Tujuan dari penelitian ini adalah untuk menyelidiki koleksi burung Aspergillus

fumigatus isolat untuk kehadiran resistensi triazole.

Bahan dan metode. - Penelitian ini dilakukan pada 60 A. fumigatus isolat berbudaya
dari sampel jaringan paru-paru dari ayam (25), angsa (17), kalkun (13) dan bebek (5). Sampel
diperoleh dari 40 peternakan yang berbeda yang terletak di barat daya Polandia dan
dikumpulkan pada periode September 2015 sampai November 2016. EUCAST metode
mikrodilusi, dengan penggunaan tiga konsentrasi itrakonazol (ITR) (1, 0,5, dan 0,25 mg / L),
digunakan untuk menyaring kerentanan semua isolat. Selain itu, dipilih 20 isolat diuji dengan
sebelas konsentrasi mulai ,015-16 mg / L dari ITR, vorikonazol, posaconazole dan
isavuconazole.
Aspergillus fumigatus adalah yang paling sering organisme penyebab bertanggung
jawab untuk aspergillosis pada manusia maupun hewan. Berlawanan dengan beberapa yang
lain Aspergillus spesies (misalnya, A. terreus), yang mana sering pd hakekatnya tahan terhadap
antimycotics, A. fumigatus memiliki ditampilkan kerentanan terhadap amfoterisin B serta ke
triazole terbaru derivatif: itrakonazol (ITR), posaconazole (POS), vorikonazol (VOR), dan
isavuconazole (ISV) [1] .
A. fumigatus isolat, Dua rute dari perkembangan resistensi yang mendalilkan. Yang
pertama adalah dalam kaitannya dengan tekanan selektif triazoles digunakan dalam pengobatan
jangka panjang, biasanya pada pasien dengan bentuk kronis atau alergi aspergillosis, sedangkan
kedua muncul di lingkungan dan berhubungan dengan penggunaan fungisida triazole dalam
industri pertanian. Mekanisme molekuler utama, ditemukan pada sampai dengan 90% dari
isolat resisten triazole dan berpikir timbul di lingkungan adalah mutasi TR34 / L98H (34 bp
tandem mengulangi di mutasi wilayah promotor dan titik cyp51A gen) mengakibatkan
substitusi leusin untuk histidin di lanosterol 14 alpha-demethylase . Isolat memegang mutasi di
atas biasanya silang tahan terhadap semua medis triazole derivatif. Seperti tahan Aspergillus,
jika ada di luar ruangan atau dalam lingkungan, dapat menginfeksi pasien yang berisiko,
terlepas dari penggunaan triazole profilaksis.
Bahan dan metode, Yang Pertama, yaitu Strain dan desain penelitian, Penelitian itu
dilakukan pada 60 A. fumigatus isolat berbudaya dari paru-paru tisu sampel dari ayam mati
(25), angsa (17), kalkun (13) dan bebek (5). Sampel berasal dari 40 berbeda peternakan terletak
di daerah barat daya Polandia (Lower Silesia dan bagian dari Greater Poland Province) dan
dikumpulkan di periode September 2015 sampai November 2016. Burung-burung yang berusia
1 sampai 16 hari dan diselidiki selama rutin kontrol prosedur yang bertujuan untuk menentukan
etiologi mungkin infeksi (misalnya, Salmonella, Aspergillus) dan untuk memperkirakan risiko
untuk sisa kawanan. Itu identifikasi isolat berbudaya adalah dilakukan atas dasar fitur
morfologi dan kemampuan untuk tumbuh 42 8 bahan C. jamur yang diperoleh dari budaya
output dengan pencampuran hingga 5 koloni, dengan khas makro dan mikro-morfologi adalah
dianggap sebagai isolat tunggal dan digunakan dalam tes kerentanan. Selain itu, sebagai strain
kontrol, Candida krusei ATCC 6258, dan dua klinis SEBUAH. fumigatus strain dengan urutan
diketahui dari cyp51A gen (No. 13 (CBS133436) positif untuk TR34 / L98H; No. 41 - liar jenis
cyp51A gen urutan) yang digunakan.
Yang kedua, antijamur uji kerentanan, uji kepekaan yang dilakukan dengan metode
mikrodilusi Menurut Eropa Komite untuk Kerentanan antimikroba pengujian (EUCAST) [12]
. Semua isolat pertama disaring dengan panel singkat ITR konsentrasi (0,25, 0,5, dan 1 mg / L)
dan isolat kemudian dipilih diperiksa untuk kerentanan mereka terhadap ITR, VOR, ISV dan
POS menggunakan lebih luas pengenceran obat (0,015-16 mg / L). Seperti direkomendasikan
oleh EUCAST, para RPMI1640 media buffered dengan MOPS digunakan dan konsentrasi
glukosa fi nal adalah 2%. kepadatan akhir dari spora jamur berkisar 1-2,5 10 5 CFU / mL dan
dibuat dari budaya 3 hari-lama Aspergillus pada Sabouraud agar miring. Para microplates
diinkubasi selama 48 jam pada 35 8 C dan MIC ditentukan secara visual sebagai konsentrasi
obat terendah yang mengakibatkan 100 penghambatan% dari pertumbuhan jamur. Isolat
dianggap sebagai tahan azole ketika nilai MIC adalah > 2 mg / L untuk ITR dan VOR, > 1 mg
/ L untuk ISV, dan > 0,25 mg / L untuk POS, dan sebagai azole rentan ketika nilai MIC adalah
1 mg / L untuk ITR, VOR, ISV atau 0,12 mg / L untuk POS [13] . Reagen, antijamur (ITR,
VOR, POS), DMSO, medium RPMI 1640, MOPS penyangga, diperoleh dari Sigma-Aldrich,
sedangkan isavuconazole baik yang disediakan oleh Basilea Pharmaceutica Ltd.
