Uji Sitotoksisitas Ekstrak Etanol Daun S

UJI SITOTOKSISITAS EKSTRAK ETANOL DAUN SIRIH MERAH
(Piper crocatum) TERHADAP SEL FIBROBLAS
SKRIPSI
Oleh :
PELANGI C.P.S.
020413335
FAKULTAS KEDOKTERAN GIGI

UNIVERSITAS AIRLANGGA
SURABAYA
2013
SKRIPSI
Oleh :
PELANGI C.P.S.
020413335

SURABAYA
2013
i
LEMBAR PENGESAHAN

SKRIPSI
Diajukan Sebagai Salah Satu Syarat Untuk Menyelesaikan

Pendidikan Dokter Gigi di Fakultas Kedokteran Gigi
Universitas Airlangga Surabaya
Oleh :
PELANGI CITRA.PS
NIM : 020413335
Menyetujui
Pembimbing Utama Pembimbing Serta
(Markus Budi Rahardjo, drg., M.Kes) (Dr. Ira Arundina, drg.,M.Si)

NIP. 195405101981031010 NIP. 1971110281997022002

SURABAYA
2013
ii
PENETAPAN PANITIA PENGUJI SKRIPSI
Skripsi ini telah diuji pada tanggal 22 Januari 2013
PANITIA PENGUJI SKRIPSI
1. Dr. Theresia Indah Budhy, drg., M.Kes (Ketua Penguji)
2. Dr. Pratiwi Soesilawati, drg., M.Kes (Anggota)
3. Dr. Retno Indrawati, drg., M.Si (Anggota)
4. Markus Budi Raharjo, drg., M.Kes (Pembimbing Utama/Anggota)
5. Dr. Ira Arundina, drg., M.Si (Pembimbing Serta/Anggota)
iii
UCAPAN TERIMA KASIH
Pertama-tama penulis panjatkan puji syukur pada Tuhan Yang Maha Esa
atas segala rahmat dan karunia-Nya sehingga skripsi yang berjudul “UJI
SITOTOKSISITAS EKSTRAK ETANOL DAUN SIRIH MERAH (Piper
Crocatum) TERHADAP SEL FIBROBLAS” ini dapat terselesaikan. Penyusunan
skripsi ini merupakan salah satu syarat untuk menyelesaikan Pendidikan Dokter
Gigi di Fakultas Kedokteran Gigi Universitas Airlangga Surabaya.
Skripsi ini tidak dapat terwujud tanpa dukungan, bimbingan, dan bantuan dari
berbagai pihak. Oleh karena itu, pada kesempatan ini penulis ingin menyampaikan
rasa terima kasih kepada :
1. Prof. R.M. Coen Promono Danudiningrat, drg., SU., SpBM (K), selaku
Dekan Fakultas Kedokteran Gigi Universitas Airlangga Surabaya yang
telah memberi kesempatan untuk menempuh pendidikan di Fakultas
Kedokteran Gigi Airlangga.
2. Dr. R. Darmawan Setijanto., drg., M.Kes, selaku Wakil Dekan I Fakultas
Kedokteran Gigi Universitas Airlangga Surabaya yang telah mengizinkan
penulis untuk membuat skripsi ini.
3. drg. Markus Budi Rahardjo., M.Kes selaku Kepala Departemen Biologi
Oral yang telah memberikan izin untuk pembuatan skripsi dan selaku
Dosen Pembimbing Utama yang telah banyak memberi bimbingan, saran,
bantuan dan dorongan yang sangat bermanfaat dalam penyusunan skripsi
ini.
iv
4. Dr. Ira Arundina, drg., M.Si selaku Dosen Pembimbing Serta atas
bimbingan, saran, dan bantuannya yang sangat bermanfaat dalam
penyusunan skripsi ini.
5. drh. Erna selaku staf bagian PMPP Pusat Veterinaria Farma
(PUSVETMA) Surabaya.
6. Kedua Orang tua, dr. Suriadi Anang, Sp.A dan Tuska Indrawati yang telah
memberikan doa dan semangat.
7. Amrullah Rahdityanur, Annisa T, Nik Andriena dan seluruh teman- teman
yang tidak dapat penulis tulis satu persatu yang selalu memberikan
dukungan, perhatian, doa, semangat dan saran yang berguna dalam
penyelesaian skripsi ini.
Semoga segala bantuan yang diberikan mendapat balasan dari Tuhan Yang
Maha Esa. Kritik dan saran dari semua pihak diharapkan demi penelitian di masa
yang akan datang. Akhir kata penulis berharap semoga skripsi ini dapat
memberikan manfaat khususnya bagi mahasiswa Fakultas Kedokteran Gigi
Universitas Airlangga dan pembaca pada umumnya.
Surabaya, Februari 2013
Penulis
v
UJI SITOTOKSISITAS EKSTRAK ETANOL DAUN SIRIH
MERAH (Piper crocatum) TERHADAP SEL FIBROBLAS
(CYTOTOXICITY TEST OF ETHANOLIC EXTRACT OF RED BETEL LEAF
(PIPER CROCATUM) TOWARD FIBROBLAST CELLS)
ABSTRACT
Background. Traditional herbs are very popular in the community lately as a

natural substance that is considered more safe, inexpensive and easy to obtain.
Piper crocatum is one of the Indonesian plants which is traditionally used for
health treatment. It is known to have anti-inflammatory and wound healing effect.
The using Piper crocatum as one of the dental health products should have not
toxic, and have biocompatibilty properties. Purpose. To determine the cytotoxicity
of the Piper crocatum with different concentration toward fibroblast cells.
Method. The method type used is experimental research laboratories using the
post-test only control group design. Number of samples were 7 samples of each
12,5%, 25%, 50%, and 100%. The citotoxicity test by using enzymatic assay of
MTT [3-(4,5-dimethyltiazol-2-yl)-2,5-difeniltetrazolium bromide], against
fibroblast cell (BHK-21). The density of optic formazan indicated the number of
living cell. Results. The result showed that the percentage of living cell amount of
12,5%, 25%, 50% and 100% concentration were 63,47%, 52,52%, 56,21% and
100%. Conclusion. Piper crocatum is non toxic.
Key words : Piper crocatum, cytotoxicity, MTT assay
vi
DAFTAR ISI
Halaman
Sampul Dalam……………………………………………………………… i
Lembar pengesahan………………………………………………………… ii
Penetapan Panitia Penguji………………………………………………….. iii
Ucapan Terima Kasih………………………………………………………. iv
Abstract…………………………………………………………………….. vi
Daftar Isi……………………………………………………………………. vii
Daftar Gambar……………………………………………………………… x
Daftar Tabel………………………………………………………………… xi
Daftar Lampiran…………………………………………………………….. xii
BAB I PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang Masalah…………………………………………….. 1
1.2 Rumusan Masalah…………………………………………………… 3
1.3 Tujuan Penelitian……………………………………………………. 3
1.4 Manfaat Penelitian…………………………………………………... 4
BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Sirih Merah (Piper crocatum)………………………………………. 5
2.1.1 Klasifikasi……………………………………………………………. 5
2.1.2 Morfolgi……………………………………………………………… 6
2.1.3 Kandungan Kimia……………………………………………………. 7
vii
2.1.4 Khasiat……………………………………………………………….. 11
2.2 Uji Sitotoksisitas……………………………………………………... 12
2.3 Proses Penyembuhan Luka………………………………………….. 15
2.4 Antioksidan………………………………………………………….. 19
2.5 Sel Fibroblas…………………………………………………………. 21
BAB 3 KERANGKA KONSEPTUAL DAN HIPOTESIS PENELITIAN
3.1 Kerangka Konseptual Penelitian………………………………….... 23
3.2 Keterangan Kerangka Konseptual Penelitian………………………. 24
3.3 Hipotesis Penelitian………………………………………………... 25
BAB 4 METODE PENELITIAN
4.1 Jenis Penelitian dan Rancangan Penelitian……………………….... 26
4.2 Subjek Penelitian…………………………………………………… 26
4.3 Jumlah Sampel……………………………………………………... 26
4.4 Variabel Penelitian…………………………………………………. 27
4.4.1 Variabel Bebas……………………………………………………… 27
4.4.2 Variabel Tergantung………………………………………………… 27
4.4.3 Variabel Kendali…………………………………………………….. 27
4.5 Definisi Operasional Variabel………………………………………. 27
4.6 Lokasi Penelitian……………………………………………………. 28
4.7 Alat dan Bahan……………………………………………………… 28
4.8 Cara kerja……………………………………………………………. 29
4.8.1 Persiapan Pembuatan Ekstrak Etanol Daun Sirih Merah………….… 29
viii
4.8.2 Pengenceran Ekstrak Etanol Daun Sirih Merah…………………….. 30
4.8.3 Uji Sitotoksisitas……………………………………………………. 31
4.9 Alur Penelitian………………………………………………………. 33
4.10 Pengolahan dan Analisis Data………………………………………. 34
BAB 5 HASIL PENELITIAN DAN ANALISIS DATA………………….. 35
BAB 6 PEMBAHASAN…………………………………………………… 38
BAB 7 SIMPULAN DAN SARAN
7.1 Simpulan………………………………………………………………... 43
7.2 Saran……………………………………………………………………. 43
DAFTAR PUSTAKA………………………………………………………. 44
ix
DAFTAR GAMBAR
Halaman
Gambar 2.1 Sirih Merah (Piper crocatum)………………………………… 5
Gambar 2.2 Reduksi MTT yang menghasilkan formazan…………………. 14
Gambar 2.3 Sel Fibroblas………………………………………………….. 21
Gambar 4.1 Shaker………………………………………………………… 28
Gambar 4.2 Microplate berisi media Eagle’s minimum essential medium

