2015; Ren dkk., 1997; Ren dkk., 2007; Ren dkk., 2008).
Tipe fermentasi etanol memberikan keuntungan karena lebih mudah terkonversi menjadi asetat
(Ren dkk., 1997) dan disertai dengan pembentukan asetat sebagai asam volatil dominan yang akan
memberikan keuntungan jika proses dilanjutkan ke tahap metanogenesa (Zhang dkk., 2015; Chang
dkk., 2011; Wang dan Wan, 2008; Ren dkk., 1997; Ren dkk., 2008). Beberapa metode
pretreatment inokulum bakteri kultur tercampur untuk meningkatkan pembentukan etanol dapat
berupa proses pemanasan, dan aerasi berulang.

Pretreatment pemanasan pada proses fermentasi glukosa dapat meningkatkan pembentukan etanol
pada temperatur 37 dan 30 oC (Zhang dkk., 2015) dan 100 oC (Wang dan Wan, 2008). Kontradiktif
dengan Wang dan Wan (2008), pada kondisi termofilik 60, 80 dan 85 oC (Baghchehsaraee dkk.,
2008), 95 oC (Chang dkk., 2011), 121 oC (Ren dkk., 2008) tidak berpengaruh terhadap
pembentukan etanol namun lebih berpengaruh terhadap pembentukan asam asetat dan butirat.
Perbedaan ini dapat disebabkan oleh sumber inokulum yang digunakan dan hubungan antara
temperatur dan lama pemanasan (Wong dkk., 2014). Sementara itu, metode aerasi berulang
memberikan hasil yang signifikan terhadap pembentukan etanol dari proses fermentasi glukosa
(Chang dkk., 2011; Ren dkk., 2008; Wang dan Wan, 2008; Ren dkk., 2007).

2
Meskipun pretreatment pemanasan dan aerasi berulang berpengaruh terhadap pembentukan etanol
pada substrat tunggal (glukosa), namun pengaruhnya terhadap kompleks substrat seperti limbah
cair industri minyak sawit yang terdiri dari pati, protein, minyak/lemak belum banyak dipelajari
sehingga perlu diteliti lebih lanjut agar limbah tersebut yang tingkat ketersediaannya sangat tinggi
di Indonesia dapat dimanfaatkan lebih optimal.

C. MAKSUD DAN TUJUAN PENELITIAN

Maksud dari penelitian ini adalah mengembangkan potensi limbah cair industri minyak sawit
sebagai substrat pembentukan etanol yang murah dan ketersediaannya sangat banyak di Indonesia.
Adapun tujuan umum dari penelitian ini adalah mempelajari pengaruh pretreatment pemanasan
dan aerasi berulang terhadap pembentukan etanol dari limbah cair indutsri minyak sawit.

Adapun tujuan khusus penelitian ini adalah sebagai berikut :

1. Mempelajari pengaruh pretreatment pemanasan dengan variasi pemanasan 35, 55 dan 100 o C
terhadap pembentukan etanol dari proses biodegradasi limbah cair industri minyak sawit oleh
bakteri kultur tercampur anaerob.
2. Mempelajari pengaruh waktu pretreatment aerasi berulang terhadap pembentukan etanol dari
proses biodegradasi limbah cair industri minyak sawit oleh bakteri kultur tercampur anaerob.

D. LUARAN DAN MANFAAT PENELITIAN

Luaran dari penelitian ini adalah artikel ilmiah untuk jurnal nasional dan pengayaan bahan ajar.
Adapun manfaat penelitian ini adalah sebagai berikut:
1. Meningkatkan nilai tambah limbah cair industri minyak sawit sebagai substrat pembentukan
etanol oleh bakteri kultur tercampur anaerob,
2. Memperkaya ilmu pengetahuan dan bahan acuan terkait proses asidogenesa dan proses
pembentukan etanol.

3
E. TINJAUAN PUSTAKA
E.1 Proses Pengolahan Anaerob
Proses anaerob merupakan proses biodegradasi senyawa organik dalam limbah pada kondisi tidak
memerlukan molekul oksigen bebas dengan produk akhir berupa metan, karbon dioksida dan sel-
sel baru bakteri dan merupakan proses kompleks yang terdiri dari urutan tahap yang saling
berkaitan antara substrat dan kelompok bakteri yang bekerja di tiap tahapnya. Secara umum proses
anaerob terdiri dari tiga tahap sebagai berikut (Anderson dkk., 2003; Gerardi, 2003; Gradi dkk.,
1999):

a. Hidrolisa

Merupakan proses hidrolisa padatan (partikel dan koloid) menjadi senyawa yang lebih sederhana
dan terlarut dengan bantuan eksoenzim seperti amilase, protease dan lipase. Genus bakteri
hidrolitik diantaranya adalah Clostridium, Peptococcus, Vibrio, Micrococcus dan Bacillus. Produk
dari tahap ini berupa gula monomer, asam lemak dan asam amino yang merupakan substrat tahap
asidogenesa.

b. Asidogenesa dan Asetogenesa

Merupakan tahap proses penguraian gula monomer, asam lemak dan asam amino menjadi asam-
asam volatil (asam asetat, propionat, butirat, valerat), asam non volatil (asam laktat, suksinat) dan
etanol. Selanjutnya produk tersebut, kecuali asam asetat, akan dikonversi menjadi asam asetat,
hidrogen dan CO2 pada tahap asetogenesa.

