LAMPIRAN

Lampiran 1 Pembuatan Reagensia

1.1 Pembuatan reagen asam 3,5-dinitrosalisilat (DNS)

Sebanyak 1 g NaOH dilarutkan dalam 60 mL akuades kemudian ditambahkan 18,2
g Kalium Natrium Tartrat, 1 g asam dinitrosalisilat (ditambahkan pelan-pelan
sambil diaduk dengan magnetic stirrer), 0,05 g natrium sulfit dan 0,2 g fenol.
Kemudian ditambahkan akuades hingga memiliki volume 100 mL. Semua bahan
pembuatan reagen DNS, dimasukkan secara urut satu per satu sesuai urutan.

1.2 Pembuatan buffer fosfat sitrat pH 6

100 mL buffer fosfat sitrat pH 6
A: 0,1 M asam sitrat (1, 921 gram dalam 100 mL)
B: 0,2 M Na2HPO4.7H2O (5,365 gram dalam 100 mL)
Untuk mendapatkan buffer fosfat sitrat pH 6, 53,7 mL larutan A dicampur dengan
96,3 mL larutan B. Kemudian diencerkan hingga memiliki volume 300 mL.
1.3 Pembuatan ampisilin 100 mg/mL
Sebanyak 10 gram ampisilin dilarutkan dalam 10 mL akuades steril. Untuk
penyimpanan, larutan ampisilin diadekuat dan disimpan pada suhu -20°C.

1.4 Pembuatan substrat beechwood 1%

Sebanyak 0,5 gram beechwood dilarutkan dengan 50 mL buffer fosfat sitrat pH 6,
kemudian diautoclave.

1.5 Pembuatan substrat xilan 1% (hasil ekstraksi dari tongkol jagung)

Sebanyak 0,5 g xilan dilarutkan dengan 50 mL buffer fosfat sitrat pH 6 kemudian

diautoclave.

1.6 Pembuatan substrat 4-metilumbeliferil-α-L-arabinofuranosidase

Sebanyak 0,012 gram 4-metilumbeliferil-α-L-arabinofuranosidase dilarutkan
dalam 20 mL buffer fosfat sitrat pH 6.
1.7 Pembuatan Triton X-100 2,5%
Sebanyak 2,5 mL Triton X-100 dimasukkan ke dalam labu ukur 100 mL.
Diencerkan dengan akuades sampai tanda batas dan dikocok sampai homogen.

1.8 Pembuatan Na2CO3 0,4 M

Sebanyak 0,424 gram Na2CO3 dilarutkan dalam 10 mL akuades steril.

1.9 Pembuatan substrat pNP-X 1mM

Sebanyak 0,001356 gram pNP-X dilarutkan dalam 5 mL buffer fosfat sitrat pH 6.

1.10 Pembuatan substrat pNP-A 1mM

Sebanyak 0,001356 gram pNP-A dilarutkan dalam 5 mL buffer fosfat sitrat pH 6.
Lampiran 2. Kurva Pertumbuhan Escherichia coli BL21 (pLIC-Exyl)

 Inokulum : LB

Media : LB

No. Jam ke- A1 A2 Arata-rata SD

1. 0 0,031 0,053 0,042 0,0156
2. 2 0,604 0,604 0,604 0,0000
3. 4 1,367 1,385 1,376 0,0127
4. 6 2,125 2,183 2,154 0,0410
5. 8 2,256 2,289 2,273 0,0233
6. 10 2,158 2,553 2,356 0,2793
7. 12 2,358 2,355 2,357 0,0021
8. 14 2,225 2,059 2,142 0,1174
9. 16 1,826 1,786 1,806 0,0283
10. 18 1,790 1,658 1,724 0,0933
11. 20 1,576 1,577 1,577 0,0007
12. 22 1,328 1,189 1,259 0,0983
13. 24 1,363 0,989 1,176 0,2645
14. 26 1,130 1,100 1,115 0,0212
15. 28 1,126 1,073 1,099 0,0375
16 30 1,213 1,159 1,186 0,0382
17. 32 1,169 1,185 1,177 0,0113
18. 34 1,188 1,174 1,181 0,0099
19. 36 1,260 1,298 1,279 0,0269
20. 38 1,304 1,294 1,299 0,0071
21. 40 1,298 1,371 1,335 0,0516
 Inokulum : LB