(MEM)…………………………………………………………. 31
Gambar 4.3 Elisa Reader…………………………………………………… 32
Gambar 5.1 Grafis jumlah persentase sel fibroblas yang hidup …………… 36
x
DAFTAR TABEL
Halaman
Tabel 2.1 Komposisi Ekstrak Etanol Daun Sirih Merah (Piper crocatum)
70%..................................................................................................... 8
Tabel 2.2 Growth Factor dalam penyembuhan luka………………………….. 18
Tabel 5.1 Nilai rerata optical density pada formazan ekstrak etanol daun sirih
merah (Piper crocatum), simpang baku dan persentase sel hidup…. 35
Tabel 5.2 Mann-Whitney Test antar perlakuan dan kontrol…………………... 37
xi
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
Lampiran 1 Nilai Optical Density………………………………………………… 48
Lampiran 2 Uji Statistik…………………………………………………… 49
Lampiran 3 Foto Hasil Penelitian…………………………………………… 59
Lampiran 4 Surat Identifikasi Sirih Merah (Piper crocatum)…………….. 60
Lampiran 5 Keterangan Kelaikan Etik…………………………………….. 61
xii
BAB I
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Penyakit mulut dan gigi merupakan salah satu penyakit yang banyak
terjadi di masyarakat. Hasil survey rumah tangga pada tahun 2004 menyebutkan
39% penduduk Indonesia menderita penyakit gigi dan mulut. Penyakit gigi dan
mulut dapat dibagi dua, yaitu penyakit yang menyerang jaringan keras (gigi) dan
jaringan lunak (mulut dan gusi). Salah satu penyakit jaringan lunak yaitu
Stomatitis Aftosa Rekuren (SAR) atau lebih dikenali oleh masyarakat awam
dengan “sariawan” merupakan salah satu penyakit yang ulang kambuh pada
mukosa mulut yang sering terjadi. Stomatitis Aftosa rekuren (SAR) didapatkan
pada sekitar 20% dari populasi (Regezi dkk, 2003). Di Indonesia belum diketahui
berapa prevalensi SAR di masyarakat, tetapi dari data klinik penyakit mulut di
rumah sakit Ciptomangun Kusumo tahun 1988 sampai dengan 1990 dijumpai
kasus SAR sebanyak 26,6%, periode 2003-2004 didapatkan prevalansi SAR dari
101 pasien terdapat kasus SAR 17,3% (Harahap, 2006). Untuk terapi SAR mayor
menggunakan stereoid secara sistemik, sedangkan untuk SAR minor
menggunakan salah satunya bentuk obat topikal jenis steroid (Wray dkk, 2003).
Saat ini masyarakat dunia termasuk Indonesia mulai mengutamakan
penggunaan obat secara alami (back to nature). Obat tradisional Indonesia
umumnya menggunakan bahan yang relatif mudah didapat dan tanamannya
mudah dikembang biakkan, sehingga masyarakat lebih mudah mendapatkannya
(Ariyani dkk, 2007). Salah satu bahan tradisional yang sering dijadikan obat yaitu
1
2
tumbuhan sirih merah (Piper crocatum). Daun sirih merah sering digunakan
untuk menghilangkan bau mulut, mengobati gusi berdarah (radang pada gusi),
obat sariawan, radang pada tenggorokan, gigi berlubang, dan penghilang bengkak
(Sudewo, 2005).
Beberapa penelitian menunjukan bahwa daun sirih merah (Piper
crocatum) mempunyai efek antiinflamasi, antibakteri, antioksidan, serta
antifungal. Daun sirih merah mempunyai aktivitas antibakteri terhadap
Staphlyococcus aureus dengan nilai KBM (Kadar Bunuh Minimal) sebesar 25%
dan Escherichia coli menunjukan nilai KBM (Kadar Bunuh Minimal) sebesar
6,25% (Juliantina dkk, 2009).
Telah dilakukan uji identifikasi kandungan kimia ekstraketanol daun sirih
merah (Piper crocatum) dan didapatkan bahwa sirih merah mengandung alkaloid,
saponin, flavonoid dan polifenolat (Yulias dkk, 2011). Selain itu daun sirih merah
(Piper crocatum) mengandung nilai nutrisi yang dibutuhkan untuk peningkatan
proses penyembuhan, misalnya vitamin A dan C (Prahastuti, 2004). Sedangkan
pada penelitian lain menunjukan bahwa komponen senyawa yang terkandung
pada ekstraketanol 70% daun sirih merah (Piper crocatum) adalah golongan asam
lemak, terpenoid, flavonoid, steroid, alkaloid, pirimidin, minyak atsiri, polifenol
dan vitamin E (Alfarabi, 2010).
Untuk mengembangkan bahan pengobatan SAR (Stomatitis Aftosa
Rekuren) yang alami maka harus diuji terlebih dahulu dengan uji
biokompatibilitas sesuai dengan syarat material di bidang kedokteran gigi
terutama yang digunakan di dalam mulut. Salah satu pengujian untuk menentukan
berbagai sifat dari suatu bahan kedokteran gigi adalah uji sitotoksisitas terhadap
3
jaringan (Maat, 2001). Uji sitotoksisitas adalah bagian dari evaluasi bahan
kedokteran gigi dan diperlukan untuk posedur skrining standar. Tujuan uji ini
untuk mengetahui efek toksik suatu bahan secara langsung terhadap kultur sel
(Fazwishni, 2000). Dalam uji sitotoksisitas ini akan digunakan uji enzimatik
dengan perekasi MTT dan sampel penelitian berupa sel fibroblas (kultur sel
BHK-21). Kultur sel BHK-21 yang digunakan berasal dari fibroblas ginjal
hamster karena sel fibroblas merupakan sel terpenting dan komponen terbesar
dari pulpa, ligamen periodontal dan gingiva (Fazwishni, 2000).
Walaupun sudah ada penelitian untuk mengetahui efek antibakteri dan
efek antifungal dari daun sirih merah, namun saat ini belum pernah dilakukan
penelitian untuk mengetahui sitotoksisitas ekstrak etanol daun sirih merah (Piper
crocatum) terhadap sel fibroblas dalam usaha pengembangannya sebagai bahan
alternatif untuk penyembuhan SAR (Stomatitis Aftosa Rekuren). Sirih merah
dapat menjadi salah satu bahan untuk obat SAR (Stomatitis Aftosa Rekuren)
secara topikal.
1.2 Perumusan Masalah
Apakah ekstrak etanol daun sirih merah (Piper crocatum) bersifat toksik
terhadap sel fibroblas (BHK-21) ?
1.3 Tujuan Penelitian
1.3.1 Tujuan Umum
Untuk menentukan efek toksisitas ekstrak etanol daun sirih merah (Piper
crocatum) terhadap sel fibroblas.

4
1.3.2 Tujuan khusus
1. Untuk mengetahui jumlah persentase sel fibroblas yang hidup setelah terpapar
oleh ekstrak etanol daun sirih merah (Piper crocatum) konsentrasi 100%
menggunakan esei MTT.
oleh ekstrak etanol daun sirih merah (Piper crocatum) konsentrasi 12,5%
1.4 Manfaat Penelitian
Manfaat hasil penelitian yang diperoleh akan memberikan informasi
tentang sitotoksisitas ekstrak etanol daun sirih merah (Piper crocatum) terhadap
sel BHK-21 dan digunakan sebagai dasar dalam pengembangan daun sirih merah
(Piper crocatum) menjadi bahan alternatif untuk pengobatan SAR (Stomatitis
Aftosa Rekuren).
BAB 2
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Sirih Merah (Piper crocatum)
Sirih merah (Piper crocatum) merupakan jenis sirih yang merambat dan
banyak tumbuh di daerah tropis khususnya Indonesia. Tumbuhan sirih dikenal
sebagai antiseptik sejak 600 SM. Sirih termasuk famili piperaceae yang
merambat dan bersandar di batang pohon lain (Duryatmo, 2005). Pada tahun
1990-an sirih merah difungsikan sebagai tanaman hias, karena penampilannya
yang menarik. Permukaan daunnya merah keperakan dan mengkilap. Pada
beberapa tahun terakhir ini ramai dibicarakan dan dimanfaatkan sebagai tanaman
obat.
Gambar 2.1 Sirih Merah (Piper crocatum) (dikutip dari wikipedia.com)
2.1.1 Klasifikasi
Sirih merah merupakan salah satu spesies dari keluarga piperaceae,
dengan sistematika sebagai berikut :
Kingdom : Plantae
Divisio : Magnoliophyta
Class : Magnoliopsida
5
6
Order : Piperales
Family : Piperaceae
Genus : Piper
Species : Piper crocatum (Vossen, 2000)
2.1.2 Morfologi
1. Habitus
Tanaman ini diketahui tumbuh di berbagai daerah di Indonesia, seperti di
lingkungan Keraton Yogyakarta dan di lereng Merapi sebelah timur, serta di
Papua, Jawa Barat, Aceh dan beberapa daerah lainnya. Tanaman sirih merah
tergolong langka, karena tidak tumbuh disetiap tempat atau daerah. Sirih merah
tidak dapat tumbuh di daerah panas, di tempat berhawa dingin sirih merah dapat
tumbuh dengan baik. Jika terlalu banyak terkena sinar matahari batangnya cepat
mengering, warna merah daunnya bisa menjadi pudar, buram, dan kurang
menarik. Tanaman sirih merah akan tumbuh baik jika mendapatkan 60-70 %
cahaya matahari (Sudewo, 2005).
2. Daun
Karakter morfologi daun sirih merah dengan nama ilmiah Piper crocatum
adalah mempunyai bentuk daun yang cukup bervariasi antara daun muda (fase
muda) dan daun pada cabang yang akan menghasilkan alat reproduksi (fase
dewasa). Saat muda umumnya mempunyai bentuk daun menjantung dan
membulat seperti telur dan pada fase dewasa (siap menghasilkan alat reproduksi)
terjadi perubahan bentuk daun dari membulat menjadi seperti berbentuk telur.
Daun tunggal dan kaku, permukaan helaian daun bagian atas rata agak cembung,
7
mengkilat, permukaan helaian daun bagian bawah mencekung dengan pertulangan
daun yang menonjol, panjang daun 6,1–14,6cm, lebar daun 4–9,4cm, warna dasar
daun hijau pada kedua permukaannya, bagian atas hijau dengan garis-garis merah
jambu kemerahan, permukaan bagian bawah hijau merah tua keunguan. Tangkai
daun hijau merah keunguan, panjang 2,1–6,2 cm, pangkal tangkai daun pada
helaian daun agak ketengah sekitar 0,7–1 cm dari tepi daun bagian bawah (Inggit
dkk, 2011).
3. Batang
Tumbuhan merambat atau menjalar, panjangnya dapat mencapai sekitar 5-
10m, batang bulat, hijau merah keunguan, beruas dengan panjang ruas 3-8cm,
pada setiap buku tumbuh satu daun (Inggit dkk, 2011).
2.1.3 Kandungan Kimia
Komposisi senyawa ekstrak etanol 70% daun sirih merah berdasarkan
analisis GC-MS (Gas Chromatogrpahy Mass Spectrometry) dapat dilihat pada
tabel 2.1. Hasil kromatogram tersebut diolah dengan database perangkat lunak
menunjukan komponen senyawa ekstrak etanol 70% daun sirih merah terdiri dari
golongan asam lemak, terpenoid, flavonoid, steroid, alkaloid, pirimidin, minyak
atsiri, polifenol, dan vitamin E. Terdapat beberapa senyawa yang memiliki
kesesuaian rendah dengan database kemungkinan disebabkan oleh karena databse
tidak mempunyai data-data kromatogram yang sesuai dengan ekstrak (Alfarabi,
2010).
8
Tabel 2.1 Komposisi Ekstrak Etanol Daun Sirih Merah (Piper crocatum) 70%
(Alfarabi, 2010)
Waktu retensi Area Nama Kesesuaian
(Menit) (%) (%)
9.87 1.80 Asam miristat (asam lemak) 98
11.68 1.78 Fitol (terpenoid) 91
12.07 6.13 Asam linolenat (asam lemak) 91
12.28 1.93 Asam stearat (asam lemak) 99
21.15 1.81 Mirisetin (flavonoid) 43
22.05 2.06 Pirazol (minyak atsiri) 25
23.56 4.96 2,4,6(1H,3H,5H)-pyrimidinetrione 59
(pirimidin)
23.87 2.67 Naftalena (minyak atsiri) 46
24.03 4.05 2,4,6(1H,3H,5H)-pyrimidinetrione 59
(pirimidin)
24.89 12.19 Stilben (polifenol) 30
26.12 4.52 Metyhl (25R)-5-oxo-A-nor-3,5- 90
secospirostan-3oate (stereoid)
27.20 44.69 4,4-stilbendiamin (polifenol) 60
28.42 1.53 Pirimidin 44
28.85 1.83 4-Allyloxy-6mehoxy-N.N-dimethyl- 91
1,3,5-triazin-2-amine (alkaloid)
34.46 1.65 Vitamin E 99

9
Selain itu telah dilakukan uji identifikasi kandungan kimia ekstrak etanol
daun sirih merah dan didapatkan bahwa sirih merah mengandung alkaloid,
saponin, flavonoid dan polifenolat (Yulias dkk, 2011). Daun sirih merah
mengandung nilai nutrisi yang dibutuhkan untuk peningkatan proses
penyembuhan, misalnya vitamin A dan C (Prahastuti, 2004). Namun, belum
terdapat penelitian yang menyebutkan berapa persen kadar saponin, vitamin A dan
C yang terdapat di dalam sirih merah.
Uraian beberapa kandungan kimia daun sirih merah adalah sebagai berikut:
a. Polifenol
Polifenol merupakan senyawa yang memiliki subkomponen berupa
fenol. Fenol sendiri dibagi menjadi beberapa jenis berdasarkan unit basanya dan
subkomponen fenolnya. Polifenol dibagi menjadi tiga jenis berdasarkan unit
basanya yaitu asam gallat, flavon dan asam sinamat. Masing-masing senyawa
tersebut berbeda mulai dari struktur sampai sifat aktivitas dan fungsinya
(Astawan, 2008).
Flavonoid merupakan salah satu senyawa golongan terbesar dalam
polifenol. Flavonoid berupa senyawa fenol, karena itu warnanya berubah bila
ditambah basa atau ammonia (Sesty, 2007). Flavonoid diketahui mempunyai efek
antioksidan yang kuat dengan cara menghambat oksidasi lipid. Komposisinya
mempunyai kemampuan untuk berinteraksi dengan membran sel untuk
melindungi dari radikal bebas (Saija, 1995). Flavonoid berperan dalam proses
antiinflamasi yaitu dengan cara mempersingkat waktu inflmasi sehingga proses
proliferasi dapat terjadi (Indraswari, 2011). Flavonoid juga berfungsi sebagai