c. Metanogenesa

Merupakan tahap akhir proses anaerob yakni proses konversi asetat dan H2-CO2 menjadi metan
dan biasa berlangsung pada pH 6,5-8. Kelompok bakteri yang terlibat dapat dikelompokkan
menjadi acetoclastic methanogen dan hydrogen-utilizing metanogen. Bakteri kelompok pertama
menggunakan asam asetat sebagai substrat dan merupakan penyumbang 70% dari total gas metan
yang dihasilkan. Kelompok bakteri ini adalah Methanosaeta dan Methanosarcina dengan waktu
penggandaan berurutan 24 jam dan 3,5-9 hari. Kelompok bakteri ke dua adalah hydrogen-utilizing
metanogen dengan substrat gas H2-CO2 yang merupakan penyumbang 30% dari total menjadi gas
metan yang dihasilkan. Genus dari kelompok ini antara lain Methanobacterium,
Methanobrevibacter dan Methanoplanus (Gujer dan Zehnder, 1983 dalam Anderson dkk., 2003).

4
E.2 Fase Asidogenesa Proses Biodegradasi Anaerob

Limbah cair yang digunakan dalam penelitian ini merupakan limbah cair organik kompleks yang
mengandung senyawa pati, protein, minyak dan lemak. Bakteri kultur campuran anaerob yang
terdiri dari berbagai konsorsium bakteri akan mendegradasi senyawa tersebut pada tahap hidrolisis
untuk membentuk senyawa yang lebih sederhana seperti glukosa, asam amino dan gliserol dengan
bantuan enzim amilase, protease dan lipase. Kemudian, produk-produk tersebut akan dikonversi
menjadi asam piruvat yang merupakan sentral produk intermediet fermentasi. Jalur degradasi
piruvat menentukan produk utama atau tipe fermentasi yang terjadi pada tahap asidogenesa seperti
pada Gambar E.1.
Umumnya, tipe fermentasi pada fasa asidogenesa dapat berupa tipe fermentasi asam butirat, tipe
asam propionat (Cohen dkk., 1994 dalam Ren dkk., 2006) dan tipe etanol (Ren dkk., 1997). Tipe
fermentasi butirat dicirikan dengan produksi asam butirat dan asetat ditambah gas hidrogen dan
karbon dioksida; tipe fermentasi propionat dengan produk dominannya asam propionat, asetat,
valerat dalam kecil dan produk gas sedikit. Sedangkan tipe fermentasi etanol dicirikan dengan
produk utama etanol, asam asetat, hidrogen dan karbon dioksida (Ren dkk., 1997).
KOMPLEKS
MINYAK/LEMAK PEPTON
KARBOHIDRAT

C6H12O6 Asam-asam
GLISEROL
amino
1 2
3
Gliseraldehid-
CO2 CO2
3-Fosfat
Etanol
2CH3CH2OH 12
11 4

Asetil CoA 7 PIRUVAT 5 Asam Laktat

(2CH3COSCoA) (2CH3COCOH) 2CH3CHOHCOOH
Asam Asetat 2FdH2 2Fd
2CH3COOH
10 9 8 6

Asam Butirat Asam Format Asam Propionat

2H2
2CH3(CH2)2COOH HCOOH 2CH3CH2COOH

Gambar E.1 Jalur utama metabolisme selama fermentasi anaerob oleh kultur campuran dari
substrat kompleks (modifikasi dari Temudo dkk., 2008; Kosaric dan Sukan 2001; Ren dkk., 1997;
Gottschalk, 1986).
Keterangan : Angka dalam lingkaran menyatakan tahapan pembentukan produk.
: Jalur pembentukan etanol bakteri kultur campuran (yang diteliti)
: Jalur pembentukan etanol organisme melalui Piruvat Dekarboksilase (PDC)

5
Dari jalur metabolisme Gambar E.1 terlihat bahwa asam piruvat akan terdegradasi membentuk
asam propionat dan laktat atau terdegradasi menjadi asetil-CoA yang selanjutnya untuk
membentuk asam asetat, butirat dan etanol. Produk metabolisme yang terbentuk dari degradasi
substrat pada Gambar E.1 adalah sebagai berikut :

E.2.1 Tipe Fermentasi Etanol

Bakteri sakarolitik penghasil etanol dapat dibedakan berdasarkan jalur konversi piruvat menjadi
prekursor pembentukan etanol. Kelompok pertama mengonversi piruvat menjadi asetil-CoA dan
CO2 yang selanjutnya akan dikonversi menjadi asetaldehid oleh aldehidehidrogenase (jalur angka
1-2-3-4-7-11 Gambar II.3). Jalur ini digunakan oleh mayoritas bakteri fermentatif dan merupakan
jalur fermentasi bercabang dan menghasilkan berbagai produk fermentasi. Adapun reaksi
pembentukan etanol adalah sebagai berikut (Kim dan Gadd, 2006; Roger dkk., 2006; Gottschalk,
1986):
piruvat : ferredoksin
oksidoreduktase
CH3–CO–COOH + Fd CH3–CO-CoA + Fd.H2 (E.1)

CoA-SH CO2
Aldehid dehidrogenase
CH3–CO–CoA+NADH + H+ CH3–CHO+NAD+ (E.2)