Media : MTE

No. Jam ke- A1 A2 Arata-rata SD

1. 0 0,228 0,256 0,242 0,0198
2. 2 0,502 0,548 0,525 0,0325
3. 4 0,781 0,841 0,811 0,0424
4. 6 1,419 1,416 1,418 0,0021
5. 8 1,254 1,502 1,378 0,1754
6. 10 1,393 1,369 1,381 0,0170
7. 12 1,389 1,407 1,398 0,0127
8. 14 1,434 1,358 1,396 0,0537
9. 16 1,396 1,362 1,379 0,0240
10. 18 1,389 1,395 1,392 0,0042
11. 20 1,456 1,348 1,402 0,0764
12. 22 1,412 1,396 1,404 0,0113
13. 24 1,458 1,376 1,417 0,0580
14. 26 1,426 1,408 1,417 0,0127
15. 28 1,431 1,453 1,442 0,0156
16 30 1,458 1,436 1,447 0,0156
17. 32 1,474 1,430 1,452 0,0311
18. 34 1,452 1,464 1,458 0,0085
19. 36 1,450 1,482 1,466 0,0226
20. 38 1,477 1,473 1,475 0,0028
21. 40 1,468 1,496 1,482 0,0198
 Inokulum : MTE

Media : MTE

No. Jam ke- A1 A2 Arata-rata SD

1. 0 0,148 0,162 0,155 0,0099
2. 2 0,255 0,251 0,253 0,0028
3. 4 0,465 0,511 0,488 0,0325
4. 6 1,208 1,198 1,203 0,0071
5. 8 1,265 1,293 1,279 0,0198
6. 10 1,260 1,258 1,259 0,0014
7. 12 1,225 1,243 1,234 0,0127
8. 14 1,244 1,272 1,258 0,0198
9. 16 1,245 1,263 1,254 0,0127
10. 18 1,283 1,259 1,271 0,0170
11. 20 1,267 1,271 1,269 0,0028
12. 22 1,256 1,310 1,283 0,0382
13. 24 1,295 1,287 1,291 0,0057
14. 26 1,326 1,308 1,317 0,0127
15. 28 1,314 1,304 1,309 0,0071
16 30 1,329 1,305 1,317 0,0170
17. 32 1,318 1,326 1,322 0,0057
18. 34 1,321 1,353 1,337 0,0226
19. 36 1,327 1,325 1,326 0,0014
20. 38 1,354 1,312 1,333 0,0297
21. 40 1,337 1,341 1,339 0,0028
Lampiran 3. Kurva Standar Xilosa

Konsentrasi A1 A2 A3 Arata-rata SD
(mg mL-1)
0,1 0,121 0,122 0,122 0,122 0,0006
0,2 0,403 0,403 0,400 0,402 0,0017
0,3 0,842 0,840 0,840 0,841 0,0012
0,4 1,251 1,253 1,249 1,251 0,0020
0,5 1,547 1,547 1,545 1,546 0,0012
0,6 1,921 1,922 1,921 1,921 0,0006
0,7 2,374 2,374 2,370 2,373 0,0023
0,8 2,789 2,788 2,782 2,786 0,0038
0,9 3,065 3,065 3,067 3,066 0,0012
1 3,481 3,482 3,482 3,482 0,0006

Dari data absorbansi larutan standar xilosa pada berbagai konsentrasi, dibuat
persamaan regresi kurva standar larutan arabinosa yang dinyatakan sebagai y = bx
+ a. Dimana y adalah absorbansi dan x adalah konsentrasi larutan xilosa (mg mL-
1
). Diperoleh persamaan regresi linier : y = 3,779x - 0,2995.