10
antibakteri dengan cara membentuk senyawa kompleks terhadap protein
ekstraseluler yang mengganggu integritas membran sel bakteri (Cowan, 1999).
b. Alkaloid
Alkaloid mencakup senyawa bersifat basa yang mengandung satu atau
lebih atom N, biasanya dalam gabungan sebagai bagian dari sistem siklik.
Alkaloid biasanya tanpa warna, kebanyakan berbentuk kristal, hanya sedikit yang
berupa cairan. Senyawa alkaloid dapat dideteksi dengan pereaksi dragendorf
(Setsy, 2007). Alkaloid memiliki kemampuan sebagai antibakteri. Mekanisme
yang diduga adalah dengan cara mengganggu komponen penyusun peptidoglikan
pada sel bakteri, sehingga lapisan dinding sel tidak terbentuk secara utuh dan
menyebabkan kematian sel tersebut (Robinson, 1991).
c. Tanin
Tanin mempunyai efek antibakteri dengan cara dapat mengkerutkan
dinding sel atau membran sel sehingga mengganggu permeabilitas sel itu sendiri.
Akibat terganggunya permeabilitas, sel tidak dapat melakukan aktivitas hidup
sehingga pertumbuhannya terhambat atau bahkan mati (Ajizah, 2004).
d Saponin
Saponin tidak larut dalam pelarut non-polar, paling cocok diekstraksi
dengan etanol atau metanol 70-96 (Sesty, 2007). Saponin adalah salah satu
senyawa yang memacu pembentukan kolagen, yaitu protein struktur yang
berperan dalam penyembuhan luka (Chandel, 1979). Saponin juga diketahui dapat
meningkatkan kepadatan fibroblas dengan aktifasi TGF-β (Kanzaki, 1998).

11
e. Minyak Atsiri
Minyak atsiri yang aktif sebagai antibakteri pada umumnya mengandung
gugus fungsi hidroksil (-OH) dan karbonil. Turunan fenol berinteraksi dengan sel
bakteri melalui proses adsorpsi yang melibatkan ikatan hidrogen. Pada kadar
rendah terbentuk kompleks protein fenol dengan ikatan yang lemah dan segera
mengalami peruraian, diikuti penetrasi fenol ke dalam sel dan menyebabkan
presipitasi serta denaturasi protein. Pada kadar tinggi fenol menyebabkan
koagulasi protein dan sel membran mengalami lisis (Parwata dkk, 2008).
f. Vitamin A, E dan C
Vitamin A berperan dalam proses penyembuhan luka yaitu dalam
pembentukan kolagen, diferensiasi sel epitel, dan meningkatkan imunitas.
Vitamin A juga mempercepat aktifasi makrofag ke daerah luka (Jeffcoate, 2004).
Vitamin C diketahui berperan penting sebagai penunjang kesembuhan melalui
kemampuannya dalam mempercepat regenerasi jaringan. yaitu ikut serta dalam
biosintesa kolagen. Vitamin C juga berfungsi menstimulir respon kemotaktik dan
proliferasi dari neutrofil serta transformasi limfosit (Kus, 1996). Sedangkan
vitamin E memiliki efek antioksidan, yaitu mencegah peroksidasi lipid dan
menghasilkan membran sel yang stabil (Douglas, 2003).
2.1.4 Khasiat
Sirih merah memiliki banyak manfaat dalam pengobatan tradisional,
mempunyai potensi menyembuhkan berbagai jenis penyakit. Banyak pengalaman
menggunakan sirih merah dapat menurunkan asam urat, menurunkan tekanan
darah, mengobati hepatitis dan maag. Selain itu sirih merah dapat digunakan
12
sebagai antiseptik, serta memiliki efek hipoglikemik. Sirih merah juga dapat
digunakan sebagai obat untuk batuk, asma, radang tenggorokan, dan radang
hidung (Sulistyani dkk, 2007). Daun sirih merah juga bermanfaat bagi kesehatan
gigi dan mulut, antara lain: menghilangkan bau mulut, mengobati gusi berdarah
(radang pada gusi), obat sariawan, radang pada tenggorokan, gigi berlubang, dan
penghilang bengkak. Selain itu efek zat aktif yang terkandung dalam daun sirih
merah dapat merangsang saraf pusat dan daya pikir, serta memiliki efek
pencegahan ejakulasi dini, antikejang, antidiare, dan mempertahankan kekebalan
tubuh. Secara empiris ekstrak daun sirih merah dalam pemakaian secara tunggal
atau diformulasikan dengan tanaman obat lainnya mampu membasmi aneka
penyakit, seperti diabetes millitus, peradangan akut pada organ tubuh tertentu,
luka yang sulit sembuh, kanker payudara dan kanker rahim, leukimia, TBC,
radang pada lever (hepatitis), ambeien, jantung koroner, darah tingggi, dan asam
urat (Sudewo, 2005).
2.2 Uji Sitotoksisitas
Uji sitotoksisitas adalah bagian dari evaluasi bahan kedokteran gigi yang
diperlukan untuk prosedur skrining standar. Tujuannya adalah untuk mengetahui
efek toksik suatu bahan secara langsung terhadap kultur sel (Freshney, 2000).
Berikut adalah beberapa alasan mengapa dalam penelitian terdahulu lebih
banyak menggunakan metode in vitro dengan kultur sel:
1. Kultur sel dapat terpapar secara langsung oleh bahan yang diujikan,
sehingga kultur sel sangat sensitif terhadap bahan yang bersifat toksik.
13
2. Lingkungan pada kultur sel (pH, suhu, tekanan osmotik) lebih
terkontrol.
3. Respon terhadap sel hidup dapat langsung diamati.
4. Sampel lebih homogen.
5. Menghindari tekanan masyarakat terhadap hewan coba.
6. Dapat diukur secara kuantitatif.
Kekurangan metode in vitro dengan kultur sel, yaitu harus dilakukan
dalam kondisi aseptik, karena sel akan mati jika terkontaminasi mikroorganisme
(Freshney, 2000).
Pengujian efek biokompatibilitas pada tingkat awal dari material yang
digunakan pada kedokteran gigi untuk mengetahui toksisitas material yang diuji
menggunakan kultur sel. Toksisitas material yang diuji dihubungkan dengan sel
yang hidup. Apabila material yang diuji memberikan viabilitas sel hidup yang
tinggi, menunjukan bahwa material yang diuji tidak memberikan efek toksik,
begitu juga sebaliknya (Anita, 2005).
Salah satu syarat bahan yang digunakan dalam kedokteran gigi seharusnya
tidak toksik, tidak mengiritasi, dan harus mempunyai sifat biokompatibilitas atau
bahan yang diproduksi tidak boleh mempunyai efek yang merugikan terhadap
lingkungan biologis, baik lokal maupun sistemik. Salah satu metode untuk menilai
sitotoksisitas suatu bahan adalah dengan uji enzimatik menggunakan pereaksi
MTT. Paramater toksisitas berdasarkan CD50 artinya suatu bahan dikatakan toksik
apabila presentase sel hidup setelah terpapar bahan tersebut kurang dari 50%
(Telili dkk, 1999)

14
Salah satu metode untuk menilai sitotoksisitas suatu bahan adalah dengan
uji enzimatik yang menggunakan perekasi MTT [3-(4,5-dimethyltiazol-2-yl)-2,5-
difeniltetrazolium bromide]. Uji ini banyak digunakan untuk mengukur proliferasi
selular secara kuantitatif atau untuk mengukur jumlah sel yang hidup (Fazwishni
dkk, 2000).
MTT adalah molekul larut yang dapat digunakan untuk menilai aktifitas
enzimatis seluler, didasarkan pada kemampuan sel hidup untuk mereduksi garam
MTT. Prinsip dari pewarnaan MTT adalah dengan pengubahan dari cincin
tetrazolium oleh karena aktifitas dari mitokondria pada sel hidup. Pada sel yang
mati tidak mengakibatkan perubahan dari cincin tetrazolium (Soenartyo dkk,
2003).
Mekanismenya adalah formazan garam tetrazolium akan direduksi di
dalam sel yang mempunyai aktifitas metabolik. Mitokondria sel hidup yang
berperan penting dalam hal ini adalah yang menghasilkan dehidroginase. Bila
dehidroginase tidak aktif karena efek sitotoksik, maka formazan tidak akan
terbentuk. Jumlah formazan yang terbentuk, proposional dengan aktifitas
enzimatik sel hidup (Craig, 2002).
Gambar 2.2 Reduksi MTT yang menghasilkan formazan

15
(dikutip dari biotek.com)
Produksi formazan dapat dihitung dengan melarutkan dan mengukur
densitas optik dari larutan yang dihasilkan. Reaksi warna biru keunguan
digunakan sebagai ukuran dari jumlah sel hidup. Semakin pekat warna biru
ungunya, semakin tinggi nilai absorbsinya, dan semakin banyak jumlah sel yang
hidup. Jumlah formazan yang dihasilkan dan kemudian diukur setelah dilarutkan
berbanding secara proposional dengan jumlah sel, walaupun absorbansi absolut
berbeda antara berbagai jenis sel. Makin pekat warnanya, makin tinggi nilai
absorbansinya, dan ini berarti makin banyak jumlah selnya (Fernandez dkk,
1995;Fazwishni dkk, 2000).
Uji sitotoksistas dengan esei MTT dapat digunakan untuk mengukur
proliferasi dan sitotoksisitas terhadap sel. Ujinya cukup positif, cepat,
semiotomatis, dan tidak menggunakan radioisotop. Uji ini berdasar kemampuan
sel hidup untuk mereduksi garam [3-(4,5-dimethyltiazol-2-yl)-2,5-
difeniltetrazolium bromide] (MTT). Reduksi garam tetrazolium terjadi intrasel dan
melibatkan enzim dari retikulum endoplasma dan mitokondria. Dengan demikian
jumlah sel yang hidup dapat diukur sebagai konsentrasi hasil produksi MTT
(Fazwishni dkk, 2000).
2.3 Proses Penyembuhan Luka
Proses penyembuhan luka pada ulser pada dasarnya yaitu hampir sama
dengan proses penyembuhan luka pada kulit. Tahapan proses penyembuhan
meliputi proses keradangan, proliferasi, reepitalisasi, pembentukan jaringan
granulasi, angiogenesis, interaksi antara berbagai sel dan matriks, serta