Alkohol dehidrogenase
CH3–CHO + NADH + H+ CH3–CH2OH + NAD+ (E.3)
Selanjutnya, asetaldehid akan direduksi menjadi etanol. Jalur glukosa-etanol dan gliserol-etanol
pada rangkaian reaksi 1-2-3-4-7-11 Gambar II.3 dapat ditulis sebagai berikut:
C6H12O6 + 2H2O 2C2H5OH + 2HCO3- + 2H+ (E.4)
C3H8O3 + H2O C2H5OH + HCO3- + H+ + H2 (E.5)
Degradasi protein oleh kultur campuran anaerob menghasilkan asam asetat, butirat dan protein
tanpa etanol (Tang dkk., 2005). Kelompok bakteri penghasil etanol dapat dilihat pada Tabel II.3.
Kelompok ke dua mengonversi piruvat langsung menjadi asetaldehid dan CO2 dengan bantuan
enzim piruvat dehidrogenase dan direduksi menjadi etanol dengan bantuan enzim alkohol
dehidrogenase (jalur angka 1-2-3-4-12 pada Gambar E.1). Jalur ini merupakan jalur fermentasi
linear dan digunakan oleh Zymomonas mobilis, Sarcina ventriculi, Erwinia amylovora, bakteri
asam asetat dan Saccharomyces cerevisiae tanpa produk samping kecuali air dan CO2. Adapun
reaksi pada jalur ini sebagai berikut :

6
 Piruvat dekarboksilase
CH3–CO–COOH CH3–CHO + CO2 (E.6)

Alkohol dehidrogenase
CH3–CHO + NADH + H +
CH3–CH2OH + NAD+ (E.7)
Jalur glukosa-etanol pada Saccharomyces cerevisiae ditulis sebagai berikut (Kosaric dan Sukan
2001) :
C6H12O6 2 C2H5OH + 2 CO2 + 2ATP (E.8)

E.2.2 Tipe Fermentasi Laktat

Laktat merupakan produk fermentasi yang sering terbentuk dari fermentasi berbagai jenis
mikroorganisme. Pada fermentasi anaerob karbohidrat dan minyak/lemak, asam laktat terbentuk
dari rangkaian reaksi 1-2-3-4-5 pada Gambar E.1 dengan bantuan enzim laktat dehidrogenase.
Fermentasi glukosa oleh bakteri asam laktat dari jalur homofermentatif hanya menghasilkan asam
laktat. Spesies utama yang menggunakan jalur ini diantaranya adalah Lactobacillus delbrueckii,
L. lactis, L. bulgaricus, L. casei, L. curvantus, L. plantarum, Sporolactobacillus inulinus,
Pediococcus damnosus, Enterococcus faecalis dan Lactococcus lactis (Kim dan Gadd, 2006)
dengan reaksi sebagai berikut. Laktat dehidrogenase menjadi aktif pada kondisi asam sehingga
menghasilkan laktat sebagai produk utama fermentasi. Sedangkan pada kondisi alkali,
homofermentasi bakteri penghasil laktat akan menghasilkan asetat dan etanol dalam jumlah yang
besar. Adapun reaksi fermentasi homolaktat adalah sebagai berikut:
jalur homofermentasi
C6H12O6 2 CH3CHOHCOOH (E.9)

E.2.3 Tipe Fermentasi Butirat

Asam butirat (CH3CH2CH2COOH) merupakan produk utama fermentasi beberapa spesies

clostridia (Gottschalk, 1986). Umumnya, hanya bakteri obligat anaerob yang menghasilkan asam
butirat sebagai produk utama fermentasinya seperti Butyribacterium methylotrophicum,
Butyrivibrio fibrisolvens, Clostridium butyricum, C. kluyveri, C. pasteurianum, Eubacterium
limosum, Fusobacterium nucleatum (Kim dan Gadd, 2006; Gottschalk, 1986).
Adapun persamaan pembentukan asam butirat adalah sebagai berikut:
C6H12O6 CH3CH2CH2COO- + 2CO2 + 2H2 +H+ (E.10)

7
2C3H8O3 CH3CH2CH2COO-+ 2CO2 + 3H2 + 3H+ (E.11)

(CH2)2CHCH2(NH2)COOH+3H2O CH3CH2CH2COO- +2HCO3-+H++

NH4++H2 (E.13)

E.2.4 Tipe Fermentasi Propionat

Bakteri penghasil asam propionat, genus Propionibacterium, Clostridium propionicum dan

Megasphaera elsdenii dapat memfermentasi glukosa dan laktat menjadi asam propionat, asetat
dan CO2 seperti pada reaksi berikut (Kim dan Gadd, 2006; Gottschalk, 1986).
3 C6H12O6  4CH3CH2COOH + 2 CH3COOH + 2 CO2 (E.14)
3 CH3CHOHCOOH  2CH3CH2COOH + CH3COOH + CO2 (E.15)

Bakteri penghasil propionat lebih menyukai substrat asam laktat dibandingkan glukosa sehingga
dapat berkembang pada produk akhir fermentasi laktat. Asam propionat dapat dihasilkan baik
melalui jalur akrilat maupun suksinat-propionat dengan reaksi sebagai berikut:

E.2.5 Fermentasi Format

Dekomposisi piruvat akan membentuk asam format dan asetil-CoA dengan reaksi sebagai berikut
(Gottschalk, 1986):
CH3COCOOH  HCOOH + CH3–CO-CoA (E.16)
(asam piruvat) (asam format) (asetil-CoA)