Yang ketiga, Validasi deteksi tahan isolat dalam budaya poliklonal, Spora dari budaya
3 hari-lama A. fumigatus No 13 (azol tahan) dan A. fumigatus No 41 (azole-rentan) yang
digunakan untuk mempersiapkan suspensi kepadatan 0,5 McFarland di steril, air distilat
dilengkapi dengan Tween 20. suspensi No. 13 dan No. 41 dicampur dalam proporsi sebagai
berikut: 1: 1; 1: 2; 1: 4; 01:10; 1: 100 (10 m l: 0.99 mL); 1: 1000 (10 m l: 9.99 mL) dan
kemudian digunakan untuk menguji kerentanan terhadap ITR, seperti dijelaskan di atas.
Dan yang terakhir, tes molekuler digunakan untuk mengidentifikasi dan menentukan
mekanisme perlawanan terhadap triazolesA. fumigatus DNA diekstraksi dengan prosedur
dijelaskan di tempat lain [14,15] . Secara singkat, DNA dari potongan miselium 3-5 mm
diameter diekstraksi oleh inkubasi 10-menit dari sampel di 100 m l buffer ekstraksi (60 mM
natrium bikarbonat [NaHCO 3], 250 mM kalium klorida [KCl] dan 50 mM Tris, pH 9,5) pada
95 8 C dan tambahan berikutnya 100 m l dari 2% bovine serum albumin. DNA yang
mengandung larutan digunakan untuk penguat kasi ITS1, 5,8S, wilayah ITS2 [16] , Fragmen
b- tubulin gen [17] dan cyp51A urut ( cyp51A selama 5 0 ATG 3 0 dan cyp51A rev 5 0
ACCGCTTCTCCCAGCCGA 3 0). produk PCR yang dimurnikan (Clean-up, A & A
Bioteknologi) dan sequencing (Macrogen). Analisis urutan dilakukan dengan VectorNTI
(Informax).
 Di dapat hasil, hasil Deteksi sel tahan dalam campuran ITR-tahan / spora rentan
disajikan di Tabel 1 . The dilakukan percobaan mengungkapkan bahwa MIC ditinggikan
dengan mudah dideteksi kapan spora tahan mewakili sampai seperseratus bagian dari diuji
populasi; Namun, dalam proporsi 1: 1000, hasilnya adalah Pertumbuhan ambigu dan halus
terlihat hanya dalam beberapa sumur dengan tinggi konsentrasi ITR. Sebagian besar diuji
burung SEBUAH. fumigatus isolat (59/60) yang ditemukan rentan terhadap ITR (MIC 0,5 mg
/ L) ( Meja 2 ). Satu-satunya pengecualian adalah mengisolasi No. 228, yang menunjukkan
MIC peningkatan ITR (16 mg / L), sebagai serta dari vorikonazol (4 mg / L), izavuconazole (4
mg / L), dan posaconazole (0,5 mg / L) ( Tabel 2 dan 3 ). Berdasarkan Hasil ITR kerentanan,
kami memilih 8 isolat dengan MIC 0,5 mg / L, 10 dengan MIC 0,25 mg / L dan 2 dengan MIC
< 0,25 untuk lebih lanjut kerentanan analisis. Semua isolat yang dipilih rentan untuk VOR,
POS, serta ISV ( tabel 3 ). Analisis urutan dari ITS1-2 fragmen DNA ribosom serta b- tubulin
gen kedua con fi rmed yang identifikasi isolat Nomor 228 sebagai SEBUAH. fumigatus. Isolat
ditemukan untuk menjadi pembawa mutasi TR34 / L98H di CYP 51A gen. strain resisten ini
diperoleh dari paru-paru dari cewek kalkun hari-tua, paling mungkin menderita dari
aspergillosis. Sayangnya, pemeriksaan histopatologi tidak dilakukan. Aspergillosis tidak
ditemukan dalam lain burung dari fl OCK ini dan kita bisa mengira bahwa cewek itu terinfeksi
di hatchery dari mana ia datang atau selama transportasi. Itu mikrobiologi pemeriksaan sampel
lingkungan (air, sampah, debu, pakan unggas) yang dikumpulkan satu bulan setelah itu budaya
mengisolasi Nomor 228 tidak mengungkapkan tahan azole lainnya ketegangan. SEBUAH.
fumigatus rentan terhadap azoles diisolasi dari itu Sedotan sampel (data tidak ditampilkan).