16
remodelling jaringan (Goepel, 1992). Penyembuhan luka merupakan proses
pergantian sel yang rusak dengan sel yang baru, sehingga fungsi tubuh atau
jaringan akan pulih kembali dengan sempurna. Penyembuhan demikian disebut
regenerasi. Pada proses penyembuhan dari sel atau jaringan yang rusak akan
diganti dengan jaringan parut atau jaringan ikat (Sudiono dkk, 1995).
Pada fase inflmasi terjadi proses radang yang merupakan reaksi jaringan
hidup terhadap semua jejas. Hemostasis melibatkan konstriksi pembuluh darah,
kontraksi otot polos, agregasi tombrosit, koagulasi darah dan diikuti oleh
vasodilatasi yang disebabkan oleh adanya pelepasan histamin. Kemudian terjadi
aktivasi protombrin menjadi tombrin yang disebabkan oleh faktor-faktor
pembekuan darah, kemudian trombin akan mengaktivasi fibrinogen menjadi fibrin
dan platelet melepaskan mediator berupa PDGF (Platelet Derrived Growth
Factor), tromboksan dan prostaglandin yang akan menarik leukosit ke daerah
luka. Sel platelet melepaskan chemokines berupa growth factor (EGF/ Epithelial
Growth Factor, PDGF / Platelet Derived Growth Factor), fibrinogen, fibronektin,
serotonin dan komponen matriks ekstra seluler (Rosenberg,2006). Di dalam fase
inflmasi ini juga terdapat peningkatan permeabilitas pembuluh darah, dan terjadi
migrasi neutrofil dan monosit ke dalam jaringan (Douglas, 2003). Neutrofil
bertanggung jawab untuk menghancurkan bakteri dengan melakukan proses
fagositosis (Rosenberg, 2006). Pada hari ketiga setelah terjadi luka monosit
kemudian menggantikan fungsi neutrofil, dan kemudian disebut menjadi
makrofag apabila telah bermigrasi ke jaringan. Fungsi dari makrofag yaitu
melakukan fagositosis, membersihkan tempat yang terkontaminasi bakteri,
mengatur regulasi sintesa matriks melalui proses pelepasan growth factor platelet-
17
derived growth factor (PDGF), fibroblast growth factor (FGF), epidermal growth
factor (EGF) dan transforming growth factor-β (TGF-β), sitokin (TNF α / Tumor
Necroting Factor α, IL / Interlukin 1, 6, 8, IFN γ), enzim dan prostaglandin E2
untuk mengaktivasi sel dan angiogenesis (Rinastiti, 2003). Aktifasi makrofag saat
bermigrasi ke daerah yang mengalami keradangan diperlihatkan dalam bentuk
ukurannya yang bertambah besar, sintesis protein, mobilitas, aktifitas fagositik
dan kandungan enzim lisosom yang dimilikinya. Aktifasi ini diinduksi oleh
sinyal-sinyal, mencakup sitokin yang diproduksi oleh limfosit-T yang
tersensitisasi (IFN γ), endotoksin bakteri, berbagai mediator selama radang akut
dan protein matriks ekstrasel seperti fibronektin. Saat radang terjadi kronik,
makrofag dapat berakumulasi dan berproliferasi di tempat peradangan. Limfosit
yang teraktivasi akan mengeluarkan IFN γ yang akan mengaktivasi makrofag, dan
karena makrofag juga akan mengeluarkan IL-1 dan TNF yang akan mengaktivasi
limfosit, sehingga dengan demikian akan membentuk timbal balik antara
makrofag dan limfosit. Timbal balik tersebut menyebabkan makrofag akan
bertambah banyak di jaringan dan menyebabkan banyaknya jumlah makrofag di
daerah radang (Kumar dkk, 2000; Underwood 1999).
Pada fase proliferasi, sel fibroblas adalah salah satu faktor yang berperan
penting yaitu dengan berfungsi memproduksi kolagen dan protein Extracelullar
Matrix (ECM) yang merupakan komponen penting pada proses regenerasi atau
perbaikan luka. Aktivasi migrasi dan proliferasi fibroblas terjadi oleh karena
adanya pacuan dari molekul ECM serta growth factor. Fibroblast Growth Factor
(FGF), Transforming Growth Factor-beta (TGF-β), Platelet – Derivet Growth
Factor (PDGF) dan Epidermal Growth Factor (EGF) diketahui sebagai growth
18
factor yang bertanggung jawab terhadap migrasi dan proliferasi fibroblas
(Rinastiti, 2003). Pada tahap proliferasi ini, luka dipenuhi sel radang, fibroblas
dan kolagen yang membentuk jaringan lunak, berwarna merah muda dan granuler
yang disebut jaringan granulasi. Secara mikroskopik jaringan granulasi terdiri dari
pembuluh darah kecil yang baru dibentuk dengan latar belakang jaringan kendir
dan mengandung fibroblas serta sel-sel radang (Robins and Kumar, 1995).
Pembentukan pembuluh darah yang baru disebut angiogenesis. Proses
angiogenesis diinduksi oleh TGF (Transforming Growth Facor), PDGF (Platelet
Derived Growth Factor), interlukin 8 dan VEGF (Vascular Endhothelial Growth
Factor) (Enoch and Price, 2004).
Tabel 2.2 Growth Factor dalam penyembuhan luka
Growth Factor Singkatan Asal Efek

Epithelial Growth EGF  Makrofag Migrasi keratinosit,
Factor  Kelenjar saliva mitogen fibroblas dan
 Keratinosit keratinosit, membentuk
. jaringan granulasi
Transforming TGF-α  Makrofag Proliferasi sel hepatosit
Growth Factor-alfa  Keratinosit dan epitel,
 Limfosit T
Hepatocyte Growth HGF  Sel mesenkim Proliferasi sel epitel dan
Factor sel endotelial
Vascular Permabilitas pembuluh

Endhothelial Growth VEGF  Sel mesenkim darah, proliferasi sel
Factor endotelial, angiogenesis
Platelet Derived PDGF  Sel platelet Berperan dalam
Growth Factor  Makrofag pembentukan jaringan
 Sel endotelial granulasi, proliferasi sel
 Sel otot halus fibroblas dan sel
 Keratinosit endotelial, memproduksi
matriks
19
metalloproteinase dan
fibronektin,
Angiogenesis
Fibroblast Growth FGF-1, -2  Makrofag Proliferasi sel fibroblas
Factor 1 dan 2  Limfosit T dan keratinosit, migrasi
 Sel endotelial keratinosit, angiogenesis
 Sel fibroblas
Transforming TGF-β  Sel platelet Pembentukan jaringan
Growth Factor-β  Limfosit T granulasi, sintesis TIMP,
 Makrofag angiogenesis, proliferasi
 Sel endotelial keratinosit, pembentukan
 Keratinosit jaringan fibrosa,
 Fibroblas kemotaksis fibroblas
Keratinocyte Growth KGF  Fibroblas Migrasi, proliferasi dan
Factor diferensiasi keratinosit,
Fase terakhir dalam proses penyembuhan luka yaitu fase maturasi
(remodelling). Tujuan dari fase ini adalah menyempurnakan terbentuknya jaringan
baru menjadi jaringan penyembuhan yang kuat. Fibroblas sudah mulai
meninggalkan jaringan granulasi, warna kemerahan dari jaringan berkurang dan
serat fibrin dari kolagen bertambah banyak untuk memperkuat jaringan parut.
Luka dikatakan telah sembuh apabila terjadi kontinuitas lapisan kulit dan kekuatan
jaringan parut mampu atau tidak menganggu untuk melakukan aktifitas normal
(Samsuhidayat, 1997).
2.4 Antioksidan
Antioksidan adalah senyawa kimia yang dapat menyumbangkan satu atau
lebih elektron kepada radikal bebas, sehingga radikal bebas tersebut dapat
diredam. Antioksidan didefinisikan sebagai senyawa yang dapat menunda,
memperlambat, dan mencegah proses oksidasi lipid. Dalam arti khusus,

20
antioksidan adalah zat yang dapat menunda atau mencegah terbentuknya reaksi
radikal bebas (peroksida) dalam oksidasi lipid (Dalimartha dan Soedibyo, 1999).
Untuk kehidupannya, manusia maupun hewan tergantung pada oksigen.
Oksigen essensial berguna untuk kehidupan, bekerja melalui mekanisme reaksi
berurutan di dalam sel-sel tubuh, mempunyai batasan fungsi dan kemudian dapat
memberikan efek samping. Reaksi oksidasi yang lebih kompleks akan
menghasilkan radikal bebas, yang apabila tidak terdapat sistem antioksidan, akan
menghancurkan elemen vital sel-sel tubuh (Muchtadi, 2009). Berdasarkan sumber
perolehannya ada 2 macam antioksidan, yaitu antioksidan alami merupakan
antioksidan hasil ekstraksi bahan alami dan antioksidan buatan (sintetik) yang
merupakan antioksidan yang diperoleh dari hasil sintesa reaksi kimia (Kochhar
and Rossell, 1990). Mekanisme antioksidan dalam menghambat oksidasi atau
menghentikan reaksi berantai pada radikal bebas dari lemak yang teroksidasi
dapat disebabkan oleh empat macam mekanisme reaksi yaitu:
1. Pelepasan hidrogen dari antioksidan
2. Pelepasan elektron dari antioksidan
3. Adisi lemak ke dalam cincin aromatik pada antioksidan
4. Pembentukan senyawa kompleks antara lemak dan cincin aromatik dari
antioksidan (Winarti, 2010).
Prinsip kerja dari antioksidan dalam menghambat otooksidasi pada lemak yaitu
oksigen bebas di udara akan mengoksidasi ikatan rangkap pada asam lemak yang
tidak jenuh, kemudian radikal bebas yang terbentuk akan beraksi dengan oksigen
sehingga akan menghasilkan peroksida aktif (Winarti, 2010).

21
2.5 Sel Fibroblas
Fibroblas adalah sel pembentuk kolagen dan badan interseluler. Di
samping merupakan kesatuan hidup dari jaringan ikat, fibroblas berperan aktif
dalam sintesa protein yang menjadi materi dasar untuk pembentukan bahan antar
sel yang berbentuk maupun amorf. Fibroblas merupakan sel yang besar, agak
memipih, seringkali agak berbentuk bulat panjang dan ovoid, disetai tonjolan-
tonjolan sitoplasma tumpul yang bercabang. Intinya lonjong menyerupai bentuk
dari selnya dapat diperlihatkan dengan beberapa cara pewarnaan, misalnya dengan
pembuatan sediaan bentangan jaringan ikat yang diwarnai dengan cat basa seperti
methylene blue, dilihat dengan mikroskop cahaya, sitoplasma fibroblas yang tercat
pucat pada pewarnaan ini seringkali meluas secara teratur dari badan sel dalam
bentuk tonjolan-tonjolan (Leeson, 1996).
Pembentukan kolagen oleh sel fibroblas dari protein yang didahului
dengan pembentukan prokolagen yang dihasilkan oleh retikulum endoplasma,
dibentuk di celah ekstra sel dari molekul kolagen berupa serabut kolagen yang
menyusun sesuai dengan susunan molekul (Bloom, 2002).
Gambar 2.3 Sel Fibroblas (dikutip dari rejuvenal.info)

22
Fibroblas mampu tumbuh dan bergenerasi seumur hidup apabila ada
rangsangan. Misalnya, penyembuhan luka pada jaringan yang beradang. Fibroblas
dapat merupakan gerakan merambat secara perlahan. Pada luka terbuka, fibroblas
melakukan proliferasi dan migrasi ke tempat luka, kemudian fibroblas mensekresi
matriks ekstraseluluer, dan akhirnya terbentuk jaringan parut yang menutup luka
(Leeson, 1996).
BAB 3
KERANGKA KONSEPTUAL DAN HIPOTESIS PENELITIAN
3.1 Kerangka Konseptual Penelitian
Ekstrak etanol daun sirih merah

(Flavonoid)
antioksidan ↑
seas
Growth Factor (TGF-β)
proliferasi sel fibroblas ↑
seas
jumlah sel fibroblas
mati hidup
Keterangan:
= tidak diteliti
sel = diteliti
fibrobl = merangsang
as
23
24
3.2 Keterangan Kerangka Konseptual Penelitian
Daun sirih merah (Piper crocatum) diketahui mengandung beberapa
bahan aktif dan salah satunya yang diketahui paling banyak yaitu dari golongan
polifenol. Flavonoid merupakan salah satu senyawa golongan terbesar dalam
polifenol. Flavonoid telah diketahui mempunyai efek antioksidan. Antioksidan
berperan penting dalam menetralisasi radikal bebas dalam tubuh dan dapat
mempercepat proses inflamasi. Cara kerja flavonoid sebagai antioksidan yaitu
dengan menghambat oksidasi lipid. Hal ini dapat mengaktifkan transforming
frowth factor beta (TGF-β) dan meningkatkan proliferasi fibroblas. TGF-β
berperan dalam menstimulasi kemotaksis fibroblas dan proses produksi kolagen
dan fibronektin. Gumpalan fibrin yang terbentuk oleh peningkatan aktifitas
fibronektin akan menjadi kerangka bagi re-epitelisasi dan proliferasi fibroblas.
Karena adanya efek antioksidan yang dikandung oleh sirih merah (Piper
crocatum) itulah yang menjadi pertimbangan untuk menjadikan sirih merah
sebagai bahan alternatif obat untuk penyembuhan Stomatitis Aftosa Rekuren
(SAR) dengan melakukan uji biokompatibilitas sesuai dengan syarat material di
bidang kedokteran gigi terutama yang digunakan di dalam mulut.
Untuk mengetahui efek toksisitas ekstrak etanol daun sirih merah (Piper
crocatum) terhadap sel fibroblas maka perlu dilakukan uji sitotoksisitas dengan
menggunakan esei MTT. Hal ini dapat diketahui dengan tidak direduksinya garam
MTT karena tidak adanya aktifitas mitokondria sel yang hidup, dengan begitu
dapat diketahui berapa besar sifat toksik yang dimiliki oleh ekstrak daun sirih
merah.
25
3.3 Hipotesis Penelitian
Ekstrak etanol daun sirih merah (Piper crocatum) tidak bersifat toksik
terhadap sel fibroblas (BHK-21).