E.2.6 Fermentasi Asetat

Bakteri anaerob menghasilkan asam asetat melalui jalur konversi piruvat ke asetil-CoA yang
selanjutnya terdekomposisi membentuk asetil fosfat dan dengan bantuan asetat kinase membentuk
asam asetat. Jalur glukosa-asam asetat dan gliserol asam asetat digambarkan dengan rangkaian
reaksi 1-2-3-4-7-10 pada Gambar E.1 dengan reaksi sebagai berikut :
C6H12O6 + 4H2O 2CH3COO- + 2HCO3- + 4H+ + 4H2 (E.17)
C3H8O3 + 2H2O CH3COO- + HCO3- + 2H+ + 3H2 (E.18)
2CH2(NH2)COOH + 4H2O CH3COO- + 2HCO3- + 2NH4+ + 2H2 + H+ (E.19)
Selain dari jalur ini, asam asetat juga dihasilkan dari konversi etanol dan asam-asam volatil dengan
reaksi sebagai berikut (Anderson dkk., 2006):
Etanol  Asetat : CH3CH2OH + H2O  CH3COO- + 2H2 + H+

8
Butirat  Asetat : CH3CH2 CH2COO- + 2 H2O 2 CH3COO- + 2H2 + H+
Laktat  Asetat : CH3CHOHCOO- +2H2O CH3COO- + HCO3- + 2H2 +H+
Propionat  Asetat : CH3CH2COO- +3H2O  CH3COO- +HCO3- +3H2 +H+

E.3 Penelitian Terdahulu

Beberapa metode telah dilakukan untuk meningkatkan pembentukan etanol dari tahap asidogenesa
adalah sebagai berikut.

E.3.1 Penambahan Ion Logam

Ion-ion logam berbeda afinitasnya terhadap biomolekul dan kekuatan ikatan dinyatakan dengan
skala kekerasan (hardness scale). Menurut klasifikasi Pearson, ion asam kuat (hard acid) seperti
Na2+, Mg2+ dan Ca2+, memiliki muatan positif tinggi dan tidak memiliki pasangan elektron dengan
bagian terluar sel. Soft acid memiliki muatan positif rendah dan mengandung pasangan elektron p
dan d yang tidak dapat ditukar (Burton, 2005). Konsentrasi logam terlarut di dalam digester
anaerob, dinyatakan sebagai bioavailabel, biasanya berjumlah 0,5-4% dari total konsentrasi
(Oleszkiewicz dan Sharma, 1990). Kebutuhan logam besi, nikel, kobal dan zinc untuk bakteri
mesofilik anaerob berurutat sebesar 0,20; 0,0063; 0,017 dan 0,049 mg/gr COD yang disisihkan
(Takashima, 2011). Aktivitas enzim dipengaruhi oleh ketersediaan logam ko-faktor. Secara umum,
ion Fe dan Zn digunakan sebagai ko-faktor enzim seperti pada Tabel II.4.
Tabel E.1 Pengaruh Penambahan Ion Logam Terhadap Pembentukan Etanol
Unsura Sumbera Kebutuhan Pengaruh Penambahan Logam Terhadap Produksi Ref.
(mg)b Etanol
Produksi
Mikro Elemen Organisme
Eanol
Fe Fen+ 0,015 Clostridium ragsdalei + 1
Clostridium thermohydrosulfuricum + 4
Kultur campuran anaerob + 5
Mn Mn2+ 0,005 Clostridium ragsdalei + 1
Zn2+ Clostridium ragsdalei + 1
Zn 0,005 Thermophilic anaerobic, T. ethanolicus + 2
(JW200) dan T. thermohydrosulfuricus
Schizosaccharomyces prombe dan + 3
Saccharomyces cerevisiae
a, b
Burton, 2005; b Perkiraan jumlah yang dibutuhkan untuk memproduksi 100 gram berat kering sel bakteri. td : tidak
ada data. Referensi : 1. Saxenan dan Tanner, 2010; 2. Avci dan Domnez, 2006; 3. Zhao dkk., 2009; 4. Park dkk.,
1992; 5. Azenha dkk., 2000. + : meningkatkan produksi etanol; = : tidak berpengaruh terhadap produksi etanol; - :
menghambat produksi etanol

9
E.3.2 Pengaruh Tekanan Parsial Biogas

Tekanan parsial hidrogen (pH2) dalam fasa asidogenesa akan mempengaruhi pola pembentukan
produk akhir dari glukosa (Fynn dan Syafila, 1990) dan merupakan faktor yang mempengaruhi
tipe fermentasi etanol (Li dkk., 2007). Hidrogen dihasilkan cukup signifikan pada tahap
asidogenesa fermentasi molases, yakni sekitar 50% (Ren dkk., 2006; Wang dkk., 2006; Ren dkk.,
1997; Ren dkk., 2007). Meskipun etanol tetap dihasilkan dengan baik pada pH2 50 kPa, namun
sebaiknya dihilangkan untuk mencegah penurunan laju metabolik (Ren dkk.,1997). Etanol dapat
terakumulasi hanya pada pH2 lebih dari 104 Pa dan pada pH2 di bawah 104 Pa, etanol akan
terkonversi menjadi asam asetat (Li dkk., 2007). Meningkatnya konsentrasi H2 akan menurunkan
sintetis H2 yang berakibat pada perubahan jalur metabolik sehingga akan dihasilkan lebih banyak
produk substrat tereduksi seperti laktat, etanol, aseton, butanol atau alanin (Levin dkk., 2004).