Kurva Standar Xilosa

4
3.5 y = 3.779x - 0.2995
R² = 0.9986
3
Absorbansi

2.5
2
1.5
1
0.5
0
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2
Konsentrasi
Lampiran 4. Kurva Standar p-Nitrofenol

Konsentrasi A1 A2 A3 Arata-rata SD
(mM)
0,010 0,162 0,161 0,161 0,161 0,0006
0,025 0,380 0,380 0,395 0,385 0,0087
0,050 0,824 0,819 0,831 0,825 0,0060
0,075 1,048 1,080 1,073 1,067 0,0168
0,100 1,500 1,557 1,575 1,544 0,0392
0,125 1,842 1,842 2,082 1,922 0,1386
0,150 2,365 2,240 2,403 2,336 0,0853

Dari data absorbansi diatas dibuat persamaan regresi linier dan didapatkan
persamaan : y = 15,403x - 0,0001

Kurva Standar p-Nitrofenol

3

2.5 y = 15,403x - 0,0001

R² = 0,997
2
Absorbansi

1.5

0.5

0
0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12 0.14 0.16
Konsentrasi
Lampiran 5. Kurva Standar Protein

Konsentrasi A1 A2 A3 Arata-rata SD
(µg mL-1)
0,2 0,011 0,027 0,007 0,015 0,0106
0,3 0,078 0,060 0,051 0,063 0,0137
0,4 0,119 0,145 0,081 0,115 0,0322
0,5 0,202 0,137 0,153 0,164 0,0339
0,6 0,270 0,184 0,218 0,224 0,0433
0,7 0,313 0,309 0,287 0,303 0,0140
0,8 0,370 0,408 0,429 0,403 0,0299
0,9 0,407 0,486 0,403 0,432 0,0468

Dari data absorbansi diatas dibuat persamaan regresi linier dan didapatkan
persamaan : y = 0,002x + 0,027

Kurva Standar Protein

0.6

0.5
y = 0.0624x - 0.066
0.4 R² = 0.9859
Absorbansi

0.3

0.2

0.1

0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
-0.1
Konsentrasi
 Lampiran 6. Data Absorbansi dan Aktivitas Enzim Endo-1,4-β-xilanase

5.1 Data Absorbansi LB-LB, LB-MTE, dan MTE-MTE terhadap Substrat

Beechwood Xylan

 LB-LB

No Waktu A1 A2 AR AKKonsentrasi DF AE SD
(Jam) xilosa (U/ml)
(mg mL-1)
1. ULL0 0,474 0,295 0,3845 0,329 0,0147 2 0,0261 0,1266
2. ULL12 0,469 0,501 0,485 0,193 0,0773 2 0,1374 0,0226
3. ULL18 0,275 0,402 0,3385 0,212 0,0335 2 0,0595 0,0898
4. ULL22 0,478 0,470 0,474 0,359 0,0304 2 0,0541 0,0057
5. ULL32 0,323 0,311 0,317 0,291 0,0069 2 0,0122 0,0085
6. ULL38 0,336 0,367 0,3515 0,280 0,0189 2 0,0336 0,0219

 LB-MTE

No Waktu A1 A2 AR AK Konsentrasi DF AE SD
(Jam) xilosa (U/ml)
(mg mL-1)
1. ULM0 0,367 0,270 0,319 0,283 0,0095 2 0,0169 0,0686
2. ULM12 0,184 0,560 0,372 0,161 0,0558 2 0,0993 0,2659
3. ULM18 0,256 0,296 0,276 0,205 0,0188 2 0,0334 0,0283
4. ULM22 0,184 0,234 0,209 0,181 0,0074 2 0,0132 0,0354
5. ULM32 0,283 0,238 0,2605 0,249 0,0030 2 0,0054 0,0318
6. ULM38 0,251 0,324 0,2875 0,280 0,0020 2 0,0035 0,0516