BAB 4
METODE PENELITIAN
4.1 Jenis Penelitian dan Rancangan Penelitian
Jenis penelitian ekperimental laboratoris dan rancangan penelitian
menggunakan post test only control group design.
4.2 Subjek Penelitian
Ekstrak etanol daun sirih merah konsentrasi 100%, 50%, 25%, dan 12,5%
4.3 Jumlah Sampel
Penentuan banyaknya sampel juga dapat diperoleh dengan menggunakan
rumus (Lameshow, 1990):
n = 2σ (Z1- ½ α + Z1- β)2
(μ1 - μ2)2
= 2. 0,043954 (1,96+0,842)2
(0,109875 – 0,476875)2
=7
Keterangan:
n = jumlah sampel penelitian
σ = standar deviasi
Z = konstanta
µ1 = rata-rata kontrol
µ2 = rata-rata perlakuan
26
27
4.4 Variabel Penelitian
4.4.1 Variabel bebas
Konsentrasi ekstrak etanol daun sirih merah 100%, 50%, 25%, dan
12,5 %.
4.4.2 Variabel tergantung
Jumlah sel fibroblas BHK-21 yang hidup
4.4.3 Variabel kendali
Waktu panen, cara kerja, sterilisasi, cara pengukuran sampel
4.5 Definisi Operasional Variabel
1. Ekstrak etanol daun sirih merah (Piper crocatum) adalah sediaan pekat
yang didapat dengan cara maserasi daun sirih merah dengan menggunakan
pelarut etanol.
2. Uji sitotoksisitas adalah cara menguji sitotoksis suatu bahan dengan
menghitung jumlah sel yang hidup, setelah terpapar bahan yang akan diuji.
3. Sel BHK-21 adalah kultur sel fibroblas ginjal hamster (Baby Hamster
Kidney) yang diperoleh dari Pusat Veterinaria Farma (PUSVETMA)
Surabaya.
4. Esei MTT adalah pemecahan cincin tetrazolium MTT [3-(4,5-
dimethyltiazol-2-yl)-2,5-difeniltetrazolium bromide) oleh dehidrogenase
pada mitokondria yang aktif, menghasilkan produk formazan biru
keunguan yang tidak larut. Produksi formazan dapat dihitung dengan
mengukur densitas optik dari larutan yang dihasilkan. Reaksi warna biru
28
keunguan digunakan sebagai ukuran dari jumlah sel hidup dengan bantuan
alat Elisa reader.
4.6 Lokasi Penelitian
Pusat Veterinaria Farma (PUSVETMA) Surabaya.
4.7 Alat dan Bahan
Alat:
1. Filter Milipore Minisart
2. Flask (Nunc)
3. Microplate
4. Pipet pasteur
5. Shaker Vari Shaker (Dyanatech)
Gambar 4.1 Shaker
6. Incubator ESCO
7. Laminator flow (Clemcot Australia)
8. Elisa reader 620 nm (Opsysmr Denmark)
9. Multichannel
10. Singlechannel
29
Bahan:
1. Ekstrak daun sirih merah
2. Kultur sel BHK-21 dari PUSVETMA Surabaya
3. Media kultur berisi Eagle’s minimum essential medium (MEM)
4. Penstrep 1%
5. Kanamycin
6. Foetal Bovine Serum (FBS) 5%
7. Fungizone 100 unit/ml
8. Pereaksi MTT
9. Phospat Buffer Saline (PBS)
10. Dimethlysulfoxide Analar (DMSO)
11. Aquadest steril
4.8 Cara Kerja
4.8.1 Persiapan Pembuatan Ekstrak Etanol Daun Sirih Merah
1. Timbang serbuk daun sirih merah yang akan diekstraksi sebanyak 200 g.
2. Lakukan pembasahan serbuk sirih merah dengan pelarut alkohol 70 %
sebanyak 200 ml.
3. Masukkan serbuk kedalam toples dan ratakan, tambahkan pelarut alkohol
400 ml sampai serbuk terendam , tutup rapat.
4. Diamkan selama 5 malam dan setiap hari diaduk .
5. Saring filtrate dan tampung, ampas ditambahkan lagi pelarut alkohol 70 %
sebanyak 200 ml diamkan semalam.

30
6. Saring lagi filtrate kedua, campurkan dengan filtrate pertama, ampas
ditambahkan lagi dengan alkohol 70% sebanyak 200 ml, diamkan semalam.
7. Saring lagi filtrate, campur dengan hasil sebelumnya.
8. Kentalkan filtrate/ekstrak cair dengan rotary evaporator.
9. Tampung dan masukkan botol.
(Dinkes Prop. Jatim, UPT Materia Medica Batu)
Dari serbuk daun sirih merah sebanyak 200 gram dan menggunakan pelarut
alkohol 70% total sebanyak 1000 ml maka didapatkan hasil ekstrak sebanyak
175 ml ekstrak kental daun sirih merah.
4.8.2 Pengenceran Ekstrak Etanol Daun Sirih Merah
Proses pengenceran ekstrak etanol daun sirih merah dilakukan dengan cara
menggunakan rumus:
X= konsentrasi yang diminta x jumlah yang diminta

konsentrasi yang tersedia
Keterangan:
X = jumlah yang akan diambil
(Tambayong, 2001).
Maka didapatkan hasil sebagai berikut:
a. Konsentrasi 50% = 0,5 ml ekstrak 100% + 0,5 ml media
b. Konsentrasi 25% = 0,25 ml ekstrak 100% + 0,75 ml media
c. Konsentrasi 12,5% = 0,125 ml ekstrak 100% + 0,875 ml media

31
4.8.3 Uji Sitotoksisitas
1. Disiapkan kultur sel BHK-21, microplate dengan 96 well steril di dalam
laminar flow.
2. Well pada microplate diisi sel dengan kepadatan 6x dalam media
kultur Eagels’s minimum essential medium (MEM), Kanamycin, Penstrep
1%, Foetal Bovine Serum (FBS) 5%, Fungizone 100 unit/ml, sebanyak 100
µl.
Gambar 4.2 Microplate berisi media Eagle’s minimum essential medium

(MEM)
3. Konsentrasi ekstrak etanol daun sirih merah 100%, 50%, 25%, dan
12,5% difilter menggunakan milipore 0,45 µm, diambil 50 µl untuk setiap
well. Disiapkan pula kontrol sel dan kontrol media. Kontrol sel adalah tiap
well berisi sel dan media kultur saja. Kontrol media adalah tiap well yang
berisi media kultur saja.
4. Kemudian microplate di inkubasi selama 20 jam pada suhu 37 C, 5%
CO2..
5. Microplate dikeluarkan dari alat inkubasi, media di dalam well dibuang ,
sel akan tertinggal dalam well. Pereaksi MTT dalam PBS yang telah
32
difilter menggunakan milipore 0,20 µm ditambahkan sebanyak 10 µl untuk
setiap well. Inkubasi selama 4 jam.
6. Setelah masa inkubasi selesai, MTT diambil menggunakan multichannel
kemudian ditambahkan dimethlysulfoxide analar (DMSO) sebanyak 50 µl
tiap well untuk menghentikan produk metabolik MTT. Untuk melarutkan,
microplate di shaker selama 5 menit.
7. Nilai densitas optik formazan dibaca dengan Elisa reader
Gambar 4.3 Elisa Reader
8. Untuk mengetahui presentase jumlah sel hidup dilakukan dengan
memakai rumus (Doyle dkk, 2000):
% sel hidup = x 100%

33
4.9 Alur Penelitian
Identifikasi tanaman
Persiapan ekstrak daun sirih merah
Uji sitotoksisitas menggunaikan esei MTT

Microplate dengan 96 well (sumuran)

Masukan kultur sel BHK- 21 dengan kepadatan
6x103 dalam media kultur Eagle’s minimum
essential medium (MEM), Kanamycin,
Penstrep 1%, Foetal Bovine Serum (FBS) 5%,
Fungizone 100 unit/ml
Tambahkan ekstrak sirih merah dengan berbagai

konsentrasi sesuai kelompok sampel sebanyak
50 µl untuk tiap well (sumuran)
Microplate diinkubasi selama 20 jam pada suhu 37 C, 5% CO2
Microplate dikeluarkan dari inkubator, media

di dalam well diambil dan ditambahkan MTT
5mg/ml dalam PBS sebanyak 10 µl untuk tiap
well.
Microplate diinkubasi kembali selama 4 jam
Setelah diinkubasi selesai, MTT diambil menggunakan multichannel.

Ditambahkan dimethlysulfoxide analar (DMSO) sebanyak 50 µl untuk
tiap well. Kemudian di shaker selama 5 menit.
Nilai densitas optik formazan dibaca dengan Elisa reader

34
4.10 Pengolahan dan Analisis Data
Hasil pengukuran ditabulasi menurut kelompok masing-masing, kemudian
dilakukan pengujian statistik untuk menentukan apakah data tersebut terdistribusi
normal dan homogen. Analisis data menggunakan uji Kruskal-Wallis Test dan
dilanjutkan dengan Mann-Whitney Test (Trihendradi, 2008).