Keberadaan gas CO2 juga mempengaruhi konsentrasi etanol yang dihasilkan (Wang dkk., 2007;
Dixon dkk., 1987). Kenaikan tekanan parsial gas karbon dioksida (pCO2) dapat menurunkan
konsentrasi etanol dan asam asetat berurutan sebesar 35 % dan 30% (Wang dkk., 2007). Menurut
Dixon dkk., (1987), produksi etanol oleh Clostridium sporogenes dalam media asam amino
esensial/asam lemak dipengaruhi oleh pCO2. Saat pCO2 rendah, laju reaksi dekarboksilase
menurun signifikan yang akan meningkatkan level piruvat. Untuk menurunkan konsentrasi piruvat
dan menghilangkan kelebihan equivalen, maka akan dihasilkan asam laktat. Sedangkan pada pCO2
tinggi, reaksi dekarboksilase (misalnya reaksi piruvat menjadi Asetil-CoA) akan terhambat dan
dengan demikian akan menghambat pembentukan asam asetat.

E.3.3 Pretreatment Pemanasan dan Aerasi Berulang

Pretreatment biomassa telah dilakukan pada proses substrat tunggal dan berbagai sumber
inokulan. Zhang dkk (2015) menyatakan perubahan pretreatment biomassa mempengaruhi
keragaman komunitas mikroba yang terlibat dalam proses fermentasi. Adapun perbedaan
penelitian yang akan dikerjakan dengan penelitian terdahulu disimpulkan pada Tabel E.2 dan E.3.

10
Tabel E.2 Pengaruh pretreatment pemanasan terhadap pembentukan etanol
Sumber Metoda
No Subsrat Hasil Ref
Inokulan Pemanasan
Anaerobic 100 oC selama Peningkatan produksi etanol 24%.
1 Glukosa 1
digester 15 menit Produk utama etanol dan asetat
Secondary 95 oC selama Peningkatan produksi etanol 0,08%.
2 Glukosa 2
settling tank 30 menit Produk utama etanol, asetat dan butirat
Limbah cair Sludge POME 100 oC selama Tidak ada produk cair metabolism
3 3
minyak sawit treatment 1 jam
Etanol tertinggi 1.250 mg/L pada T 30
o
Aeration C. Produk utama berupa etanol, asetat.
Kondisi 4
activated sludge Propionat, format dan butirat dibawah
Gula dari operasi pada
400 mg/L
4 tongkol temperatur 30,
Etanol tertinggi 800 mg/L pada T 37 oC.
jagung 37, 55 dan 75
Anaerobic o Produk utama berupa etanol, asetat.
C 4
granular sludge Propionat, format dan butira dibawah
300 mg/L
Penurunan pembentukan etanol, 3 kali
Secondary 121 oC selama
5 Glukosa lebih kecil dari pada kontrol. Produk 5
settling tank 20 menit
utama berupa asetat dan butirat.
1. Wang dan Wan (2008); 2. Chang dkk (2011); 3. Mohammadi dkk (2011); 4. Zhang dkk (2015); 5. Ren dkk (2008)

Tabel E.3 Pengaruh pretreatment aerasi berulang terhadap pembentukan etanol

Sumber
No Subsrat Metoda Pemanasan Hasil Ref
Inokulan
Anaerobic Peningkatan produksi etanol 53%.
1 Glukosa Aerasi 24 jam 1
digester Produk utama etanol dan sedikit asetat
Secondary Peningkatan produksi etanol 85%.
2 Glukosa Aerasi 24 jam 2
settling tank Produk utama etanol, asetat dan butirat
Secondary Aerasi kontrol DO Peningkatan pembentukan etanol 67%.
3 Glukosa 3
settling tank (<0,5 mg/L) 12 jam Produk utama berupa asetat dan etanol.
1. Wang dan Wan (2008); 2. Chang dkk (2011); 3. Ren dkk (2008)

F. METODE PENELITIAN
F.1 Limbah cair yang digunakan dalam penelitian

Limbah cair yang digunakan pada penelitian ini adalah limbah cair produksi minyak sawit dari
industri minyak sawit di Provinsi Riau.

11
F.2 Sumber inokulan dan Pretreatment

Inokulan yang digunakan berasal dari kolam ke dua pengolahan limbah cair minyak sawit.
Sebelum digunakan dilakukan penyaringan inokulan untuk mentisihkan debris dan pengotor
lainnya. Kemudian inokulan dibiakkan menggunakan glukosa 10 g/L selama 5 hari. Setelah
inokulan berkembang (ditandai VSS > 2000 mg/L), maka dilakukan proses pemanasan pada 35 oC
selama 1 jam; pemanasan pada 75 oC selama 30 menit; dan pemanasan pada 100 oC selama 15
menit. Sedangkan untuk pretreatment aerasi berulang dilakukan dengan aerasi selama 24 jam; 12
jam dan tiap 8 jam. Setelah pretreatment, inokulan diaklimatisasi bertingkat terhadap limbah cair
minyak sawit dengan variasi glukosa:limbah cair minyak sawit (%, v/v) sebesar 100: 0; 50:50 dan
0:100 (%, v/v). Setelah aklimatisasi selesai dilakukan dilanjutkan ke tahap percobaan selama 72
jam.