 MTE-MTE

No Waktu A1 A2 AR AK Konsentrasi DF AE SD
(Jam) xilosa (U/ml)
(mg mL-1)
1. UMM0 0,229 0,333 0,281 0,259 0,0058 2 0,0103 0,0735
2. UMM12 0,308 0,661 0,4845 0,214 0,0716 2 0,1273 0,2496
3. UMM18 0,340 0,561 0,4505 0,280 0,0451 2 0,0802 0,1563
4. UMM22 0,535 0,222 0,3785 0,233 0,0385 2 0,0684 0,2213
5. UMM32 0,597 0,614 0,6055 0,496 0,0290 2 0,0515 0,0120
6. UMM38 0,302 0,335 0,3185 0,204 0,0303 2 0,0539 0,0233
 5.2 Data Absorbansi LB-LB, LB-MTE, dan MTE-MTE terhadap Substrat
Xilan Hasil Ekstraksi dari Tongkol Jagung

 LB-LB

No Waktu A1 A2 AR AK Konsentrasi DF AE SD
(Jam) xilosa (U/ml)
(mg mL-1)
1. ULL0 0,273 0,207 0,240 0,238 0,0005 2 0,0009 0,0467
2. ULL12 0,337 0,414 0,3755 0,280 0,0253 2 0,0449 0,0544
3. ULL18 0,210 0,342 0,276 0,216 0,0159 2 0,0282 0,0933
4. ULL22 0,364 0,196 0,280 0,146 0,0355 2 0,0630 0,1188
5. ULL32 0,247 0,173 0,210 0,168 0,0111 2 0,0198 0,0523
6. ULL38 0,211 0,435 0,323 0,294 0,0077 2 0,0136 0,1584

 LB-MTE

No Waktu A1 A2 AR AKKonsentrasi DF AE SD
(Jam) xilosa (U/ml)
(mg mL-1)
1. ULM0 0,192 0,301 0,247 0,245 0,0005 2 0,0009 0,0771
2. ULM12 0,178 0,438 0,308 0,144 0,0434 2 0,0772 0,1838
3. ULM18 0,128 0,662 0,395 0,246 0,0394 2 0,0701 0,3776
4. ULM22 0,158 0,150 0,154 0,139 0,0040 2 0,0071 0,0057
5. ULM32 0,266 0,108 0,187 0,130 0,0151 2 0,0268 0,1117
6. ULM38 0,127 0,127 0,127 0,124 0,0008 2 0,0014 0,0000

 MTE-MTE

No Waktu A1 A2 AR AKKonsentrasi DF AE SD
(Jam) xilosa (U/ml)
(mg mL-1)
1. UMM0 0,300 0,169 0,2345 0,231 0,0009 2 0,0016 0,0926
2. UMM12 0,632 0,295 0,4635 0,139 0,0859 2 0,1527 0,2383
3. UMM18 0,400 0,376 0,388 0,130 0,0683 2 0,1214 0,0170
4. UMM22 0,198 0,202 0,200 0,178 0,0058 2 0,0103 0,0028
5. UMM32 0,526 0,232 0,379 0,237 0,0376 2 0,0668 0,2079
6. UMM38 0,127 0,140 0,1335 0,107 0,0070 2 0,0125 0,0092
5.3 Data Absorbansi MTE-MTE terhadap Substrat pNP-X

No Waktu A1 A2 AR AK Konsentrasi DF AE
(Jam) xilosa (U/ml)
(mM)
1. UMM12 0,237 0,261 0,249 0,17 0,0051 1 0,9403
2. UMM32 0,162 0,185 0,1735 0,163 0,0007 1 0,1250

5.4 Data Absorbansi MTE-MTE terhadap Substrat pNP-A

No Waktu A1 A2 AR AK Konsentrasi DF AE
(Jam) xilosa (U/ml)
(mM)
1. UMM12 0,69 0,654 0,672 0,378 0,0191 1 3,4993
2. UMM32 0,449 0,45 0,4495 0,2 0,0162 1 2,9697