BAB 5
HASIL PENELITIAN DAN ANALISIS DATA
Hasil pembacaan berupa tingkat absorbansi atau optical density. Semakin
tinggi angka optical density, menunjukan jumlah sel fibrobas yang hidup semakin
banyak. Nilai optical density dari formazan pada ekstrak etanol daun sirih merah
(Piper crocatum) yang diukur dengan elisa reader dapat dilihat pada tabel 5.1
Tabel 5.1 Nilai rerata optical density pada formazan ekstrak etanol daun sirih
merah (Piper crocatum), simpang baku dan persentase sel hidup
PERLAKUAN Nilai Optical Density
X SD %
Konsentrasi 100% 0,5961 0,045889 100%
Konsentrasi 50% 0,2020 0,019330 63,47 %
Konsentrasi 25% 0,1480 0,013089 52,52%
Konsentrasi 12,5% 0,1662 0,059679 56,21%
Kontrol Media 0,1111 0,010637 0%
Kontrol Sel 0,3822 0,047264 100%
Keterangan:
X = Rerata nilai optical density
SD = Simpang Baku
% = Rerata persentase sel hidup
35
36
100
80
60
Persentase sel
fibroblas yang
40
hidup
20
0
12,5% 25% 50% 100%
Gambar 5.1 Grafik jumlah persentase sel fibroblas yang hidup
Pada gambar 5.1 tampak bahwa yang menunjukan nilai optical density
yang paling tinggi pada kelompok perlakuan konsentrasi 100%, sedangkan yang
menunjukan nilai optical density yang paling rendah pada kelompok perlakuan
konsentrasi 25%.
Data hasil penelitian berupa data parametrik, kemudian digunakan uji
normalitas Kolmogorof-Smirnof Test yang menunjukan seluruh kelompok
mempunyai nilai probabilitas lebih besar dari 0,05 (p>0,05), artinya seluruh
kelompok berdistribusi normal. Kemudian dilakukan uji homogenitas varians
dengan Levene’s Test didapatkan p=0,006, ini menunjukan kelompok tidak
homogen karena tidak memenuhi p>0,05.
Setelah diketahui semua kelompok mempunyai distribusi normal dan tidak
homogen, maka untuk mengetahui adanya perbedaan nilai optical density pada
formazan dilakukan uji Kruskal-Wallis Test yang menunjukan nilai p= 0,000

37
(memenuhi syarat p < 0,05) sehingga dapat disimpulkan terdapat perbedaan yang
bermakna.
Kemudian analisis data dilanjutkan menggunakan Mann-Whitney Test
untuk membandingkan perbedaan antar kelompok konsentrasi dan kelompok
kontrol. Dari hasil yang didapatkan uji statistik Mann-Whitney Test (tabel 5.2),
jika nilai p<0,05 menunjukkan bahwa ada perbedaan bermakna, sedangkan jika
nilai p>0,05 menunjukan bahwa tidak ada perbedaan bermakna.
Tabel 5.2 Mann-Whitney Test antar perlakuan dan kontrol
Kelompok 100% 50% 25% 12,5% Kontrol Kontrol
sel media
100% - 0,002* 0,002* 0,002* 0,002* 0,002*
50% - 0,003* 0,109 0,002* 0,002*
25% - 0,701 0,002* 0,003*
12,5% - 0,002* 0,004*
Kontrol sel - 0,002*
Kontrol media -
Keterangan: *= menunjukan adanya perbedaan yang bermakna
Pengujian Mann-Whitney Test menunjukan bahwa ada perbedaan antara
masing-masing kelompok konsentrasi 100%, 50%, 25%, dan 12,5% dengan
kontrol. Sedangkan kelompok konsentrasi 12,5% terhadap konsentrasi 50% dan
konsentrasi 25% tidak terdapat perbedaan yang bermakna.

BAB 6
PEMBAHASAN
Sirih merah (Piper crocatum) merupakan salah satu tanaman yang dapat
dimanfaatkan sebagai obat alternatif. Telah dilakukan uji identifikasi kandungan
kimia ekstraketanol daun sirih merah dan didapatkan bahwa sirih merah
mengandung alkaloid, saponin, flavonoid dan polifenolat (Yulias dkk, 2011).
Selain itu daun sirih merah mengandung nilai nutrisi yang dibutuhkan untuk
peningkatan proses penyembuhan, misalnya vitamin A dan C (Prahastuti, 2004).
Sedangkan pada penelitian lain menunjukan bahwa komponen senyawa yang
terkandung pada ekstraketanol 70% daun sirih merah adalah golongan asam
lemak, terpenoid, flavonoid, steroid, alkaloid, pirimidin, minyak atsiri, polifenol
dan vitamin E (Alfarabi, 2010). Hal ini dapat menjadi bahan pertimbangan untuk
penggunaan daun sirih merah sebagai bahan obat alternatif untuk Stomatitis
Aftosa Rekuren (SAR).
Untuk mengembangkan bahan pengobatan Stomatitis Aftosa Rekuren
(SAR) yang alami maka harus diuji terlebih dahulu dengan uji biokompatibilitas
sesuai dengan syarat material di bidang kedokteran gigi terutama yang digunakan
di dalam mulut. Salah satu pengujian untuk menentukan berbagai sifat dari suatu
bahan kedokteran gigi adalah uji sitotoksisitas terhadap jaringan (Maat, 2001).
Untuk mengetahui sitotoksisitas ekstrak etanol daun sirih merah (Piper crocatum)
maka dilakukan pengujian terhadap sel fibroblas menggunakan esei MTT.
Penelitian uji sitotoksisitas ekstrak etanol daun sirih merah terhadap sel
fibroblas ini menggunakan ekstrak etanol daun sirih merah dengan konsentrasi
100%, 50%, 25%, dan 12,5%.
38
39
Penelitian ini merupakan uji pendahuluan, yaitu uji toksisitas dari bahan
secara in vitro yang diujikan secara langsung pada kultur sel atau jaringan. Uji
sitotoksisitas dapat dilakukan dengan menggunakan hewan coba secara in
vivo atau menggunakan kultur sel secara in vitro. Prinsip dasar
menumbuhkan sel secara in vitro adalah merancang sistem kultur agar
menyerupai keadaan in vivo. Sel yang akan diteliti dipindah dari jaringan asalnya,
kemudian ditempatkan dalam wadah kultur untuk mendapatkan tempat
pertumbuhan dan nutrisi yang cukup pada temperatur 37 C dan lingkungan gas
(95% CO2 95% udara) pada pH 7,4-7,7 (Freshney, 2000).
Uji sitotoksisitas menggunakan esei MTT ini berdasar kemampuan sel
hidup untuk mereduksi garam [3-(4,5-dimethyltiazol-2-yl)-2,5-difeniltetrazolium
bromide] (MTT). Reduksi garam tetrazolium terjadi di intrasel dan melibatkan
enzim dari retikulum endoplasma dan mitokondria. Dengan demikian jumlah sel
yang hidup dapat diukur sebagai konsentrasi hasil produksi MTT. Parameter
sitotoksisitas yang utama berdasarkan pada nilai absorbansi. Apabila warna sel
semakin pekat (biru keunguan), maka nilai absorbansi semakin tinggi yang berarti
semakin banyak sel yang hidup. Namun bila warna sel semakin pudar, maka nilai
absorbansi semakin rendah, artinya banyak sel yang mati (Fazwishni dkk, 2000).
Pada penelitian uji sitotoksisitas ekstrak etanol dauh sirih merah (Piper
Crocatum) terhadap sel fibroblas ini didapatkan bahwa jumlah sel hidup pada
konsentrasi 100%, 50%, 25%, 12,5% secara berurutan adalah 100%, 63,47%,
52,52%, dan 56,21%. Hal ini berarti persentase sel hidup menunjukan lebih dari
50% setelah terpapar ekstraketanol daun sirih merah (Piper crocatum) yang
menunjukan sirih merah tidak bersifat toksik (Telili dkk, 1999).

40
Nilai absorbansi tertinggi didapatkan pada kelompok yang menggunakan
ekstrak etanol daun sirih merah (Piper crocatum) dengan konsentrasi 100% dan
terendah pada kelompok yang menggunakan ekstraketanol daun sirih merah
(Piper crocatum) dengan konsentrasi 25%. Pada konsentrasi 12,5%, 25% dan
50% tidak memiliki perbedaan yang bermakna, kemungkinan dikarenakan bahan
aktif yang terkandung di dalamnya juga semakin sedikit. Pada konsentrasi 12,5%,
dan 25% jumlah sel fibroblas mengalami penurunan. Mekanisme dan intensitas
kematian sel tergantung pada kadar bahan atau obat yang berkontak dengan sel.
Sel yang terpapar bahan atau obat melebihi puncak paparan akan menyebabkan
kematian sel (Soenartyo, 2003). Pada konsentrasi 100% memiliki jumlah
persentase sel hidup sebesar 100% yang artinya tidak terjadi kematian sel. Hal ini
disebabkan kemungkinan oleh adanya kadar bahan yang terkandung dalam sirih
merah yang berpengaruh terhadap proliferasi sel fibroblas. Berdasarkan analisis
GC-MS (Gas Chromatogrpahy Mass Spectrometry ekstrak etanol daun sirih
merah (Piper crocatum) 70% ditemukan bahwa polifenol merupakan bahan aktif
yang paling banyak terdapat dalam sirih merah yaitu sebesar 44,69% (Alfarabi,
2010). Flavonoid merupakan salah satu senyawa golongan terbesar dalam
polifenol. Flavonoid merupakan senyawa yang terdapat dalam sirih merah (Piper
crocatum) yang diketahui berperan dalam proses antiinflamasi dan mempunyai
efek sebagai antioksidan. Flavonoid berfungsi untuk membatasi pelepasan
mediator inflmasi dengan cara penghambatan siklooksigenase dan lipoksigenase
sehingga terjadi pembatasan jumlah sel inflamasi yang bermigrasi ke jaringan
perlukaan. Selanjutnya reaksi inflamasi akan berlangsung lebih singkat dan
kemampuan proliferatif dari transforming growth factor-β (TGF-β) tidak

41
terhambat sehingga proses proliferasi segera terjadi. Aktifitas flavonoid dalam
mempercepat proses penyembuhan luka didukung juga oleh mekanisme
antioksidan dalam melakukan penghambatan aktifitas radikal bebas (Indraswary,
2011). Hal ini didukung oleh penelitian yang telah dilakukan sebelumnya yang
membuktikan bahwa daun sirih merah mempunyai kemampuan antioksidan yang
disebabkan adanya kandungan flavonoid yang bekerja dengan jalan menghambat
oksidasi lipid (Alfarabi dkk, 2010). Antioksidan mampu memblokir inisiasi dari
susunan radikal bebas sehingga hormon pertumbuhan (Growth Factor) dapat
memicu proliferasi sel fibroblas (Kumar dkk, 2000). Migrasi dan proliferasi dari
sel fibroblas dipengaruhi oleh sejumlah Growth Factor seperti platelet-derived
growth factor (PDGF), fibroblast growth factor (FGF), epidermal growth factor
(EGF) dan transforming growth factor-β (TGF-β). TGF-β yang terkandung dalam
sel inflmasi, jika muncul akan memberikan peran yang penting karena dapat
mempengaruhi deposisi dari jaringan fibrous. Hal ini dikarenakan TGF-β
diproduksi oleh sel-sel dalam jaringan granulasi serta menyebabkan migrasi dan
proliferasi sel fibroblas (Vegad, 1995). Stimulasi TGF-β akan meningkatkan
aktifitas fibronektin di dalam pembentukan gumpalan fibrin. Gumpalan fibrin
yang terbentuk oleh peningkatan aktifitas fibronektin akan menjadi kerangka bagi
re-epitelisasi dan proliferasi fibroblas (Indraswary, 2011). Selain polifenol, sirih
merah juga diketahui mengandung mengandung alkaloid, saponin, flavonoid dan
polifenolat (Yulias dkk, 2011). Daun sirih merah juga mengandung nilai nutrisi
yang dibutuhkan untuk peningkatan proses penyembuhan, misalnya vitamin A
dan C (Prahastuti, 2004) Saponin diketahui sebagai salah satu senyawa yang
memacu pembentukan kolagen, dan dapat meningkatkan kepadatan fibroblas

42
dengan aktifasi TGF-β (Kanzaki, 1998). Selain itu terpenoid merupakan bahan
aktif yang membantu mempercepat pembentukan sabut kolagen yang dihasilkan
oleh sel fibroblas (Waha, 2000). Bahan aktif lain yang terkandung dalam sirih
merah yaitu vitamin A dan vitamin C yang berperan secara tidak langsung
terhadap proliferasi sel fibroblas. Vitamin A dapat mempercepat fase inflmasi ke
fase proliferasi dengan meningkatkan monosit dan makrofag ke daerah luka
(Jeffcoate dkk, 2004). Salah satu fungsi makrofag yaitu menghasilkan Gowth
factor yang berperan dalam proliferasi sel fibroblas (Vegad, 1995). Selain itu
vitamin A dapat mempengaruhi aktifitas sel limfosit T dan produksi sitokin.
Berdasarkan sitokin yang dihasilkan sel T helper (Th) dibagi menjadi Th1 dan
Th2. Sel Th1 akan menghasilkan sitokin interlukin-2 (IL-2) dan Tumor Necrosis
Factor (TNF) yang berperan langsung dalam mengaktifkan makrofag. Vitamin A
dalam bentuk asam retinoat (alltrans retinoic acid) juga merupakan regulator
transkripsional ekspresi gen yang mengkode sitokin stimulator terhadap makrofag
yaitu interferon-alpha (IFN-γ) dan interlukin-4 (IL-4) (Isnaeni, 2012). Vitamin C
berfungsi menstimulir respon kemotaktik dan proliferasi dari neutrofil serta
transformasi limfosit. Material-material yang terlepas dari neutrofil dapat
menstimulasi migrasi dan proliferasi dari sel fibroblas. Neutrofil memproduksi
dan melepaskan mediator inflamasi seperti Tumor Necrosis Factor alpha (TNF-α)
dan interlukin-1 (IL-1) yang mempercepat aktifasi sel fibroblas dan sel epitel
(Rinasiti, 2003). Hal ini dapat dijadikan pertimbangan untuk mengembangkan
potensi daun sirih merah sebagai obat penyembuh luka dalam perawatan SAR
(Stomatitis Aftosa Rekuren).