F.3 Bioreaktor dan Rencana Penelitian

Bioreaktor yang digunakan dalam peneliltian ini adalah erlemeyer 500 mL dengan laju
pengadukan 150 rpm. Adapun konfigurasi bioreaktor dan diagram alir metoda penelitian serta
matriks penelitian dapat dilihat seperti pada Gambar F.1, F.2 dan Tabel F.1.
4
3

Keterangan gambar: . (1) shaker, (2) erlenmeyer flask; (3) titik sampling; (4) leher angsa (air sealer)
Gambar F.1 Rangkaian reaktor penelitian

12
 Persiapan Reaktor dan Inokulan

Seeding inokulan

Pretreatment dengan pemanasan 35, 75 dan Pretreatment dengan aerasi berulang selama 25,
100 oC dan aklimatisasi inokulan terhadap 12 dan 6 jam dan aklimatisasi inokulan terhadap
limbah cair minyak sawit limbah cair minyak sawit

Analisa COD, VSS, Etanol dan Total Asam Volatil

Pengolahan data dan pembahasan

Selesai

Gambar F.2 Diagram Alir Metodologi Penelitian

Tabel F.1 Matriks penelitian pretreatment inokulan untuk pembentukan etanol

Metode
Kegiatan Tujuan Parameter Diamati
Analisa
Membiakkan
Seeding
inokulan
COD total, terlarut SM 5220C
Pretreatment dengan pemanasan
Seleksi inokulan VSS SM 2540E
35, 75 dan 100 oC dan aerasi
dan adaptasi pH pH meter
berulang selama 24, 12, dan 6
inokulan
jam dan aklimatisasi
COD total dan
Mengetahui SM 5220C
terlarut
Percobaan pembentukan etanol pembentukan SM 2540E
VSS
perlakuan pretreatment etanol, laju pH meter
pH
inokulan penyisihan GC
Etanol
substrat SM 5560C
Total Asam Volatil

F.4 Percobaan pengaruh pretreatment pembentukan etanol

Percobaan pengaruh pemanasan dan aerasi berulang biomassa terhadap pembentukan etanol
(Wang dan Wan, 2008; Chang dkk., 2011; Mohammadi dkk., 2011; Zhang dkk., 2015; Ren dkk.,
2008), namun pengaruhnya terhadap proses asidogenesa limbah cair minyak sawit belum banyak
dikaji sehingga pada penelitian ini, pemanasan akan dicoba pada temperatur 35, 75 dan 100 oC dan
aerasi berulang inokulan selama 24, 12 dan 6 jam. Operasional percobaan secara batch dengan dua
kali pengulangan (duplo) dan pH awal umpan mengikuti pH naturallimbah cair industry minyak

13
sawit (diperkirakan 4-4,5). Pengambilan sampel dilakukan setiap 12 jam dengan lama percobaan
selama 72 jam.
Adapun variabel-variabel penelitian ini adalah sebagai berikut:
Variabel bebas : bakteri kultur campuran anaerob; perbandingan antara biomassa dan limbah cair
industri minyak sawit (30%:70% volume); pH awal asidogenesa 4-4,5; variasi
temperatur pemanasan dan aerasi berulang.

Variabel terikat : pH, reduksi COD total dan terlarut; konsentrasi VSS; konsentrasi etanol dan total
asam volatil.

F.5 Analisis Data

a. Pengaruh pretreatment terhadap pembentukan etanol dilakukan dengan analisis Faktor

𝑉𝑚
⁄𝑉𝑆𝑆
𝑚
Aktivitas (FA %) = 𝑉𝑐 (1)
⁄𝑉𝑆𝑆
𝑐
di mana :
Vm : konsentrasi etanol yang diproduksi dalam 12 jam pada perlakuan percobaan (mg/L),
Vc : konsentrasi etanol yang dihasilkan dalam 12 jam oleh kontrol (mg/L).
MLVSSm : Konsentrasi volatile suspended solids pada penambahan logam (mg/L).
MLVSSc : Konsentrasi volatile suspended solids pada kontrol (mg/L) (Yenigun dkk., 1997)

b. Efektivitas penambahan logam terhadap proses asidogenesa dihitung menurut persamaan Bengtsson
dkk (2008) untuk percobaan batch :
Total Asam volatil (TAV) [mgCOD/L]
Potensi pembentukan asam atau Degree acidification = DA = (2)
COD terlarut 𝑖𝑛𝑓𝑙𝑢𝑒𝑛𝑡 [mgCOD/L]

Produksi TAV (ΔTAV) = produksi TAV maksimum-TAV influen, (3)

Fraksi asam volatil terbentuk terhadap senyawa organik : TAV maksimum/COD terlarut saat TAV
maksimum.
(4)
c. Equivalen produk asidogenesa terhadap COD terlarut (mg/L) dihitung berdasarkan persamaan Van
Haandel dan Van Der Lubbe (2012) :

CODteoritis = 8·(4x+y-2z)/(12x+y+16z) gCOD.g-1 CxHyOz (5)

di mana : x = C; y =H dan z = O

14
G. JADWAL KEGIATAN
BULAN KE
NO KEGIATAN
1 2 3 3 4 4 5 6 5 7 6 8 7 8

Persiapan reaktor penelitian dan

1.
inokulan
2. Pengujian variasi pemanasan
Pengujian pengaruh aerasi
3.
berulang
4. Analisa
5. Penulisan Laporan dan publikasi

H. REKAPITULASI BIAYA

No Item Total (Rp)

1 Belanja pegawai 4,800,000
2 Belanja barang 6,600,000
3 Belanja Jasa 500,000
4 Sewa alat dan jasa layanan 8,100,000
Total 20,000,000

I. SUSUNAN ORGANISASI DAN PEMBAGIAN TUGAS TIM PENELITI

Susunan tim terdiri dari ketua tim dan anggota penelitian. Adapun pembagian tugas adalah sebagai
berikut.
Ketua tim : bertanggung jawab atas keberlangsungan penelitian hingga laporan dan publikasi.
Anggota tim : membantu dalam mengawasi jalan penelitian, penulisan laporan, membantu
pengurusan administrasi terkait pengambilan dan pemeriksaan sampel.