5.5 Data Absorbansi Kadar Protein

No Waktu A1 A2 AR AK AR- AK DF Kadar

(Jam) Protein
(mg mL-1)
1. UMM12 0,763 0,739 0,751 0,538 0,213 6 0,0268
2. UMM32 0,606 0,604 0,605 0,583 0,022 6 0,0085
Contoh Perhitungan Penentuan Aktivitas Enzim Endo-1,4-β-xilanase

Aktivitas Enzim terhadap Substrat Alami (Beechwood Xylan, Xilan dari

Tongkol Jagung)

1 unit aktivitas (U) didefinisikan sebagai jumlah enzim yang melepaskan 1 µmol
gula reduksi per menit dalam kondisi percobaan. Persamaan regresi linier kurva
standar xilosa: y = 3,779x - 0,2995; y: absorbansi; x: konsentrasi.

Waktu inkubasi : 60 menit

Mr xilosa : 150 g mol-1
Konsentrasi produk (xilosa) : Konsentrasi sampel - Konsentrasi kontrol
Konsentrasi sampel :
y = 3,779x - 0,2995
0,4635 = 3,779x - 0,2995
x = 0,2019 mg mL-1
Konsentrasi kontrol :
y = 3,779x - 0,2995
0,139 = 3,779x - 0,2995
x = 0,1160 mg mL-1
Konsentrasi xilosa = Konsentrasi sampel - konsentrasi kontrol
= 0,2019 – 0,1160 (mg mL-1)
= 0,0859 mg mL-1
𝐴𝑘𝑡𝑖𝑣𝑖𝑡𝑎𝑠 𝑝𝑒𝑟 𝑚𝐿 𝑒𝑘𝑠𝑡𝑟𝑎𝑘
[𝑝𝑟𝑜𝑑𝑢𝑘]𝑝𝑒𝑟 𝑚𝑙 𝑙𝑎𝑟 𝑢𝑗𝑖 𝑥 𝑉𝑜𝑙 𝑙𝑎𝑟 𝑢𝑗𝑖 𝑥 𝑓. 𝑝𝑒𝑛𝑔𝑒𝑛𝑐𝑒𝑟𝑎𝑛𝑥1000
=
𝑀𝑟 𝑥𝑖𝑙𝑜𝑠𝑎 𝑥 𝑊𝑎𝑘𝑡𝑢 𝑖𝑛𝑘𝑢𝑏𝑎𝑠𝑖 𝑥 𝑉𝑜𝑙 𝑒𝑛𝑧𝑖𝑚

0,0859 𝑥 0.4 𝑥 2 𝑥 1000

Aktivitas enzim (U mL-1) = 150 𝑥 60 𝑥 0.05

= 0,1527 𝑈 𝑚𝐿−1

Contoh Perhitungan Penentuan Aktivitas Enzim Endo-1,4-β-xilanase

Aktivitas Enzim terhadap Substrat Spesifik (pNP-A dan pNP-X)

1 unit aktivitas (U) didefinisikan sebagai jumlah enzim yang melepaskan 1 µmol
gula reduksi per menit dalam kondisi percobaan. Persamaan regresi linier kurva
standar xilosa: y = 15,403x - 0,0001; y : absorbansi; x: konsentrasi.