BAB 7
SIMPULAN DAN SARAN
7.1 Simpulan
Dari hasil penelitian eksperimental laboratoris sitotoksisitas ekstrak etanol
daun sirih merah (Piper crocatum) terhadap sel BHK-21 menggunakan esei MTT
ini dapat diambil kesimpulan sebagai berikut:
1. Ekstrak etanol daun sirih merah (Piper crocatum) tidak toksik terhadap sel
BHK-21.
2. Sitotoksisitas terendah terhadap sel BHK-21 didapatkan pada ekstrak
etanol daun sirih merah (Piper crocatum) dengan konsentrasi 100%.
7.2 Saran
1. Perlu penelitian lebih lanjut tentang sitotoksisitas ekstrak etanol daun sirih
merah (Piper crocatum) menggunakan hewan coba secara in vivo.
2. Perlu penelitian lebih lanjut tentang penggunaan bahan sirih merah (Piper
crocatum) untuk pengobatan Stomatits Aftosa Rekuren (SAR).
43
DAFTAR PUSTAKA
Ajizah A. 2004. Sensitivitas Salmonella typhimurium Terhadap Ekstrak Daun

Psidium guajava L. Bioscientiae. 1(1): 8-31
Alfarabi M. 2010. Kajian Antidiabetogenik Ekstrak Daun Sirih Merah (Piper

crocatum) In Vitro. Karya Tulis Akhir. Institut Pertanian Bogor. p.30
Alfarabi M, Bintang M, Suryani, Safihri M. 2010. The Comparative Ablity of

Antioxidant Activity of Piper crocatum in Inhibiting Fatty Acid Oxidation
and Free Radical Scavenging. Hayati Journal of Biosciences. Availabe at
http://journal.ipb.ac.id/index.php/hayati. Accessed on January, 2013
Anita Y. 2005. Uji Biokompatibilitas Resin Akrilik Jenis Otopolimerisasi pada Sel
Fibroblas. Majalah Kedokteran Gigi Universitas Airlangga. 63: 128
Ariyani M, Kusumaningsih T, Rahardjo M.S. 2007. Daya Hambat Ekstrak Daun

Jambu Mente (Anarcadium ociidentale) Terhadap Pertumbuhan
Streptococcus sanguis. Jurnal PDGI. 57:45
Astawan M, Kasih, Andreas L. 2008. Khasiat Warna-Warni Makanan. Gramedia

Pustaka Utama Jakarta. p. 31
Bloom F. 2002. Buku Ajar Histologi. Cetakan I. Jakarta. EGC. p. 130-3
Chandel RS and Rastogi RP. 1979. Triterpenoid Saponin and Sapogenin.

Phytochemistry. 19: 1889–908
Cowan MM. 1999. Plant Products as Antimicrobial Agents. Clinical

Microbiology Reviews 12(4): 564–82
Craig RG and Powell JM. 2002. Restorative Dental Materials. 6th wd. London.
Mosby Co. p. 135-40
Dalimartha S dan Soedibyo M. 1999. Awet Muda Dengan Tumbuhan Obat dan
Diet Supleme. Trubus Agriwidya. p. 36-40
Duryatmo S. 2005. Dulu Hiasan Kini Obat. Trubus. p. 427-37
Douglas M and Alan L.Miller. 2003. Nutritional Support for Wound Healing.
Availabe at http://www.thorne.com/altmedrev/.fulltext/8/4/359.pdf.
Accessed on January 2013
Doyle A and Grififths JB. 2000. Cell and Tissue Culture for Medical Research.
John Wiley & Sons. LTD. New York. p. 49
44
45
Enoch S and Price P. 2004. Cellular, Molecular and Biochemical Difference in

The Pathophysiology of Healing Between Acute Wounds, Chronnic
Wounds in The Aged. Available at http://www.worldwidewounds.com.
Accessed on January 2013
Fazwishni S dan Hadjiono BS. 2000. Uji Sitotoksisitas dengan Esei MTT. Jurnal
Kedokteran Gigi Universitas Indonesia. 7: 28-32
Fernandez BR and Vetviaeka V. 1995. Method in Cellular Immunology. CRC

Press. Boca raton, New York, London, Tokyo. p. 47-52
Freshney RI. 2000. Culture of Animal Cell; a Manual of Basic Technique 4th
Edition. New York: Wiley Liss Inc. p. 329-60
Froschle M, Pluss, Peter A, Etzweiler E, Ruegg D. 2004. Phytosteroid for Skin

Care. p. 55-8
Goepel. 1992. Oral Pathology. New York: McMillan Publ. p. 21-7
Harahap AO. 2006. Kesembuhan Stomatitis Aftosa Rekuren (SAR) Minor Dengan
Pemberian Daun Pegagan (Centella asiatica). Jurnal Ilmiah dan
Teknologi Kedokteran Gigi FKG UDPM Jakarta. p. 92-5
Indraswary R. 2011. Efek Konsentrasi Ekstrak Buah Adas (Foeniculum vulgare

Mill.) Topikal Pada Epitelisasi Penyembuhan. Jurnal Majalah Ilmiah
Sutlan Agung. 59:124
Inggit P dan Esti M. 2011. Karakteristik Morfologi Daun Sirih Merah: Piper
crocatum dan Piper porphyrophyllym N.E.Br. Koleksi Kebun Raya Bogor.
Berkas Penelitian Hayati Edisi Khusus 7A: 83-5
Isnaeni U, Iswari RS, Harini NW. 2012. Pengaruh Pemberian Vitamin A

Terhadap Penurunan Parasitemia Mencit yang Diinfeksi Plasmodium
berghei. Unnes Journal of Life Science.
http://journal.unnes.ac.id/sju/index.php. Accesed on January 2013
Jeffcoate W, Price P and Harding KG. 2004. Wound Healing and Treatments for
People With Diabetic Foot Ulcers. Diabet Metab Res Rev 20(1):78-89
Juliantina F, Dewa Ayu Citra M, Bunga N, Titis N dan Endrawati T. 2009.

Manfaat Sirih Merah (Piper crocatum) Sebagai Agen Anti Bakteri
Terhadap Bakteri Gram Positif dan Gram Negatif. Jurnal Kedokteran dan
Kesehatan Indonesia.10: 1-10
Kanzaki T, Moraski N, Shiina R, Saito Y. 1998. Role of Transforming Growth

Factor-β Pathway in The Mechanisme of Wound Healing By Saponin from
Ginseng Radix Rubra. Br. J. Pharmacol. 125:255-62
46
Kochar SP and Rosell B. 1990. Detection Estimation and Evaluation of

Antioxidants in Food System. Elvisier Applied Science London. p. 19-64
Kumar V, Cotran R, Robbins S. 2000. Buku Ajar Patologi 7th ed. Jakarta:EGC. p.
56-63
Kus H.1996. Peranan Vitamin C (Asam askorbat) Dalam Kesehatan Jaringan

Rongga Mulut. Majalah Kedokteran Gigi. 3:29, p. 5-62
Lameshow S, Homer Jr. DW, Klar J, Lwanga SK. 1990. Adequacy of Sample Size
in Health Studies. Toronto: World Health Organization pub. John Wuley
and Sons. p. 9-11
Lesson CR, Leeson TS, Papparo AA. 1996. Buku Ajar Histologi. Edisi V. Cetakan
VI. Jakarta. EGC. p. 116-7
Maat S. 2001. Sterilisasi dan Disinfeksi. Ceramah Sehari Penyucihamaan

(sterilisasi) Sarana Pelayanan Kesehatan. Patologi Klinik RSUD Dr.
Soetomo Surabaya. p. 14
Muchtadi D. 2009. Gizi Anti Penuaan Dini. CV Alfabet Bandung. p. 45-67
Parwata I.M.O.A dan Dewi P. 2008. Isolasi Dan Uji Aktivitas Antibakteri Minyak
atsiri Dari Rimpang Lengkuas (Alpinia galanga L.). Jurnal Kimia 2 (2:
100-4
Prahastuti S dan Tambunan K. 2004. Tinjauan Literatur Sirih. Pusat Dokumentasi

dan Informasi Ilmiah (PDII) Jakarta
Regezy JA, Sciubba JJ, and Jordan RC. 2003. Oral Pathology. Ed. USA, Sanders.
p. 38-42
Rinastiti M. 2003. Pengaruh Membran Amnion Terhadap Jumlah Sel Fibroblas

Pada Proses Penyembuhan Luka. Majalah Kedokteran Gigi (Dental
Journal) Jakarta : UI. p. 639-43
Robins SL and Kumar V. 1999. Buku Ajar Patologi I 4th Edition. Jakarta. p. 53-65
Robinson T. 1991. Kandungan Organik Tumbuhan Tingkat Tinggi. ITB Bandung.

p. 132-6
Rosenberg L. 2006. Wound Healing Growth Factor. Available at

www.woundhealing.com. Accessed on January 2013
Saija A, Scales M, Lanz M, Marzullo D, Bonina F, Castelli F. 1995. Flavonoids

as antioxidants agents. FRBM. 19:481-6
Samsuhidayat. 1997. Buku Ajar Ilmu Bedah. Jakarta. EGC. p. 72-3

47
Sesty R. 2007. Studi Maksroskopi, Mikroskopi, dan Skrining Fitokimia Daun

Anredera cordifolia (Ten.) Steenis. Karya Tulis Akhir. Fakultas Farmasi
Universitas Airlangga Surabaya. p. 28-9
Soenartyo H. dan Rianti Devi. 2003. Uji sitotoksisitas Ekstrak Coleus amboinicuc,
Lour Menggunakan Esei MTT. Majalah Kedokteran Gigi (Dental journal).
36(2)
Sudewo B. 2005. Basmi Penyakit dengan Sirih Merah. PT Agromedia p. 38-42
Sudiono J, Kurniadhi B, Hendrawan A dan Djiamantoro. 1995. Ilmu Patologi.

Jakarta:Penerbit Buku Kedokteran EGC. p. 112-6
Sulistyani N, Sasongko H, Hertanti M, Meilana L. 2007. Aktivitas Minyak Atsiri

Daun Sirih Merah (Piper crocatum Ruiz and Pav) terhadap Staphylococcus
aureus, Escherichia coli dan Candida albicans Serta Identifikasi
Komponen Kimianya. Med Far. 6(2):33-9
Tambayong, J. 2001. Farmakologi untuk Keperawatan. Jakarta: Widya Medika.

p. 37-8
Telili C, Serper A, Dogan AL, Guc D. 1999. Evaluation of The Cytotoxicity of

Calcium Phospate Root Canal Sealers by MTT Assay. J Endodont. 25: 811
Trihendradi C. 2008. SPSS 16 Analisis Data Statistik. Yogyakarta : Graha Ilmu. p.