J. JUSTIFIKASI ANGGARAN PENELITIAN

Adapun justifikasi rekapitulasi biaya adalah sebagai berikut.

15
J.1 Belanja Pegawai
Jumlah Honor per Jumlah Jumlah Jumlah
No. Pelaksana Kegiatan
Orang Jam Jam/Bulan Bulan/Tahun Biaya (Rp)
1. Ketua Peneliti 1 30,000 12 8 2,880,000
2. Anggota Peneliti 1 20,000 12 8 1,920,000
Jumlah total biaya honor (Rp) 4,800,000
J.2 Belanja Barang
Biaya Satuan
No Peralatan/Bahan Volume Satuan Jumlah Biaya (Rp)
(Rp)
1 Hg2SO4 2 250gr 1,000,000 2,000,000
2 Ag2SO4 1 100 gr 400,000 400,000
3 Asam sulfat 5 2,5 L 600,000 3,000,000
4 Gas N2 1 Tabung 400,000 400,000
5 K2Cr2O7 1 250 gr 800,000 800,000
Jumlah 6,600,000
J.3 Belanja Jasa

Volume
No. Tujuan Biaya Satuan (Rp) Jumlah Biaya (Rp)
1. Pengambilan sampel Pekanbaru-Kampar 1 500,000 500,000
Jumlah total biaya perjalanan (Rp) 500,000
J.4 Sewa alat dan jasa layanan

Volume
No. Nama Alat/ Jasa Layanan Biaya Satuan (Rp) Jumlah Biaya (Rp)
1 Fotocopy Laporan Ls 600,000 600,000
2 Publikasi Jurnal Nasional 1 500,000 500,000
3 Analisis sampel GC 100 70,000 7,000,000
Jumlah total biaya sewa alat, jasa layanan, dll. (Rp) 8,100,000

K. LAMPIRAN

16
L. DAFTAR PUSTAKA

Ahmad A.L, Ismail, S dan Bhatia, S. (2003):Water Recycling From Palm Oil Mill Effluent (POME) Using
Membrane Technology. Desalination, 157, 87–95.
Alam, Md.Z., Kabbashi, N.A dan Hussin, S.N.I.S. (2009):Production of Bioethanol by Direct
Bioconversion of Oil-Palm Industrial Effluent In A Stirred-Tank Bioreactor. J Industrial
Microbiologi and Biotechnologi. 36, 801–808.
Anderson, K., Sallis, P dan Uyanik, S. (2003):Anaerobic treatment processes. Handbook of Water and
Wastewater Microbiology. Academic Press. 391-427.
Avci, A dan Donmez, S. (2006):Effect of Zinc on Ethanol Production by Two Thermoanaerobacter Strains.
Process Biochemistry, 41, 984–989
Azenha, M., Vasconcelos, M.T dan Moradas-Ferreira, P. (2000):The Influence of Cu Concentration on
Ethanolic Fermentation by Saccharomyces cerevisiae. Journal of Bioscience and
Bioengineering, 90, (2), 163-167
Baghchehsaraeea, B., Nakhlaa, G., Karamaneva, D., Margaritisa, A., Reidb, G. (2008): The effect of heat
pretreatment temperature on fermentative hydrogen production using mixed cultures.
International journal of hydrogen energy, 33, 4064-4073.
Demirbas, A. (2005): Bioethanol from Cellulosic Materials: A Renewable Motor Fuel from Biomass.
Energy Sources, 27, 327–337.
Dillon, H.S., Laan, T dan Dillon, H. S. (2008) : Biofuels - at What Cost ?: Government support for ethanol
and biodiesel in Indonesia. One of a series of reports addressing subsidies for biofuels in
developing countries. Prepared for : The Global Subsidies Initiative (GSI) of the International
Institute for Sustainable Development (IISD) Geneva, Switzerland. 28-35.
Gerardi, M.H. (2003). The Microbiology of Anaerobic Digesters. John Wiley & Sons, Inc, 43-50.
Gottschalk, G. 1986. Microbial Metabolism. 2nd Edition. Springer-Verlag, 208-280.
Grady, L.C.P.Jr., Daigger, G.T dan Lim, H.C. (1999) : Biological Wastewater Treatment, 2 nd Edition,
Revised dan Expanded. Marcel Dekker, Inc., 32.
Kim, B.H dan Gadd, G.M. (2008) : Bacterial Physiology and Metabolism. Cambridge University Press,
252-289.
Kim, D.H., Han, S.K., Kim, S.H dan Shin, H.S. (2006). Effect of gas sparging on continuous fermentative
hydrogen production. International Journal of Hydrogen Energy, 31, 2158 – 2169.
Kim, J., Park, C., Kim, T.H., Lee, M., Kim, S., Kim, S.W., Lee, J., 2003. Effects of various pretreatments
for enhanced anaerobic digestion with waste activated sludge. J. Biosci. Bioeng. 95, 271-275.
Lee, S.M dan Lee, J.H. (2014): Effect of sludge treatment on biogas production from Saccharina japonica
ethanol fermentation by-products. Journal of Industrial and Engineering Chemistry xxx (2014)
xxx–xxx.
Levin, D.B., Pitt, L dan Love, M. (2004) : Biohydrogen production: prospects and limitations to practical
application. International Journal of Hydrogen Energy, 29, 173 – 185.
Li, Y.F., Ren, N.Q., Chen, Y dan Zheng, G.X. (2007) : Ecological mechanism of fermentative hydrogen
production by bacteria. International Journal of Hydrogen Energy, 32, 755 – 760.
Mizuno, O., Dinsdale, R., Hawkes, F.R., Hawkes, D.L dan Noike, T. (2000). Enhancement of hydrogen
production from glucose by nitrogen gas sparging. Bioresource Technology 73 , 59-65.
Mohan, S.V., Babu, V.L., Sarma, P.N. (2008): Effect of various pretreatment methods on anaerobic mixed
microflora to enhance biohydrogen production utilizing dairy wastewater as substrate. Bioresour
Technol. 99, 59-67.
Presecki, A.V dan Racki, D.V. (2005):Modelling of the alcohol dehydrogenase production in baker’s yeast.
Process Biochemistry, 40, 2781–2791.
Ren, N.Q., Guoa, W.Q., Wang, Z.J., Xiang, W.S., Liua, B.F., Wanga, X. Z., Dinga, J dan Chena, Z.B.
(2008): Effects of different pretreatment methods on fermentation types and dominant bacteria
for hydrogen production. International journal of hydrogen energy 33, 4318–4324.