Waktu inkubasi : 60 menit

Konsentrasi produk (p-nitrofenol) : Konsentrasi sampel - Konsentrasi kontrol

Konsentrasi sampel :

y = 15,403x - 0,0001

0,672 = 3,779x - 0,2995

x = 0,0436 mM

Konsentrasi kontrol :

y = 15,403x - 0,0001

0,378 = 3,779x - 0,2995

x = 0,0245 mM

Konsentrasi xilosa = Konsentrasi sampel - konsentrasi kontrol

= 0,0436 – 0,0245 (mM)

= 0,0191 mM

𝐴𝑘𝑡𝑖𝑣𝑖𝑡𝑎𝑠 𝑝𝑒𝑟 𝑚𝐿 𝑒𝑘𝑠𝑡𝑟𝑎𝑘

[𝑝𝑟𝑜𝑑𝑢𝑘]𝑝𝑒𝑟 𝑚𝑙 𝑙𝑎𝑟 𝑢𝑗𝑖 𝑥 𝑉𝑜𝑙 𝑙𝑎𝑟 𝑢𝑗𝑖 𝑥 𝑓. 𝑝𝑒𝑛𝑔𝑒𝑛𝑐𝑒𝑟𝑎𝑛 𝑥 1000
=
𝑊𝑎𝑘𝑡𝑢 𝑖𝑛𝑘𝑢𝑏𝑎𝑠𝑖 𝑥 𝑉𝑜𝑙 𝑒𝑛𝑧𝑖𝑚
0,0191𝑥 0.55 𝑥 1 𝑥 1000
Aktivitas enzim (U mL-1) = 60 𝑥 0.05

= 3,4993 𝑈 𝑚𝐿−1

Contoh Perhitungan Kadar Protein

Perhitungan Penentuan Kadar Protein :

Persamaan regresi linier : y = 0,0624x - 0,066

Absorbansi produk : 0,213

Kadar protein :

y = 0,0624x - 0,066

0,213 = 0 0,0624x - 0,066

x = 4,4712 µg mL-1
x = 0,0044712 mg mL-1

Faktor Pengenceran = 6

x = 0,0044712 x 6

= 0,0268 mg mL-1
Sehingga dapat diketahui bahwa perhitungan aktivitas enzim dan kadar protein
diperoleh seperti dalam Tabel dibawah ini:

Substrat : pNP-X

No Waktu Aktivitas Enzim Kadar Protein

(Jam) (U mL-1) (mg mL-1)
1. UMM12 0,9403 0,0268
2. UMM32 0,1250 0,0085

Substrat : pNP-A

No Waktu Aktivitas Enzim Kadar Protein

(Jam) (U mL-1) (mg mL-1)
1. UMM12 3,4993 0,0268
2. UMM32 2,9697 0,0085

Contoh Perhitungan Aktivitas Spesifik:

Aktivitas spesifik adalah jumlah aktivitas tiap unit massa enzim. Aktivitas spesifik
adalah banyaknya aktivitas tiap masa subtrat per mg protein. Aktivitas spesifik
dapat diukur sebagai berikut.

𝐴𝑘𝑡𝑖𝑣𝑖𝑡𝑎𝑠 𝑝𝑒𝑟 𝑚𝐿 𝑒𝑘𝑠𝑡𝑟𝑎𝑘

𝐴𝑘𝑡𝑖𝑣𝑖𝑡𝑎𝑠 𝑠𝑝𝑒𝑠𝑖𝑓𝑖𝑘 (U 𝑚𝑔−1 ) =
𝐾𝑎𝑑𝑎𝑟 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒𝑖𝑛 𝑝𝑒𝑟 𝑚𝐿 𝑒𝑘𝑠𝑡𝑟𝑎𝑘

𝟐,𝟗𝟔𝟗𝟕𝑼 𝒎𝑳−𝟏
= 𝟎,𝟎𝟎𝟖𝟓 𝐦𝐠 𝐦𝐋−𝟏
= 14,7030 𝑈 𝑚𝑔−1

Aktivitas spesifik enzim endo-1,4-β-xilanase rekombinan dengan substrat pNP-X

No Waktu (Jam) Aktivitas Spesifik Enzim (U mg-1)
1. UMM12 35,0856
2. UMM32 14,7030

Aktivitas spesifik enzim endo-1,4-β-xilanase rekombinan dengan substrat pNP-A

No Waktu (Jam) Aktivitas Spesifik Enzim (U mg-1)
1. UMM12 130,5716
2. UMM32 349,3717