59-65, 169-173
Underwood JC. 1999. Patologi Umum dan Sistematik 2nd ed. Jakarta:EGC. p. 247-
54
Van der Vossen and Wessel M. 2000. Plants Resources of South-East Asia .
Stimulants. p. 102
Vegad JL. 1995. A Textbook of Veterinary General Pathology; Healing and

Repair. New Delhi: Vikas Publishing House Put. Ltd. p. 82-153
Waha MG. 2000. Sehat Dengan Mengkudu. Jakarta MSF Group. p. 1-16
Winarti S. 2010. Makanan Fungsional. Surabaya Graha Ilmu
Wray D, Lowe GD, Dagg JH, Felix JD, and Scully C. 2003. Textbook of General
and Oral Medicine. Edinburg, Hartcourt Publ. Ltd. p. 31
Yulias NW, Agnes B, Igustin AS. 2011. Aktifitas Mukolitik In Vitro Ekstrak
Etanol Daun Sirih Merah (Piper crocatum Ruiz dan Pav.) Pada Mukosa
Usus Sapi dan Identifikasi Kandungan Kimianya. Availabe at
http://www.unwahas.ac.id/publikasiilmiah/index.php/ilmuFarmasidanklini
i/article/view/381/495. Accessed on January 2013
LAMPIRAN
Lampiran 1 Nilai Optical Density
48
49
Lampiran 2 Uji Statistik
NPar Tests
One-Sample Kolmogorov-Smirnov Test
K.sel K.media 100% 50% 25% 12,5%
N 7 7 7 7 7 7
a,b
Normal Parameters Mean .3823 .1111 .5961 .2020 .1480 .1663
Std. Deviation .04726 .01064 .04589 .01933 .01309 .05968
Most Extreme Absolute .139 .182 .213 .336 .220 .347
Differences Positive .117 .182 .155 .204 .154 .347
Negative -.139 -.172 -.213 -.336 -.220 -.239
Kolmogorov-Smirnov Z .368 .482 .564 .889 .583 .919
Asymp. Sig. (2-tailed) .999 .974 .908 .408 .886 .367
a. Test distribution is Normal.

b. Calculated from data.
Test of Homogeneity of Variances

Hasil
Levene Statistic df1 df2 Sig.
3.950 5 36 .006
ANOVA
Hasil
Sum of Squares df Mean Square F Sig.
Between Groups 1.221 5 .244 171.195 .000

Within Groups .051 36 .001
Total 1.272 41
50
NPar Tests
Kruskal-Wallis Test
Ranks
Kelompok N Mean Rank
Hasil Kontrol sel 7 32.00
Kontrol media 7 4.43
100 % 7 39.00
50 % 7 23.14
25 % 7 14.93
12,5 % 7 15.50
Total 42
a,b
Test Statistics
Hasil
Chi-square 36.756
df 5
Asymp. Sig. .000
a. Kruskal Wallis Test

b. Grouping Variable:
Kelompok
NPar Tests
Mann-Whitney Test
Ranks
Kelompok N Mean Rank Sum of Ranks
Hasil Kontrol sel 7 11.00 77.00
Kontrol media 7 4.00 28.00

Total 14
51
b
Test Statistics
Hasil
Mann-Whitney U .000
Wilcoxon W 28.000
Z -3.134
Asymp. Sig. (2-tailed) .002
a
Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] .001
a. Not corrected for ties.
b. Grouping Variable: Kelompok
NPar Tests
Mann-Whitney Test
Ranks
100 % 7 11.00 77.00
Total 14
b
Test Statistics
Hasil
Mann-Whitney U .000
Wilcoxon W 28.000
Z -3.130
a

52
NPar Tests
Mann-Whitney Test
Ranks
50 % 7 4.00 28.00
Total 14
b
Test Statistics
Hasil
Mann-Whitney U .000
Wilcoxon W 28.000
Z -3.134
a

NPar Tests
Mann-Whitney Test
Ranks
25 % 7 4.00 28.00
Total 14
b
Test Statistics
Hasil
Mann-Whitney U .000
Wilcoxon W 28.000
Z -3.134
a

53
NPar Tests
Mann-Whitney Test
Ranks
12,5 % 7 4.00 28.00
Total 14
b
Test Statistics
Hasil
Mann-Whitney U .000
Wilcoxon W 28.000
Z -3.130
a

NPar Tests
Mann-Whitney Test
Ranks
Hasil Kontrol media 7 4.00 28.00
100 % 7 11.00 77.00
Total 14
b
Test Statistics
Hasil
Mann-Whitney U .000
Wilcoxon W 28.000
Z -3.134
a

54
NPar Tests
Mann-Whitney Test
Ranks
50 % 7 11.00 77.00
Total 14
b
Test Statistics
Hasil
Mann-Whitney U .000
Wilcoxon W 28.000
Z -3.137
a

NPar Tests
Mann-Whitney Test
Ranks
25 % 7 10.86 76.00
Total 14
b
Test Statistics
Hasil
Mann-Whitney U 1.000
Wilcoxon W 29.000
Z -3.009
a

55
NPar Tests
Mann-Whitney Test
Ranks
12,5 % 7 10.71 75.00
Total 14
b
Test Statistics
Hasil
Wilcoxon W 30.000
Z -2.878
a

NPar Tests
Mann-Whitney Test
Ranks
Hasil 100 % 7 11.00 77.00
dimension1
50 % 7 4.00 28.00
Total 14
b
Test Statistics
Hasil
Mann-Whitney U .000
Wilcoxon W 28.000
Z -3.134
a
56
NPar Tests
Mann-Whitney Test
Ranks
Hasil 100 % 7 11.00 77.00
dimension1
25 % 7 4.00 28.00
Total 14
b
Test Statistics
Hasil
Mann-Whitney U .000
Wilcoxon W 28.000
Z -3.134
a

NPar Tests
Mann-Whitney Test
Ranks
Hasil 100 % 7 11.00 77.00
dimension1
12,5 % 7 4.00 28.00
Total 14
b
Test Statistics
Hasil
Mann-Whitney U .000
Wilcoxon W 28.000
Z -3.130
a
57
b
Test Statistics
Hasil
Mann-Whitney U .000
Wilcoxon W 28.000
Z -3.130
a

NPar Tests
Mann-Whitney Test
Ranks
Hasil 50 % 7 10.86 76.00
dimension1
25 % 7 4.14 29.00
Total 14
b
Test Statistics
Hasil
Wilcoxon W 29.000
Z -3.009
a

58
NPar Tests
Mann-Whitney Test
Ranks
Hasil 50 % 7 9.29 65.00
dimension1
12,5 % 7 5.71 40.00
Total 14
b
Test Statistics
Hasil
Wilcoxon W 40.000
Z -1.604
a

NPar Tests
Mann-Whitney Test
Ranks
Hasil 25 % 7 7.93 55.50
dimension1
12,5 % 7 7.07 49.50
Total 14
b
Test Statistics
Hasil
Wilcoxon W 49.500
Z -.384
a

59
Lampiran 3 Foto Hasil Penelitian
Keterangan:
1 = Kontrol sel
2 = Kontrol media
3 = Ekstrak etanol sirih merah konsentrasi 100%
6 = Ekstrak etanol sirih merah konsentrasi 12,5%
60
Lampiran 4 Surat Identifikasi Sirih Merah (Piper crocatum).

61
Lampiran 5 Keterangan Kelaikan Etik

Uji Sitotoksisitas Ekstrak Etanol Daun S

Diunggah oleh

Informasi Dokumen

Judul Asli

Hak Cipta

Format Tersedia

Bagikan dokumen Ini

Bagikan atau Tanam Dokumen

Opsi Berbagi

Apakah menurut Anda dokumen ini bermanfaat?

Apakah konten ini tidak pantas?

Hak Cipta:

Format Tersedia

Uji Sitotoksisitas Ekstrak Etanol Daun S

Diunggah oleh

Hak Cipta:

Format Tersedia

UJI SITOTOKSISITAS EKSTRAK ETANOL DAUN SIRIH MERAH

(Piper crocatum) TERHADAP SEL FIBROBLAS

FAKULTAS KEDOKTERAN GIGI

(Piper crocatum) TERHADAP SEL FIBROBLAS

FAKULTAS KEDOKTERAN GIGI

UJI SITOTOKSISITAS EKSTRAK ETANOL DAUN SIRIH MERAH

Diajukan Sebagai Salah Satu Syarat Untuk Menyelesaikan

Pembimbing Utama Pembimbing Serta

(Markus Budi Rahardjo, drg., M.Kes) (Dr. Ira Arundina, drg.,M.Si)

FAKULTAS KEDOKTERAN GIGI

Skripsi ini telah diuji pada tanggal 22 Januari 2013

PANITIA PENGUJI SKRIPSI

1. Dr. Theresia Indah Budhy, drg., M.Kes (Ketua Penguji)

2. Dr. Pratiwi Soesilawati, drg., M.Kes (Anggota)

3. Dr. Retno Indrawati, drg., M.Si (Anggota)

4. Markus Budi Raharjo, drg., M.Kes (Pembimbing Utama/Anggota)

5. Dr. Ira Arundina, drg., M.Si (Pembimbing Serta/Anggota)

SITOTOKSISITAS EKSTRAK ETANOL DAUN SIRIH MERAH (Piper

Crocatum) TERHADAP SEL FIBROBLAS” ini dapat terselesaikan. Penyusunan

Gigi di Fakultas Kedokteran Gigi Universitas Airlangga Surabaya.

rasa terima kasih kepada :

Dekan Fakultas Kedokteran Gigi Universitas Airlangga Surabaya yang

telah memberi kesempatan untuk menempuh pendidikan di Fakultas

Kedokteran Gigi Airlangga.

2. Dr. R. Darmawan Setijanto., drg., M.Kes, selaku Wakil Dekan I Fakultas

Kedokteran Gigi Universitas Airlangga Surabaya yang telah mengizinkan

penulis untuk membuat skripsi ini.

3. drg. Markus Budi Rahardjo., M.Kes selaku Kepala Departemen Biologi

Dosen Pembimbing Utama yang telah banyak memberi bimbingan, saran,

bantuan dan dorongan yang sangat bermanfaat dalam penyusunan skripsi

bimbingan, saran, dan bantuannya yang sangat bermanfaat dalam

penyusunan skripsi ini.

5. drh. Erna selaku staf bagian PMPP Pusat Veterinaria Farma

memberikan doa dan semangat.

7. Amrullah Rahdityanur, Annisa T, Nik Andriena dan seluruh teman- teman

dukungan, perhatian, doa, semangat dan saran yang berguna dalam

penyelesaian skripsi ini.

memberikan manfaat khususnya bagi mahasiswa Fakultas Kedokteran Gigi

Universitas Airlangga dan pembaca pada umumnya.

Surabaya, Februari 2013

Background. Traditional herbs are very popular in the community lately as a

Key words : Piper crocatum, cytotoxicity, MTT assay

Penetapan Panitia Penguji………………………………………………….. iii

Ucapan Terima Kasih………………………………………………………. iv

Daftar Isi……………………………………………………………………. vii

Daftar Lampiran…………………………………………………………….. xii

1.1 Latar Belakang Masalah…………………………………………….. 1

1.2 Rumusan Masalah…………………………………………………… 3

1.3 Tujuan Penelitian……………………………………………………. 3

1.4 Manfaat Penelitian…………………………………………………... 4

BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Sirih Merah (Piper crocatum)………………………………………. 5

2.1.3 Kandungan Kimia……………………………………………………. 7

2.2 Uji Sitotoksisitas……………………………………………………... 12

2.3 Proses Penyembuhan Luka………………………………………….. 15

2.5 Sel Fibroblas…………………………………………………………. 21

BAB 3 KERANGKA KONSEPTUAL DAN HIPOTESIS PENELITIAN

3.1 Kerangka Konseptual Penelitian………………………………….... 23

3.2 Keterangan Kerangka Konseptual Penelitian………………………. 24

3.3 Hipotesis Penelitian………………………………………………... 25

BAB 4 METODE PENELITIAN

4.1 Jenis Penelitian dan Rancangan Penelitian……………………….... 26

4.2 Subjek Penelitian…………………………………………………… 26