17
Ren, N.Q, Wang, B dan Huang, J.C. (1997):Ethanol-type fermentation from carbohydrate in high rate
acidogenic reactor. Biotechnology and Bioengineering, 54, (5), 428-433.
Ren, N.Q., Xing, D., Rittmann, B.E., Zhao, L., Xie, T dan Zhao, X. (2007):Microbial community structure
of ethanol type fermentation in bio-hydrogen production. Environmental Microbiology, 9 (5),
1112–1125.
Rogers, P., Chen, J.S dan Zidwick, M.J. (2006):Organic acid and solvent production, part ii: propionic and
butyric acids and ethanol. The Prokaryotes 3th Edition, Volume 1: Symbiotic Associations,
Biotechnology, Applied Microbiology. Springer. 611-671.
Saxena, J dan Tanner, R. S. (2010):Original Paper : Effect of trace metals on ethanol production from
synthesis gas by the ethanologenic acetogen, Clostridium ragsdalei. Journal of Industrial
Microbiology and Biotechnology. Published Online, DOI 10.1007/s10295-010-0794-6.
Chang, S., Li, J. Z dan Liu, F. (2011): Evaluation of different pretreatment methods for preparing hydrogen-
producing seed inocula from waste activated sludge. Renewable Energy 36, 1517-1522.
Syafila, M., Handajani, M dan Prayascitra, A. (2010):The effect of nitrogen gas flushing on intermediate
products formation in acidogenic stage of anaerobic process of cocoa sweatings. Institut
Teknologi Bandung Journal of Engineering Science, 42 (2), 129-136.
Temudo, M.F., Poldermans, R., Kleerebezem, R dan van Loosdrecht, M.C.M. (2008):Glycerol
fermentation by (open) mixed cultures: a chemostat study. Biotechnology and Bioengineering,
100, (6), 1088-1098.
Wang, J., Wan, W. (2008): Comparison of different pretreatment methods for enriching hydrogen-
producing bacteria from digested sludge. International journal of hydrogen energy, 33, 2934-
2941.
Wong, Y,M., Wu, T.Y., Juan, J.C. (2014): A review of sustainable hydrogen production using seed sludge
via dark fermentation. Renewable and Sustainable Energy Reviews 34, 471–482
Wua, Y., Wanga, C., Zheng, M., Zuo, J., Wua, J., Wanga, K dan Yang, B. (2016): Effect of pH on ethanol-
type acidogenic fermentation of fruit and vegetable waste. Waste Management xxx, xxx–xxx.
Yenigün, O., Kizilgün, F dan Yilmazer, G. (1996):Inhibition effects of zinc and copper on volatile fatty
acid production during anaerobic digestion. Environmental Technology, 17 (11), 1269-1274.
Zhang, K., Ren, N.Q., Wang, A.J. (2015) : Fermentative hydrogen production from corn stover hydrolyzate
by two typical seed sludges: Effect of temperature. International journal of hydrogen energy 40,
3838-3848.
Zhao, X. Q., Xue, C., Ge, X.M., Yuan, W.J. Wang, J.Y dan Bai, F.W. (2009):Impact of zinc
supplementation on the improvement of ethanol tolerance and yield of self-flocculating yeast in
continuous ethanol fermentation. Journal of Biotechnology 139, 55–60.
Zhu, H.G., Beland, M. (2006): Evaluation of alternative methods of preparing hydrogen producing seeds
from digested wastewater sludge. Int. J. Hydrogen Energy 31, 1980-1988.

18