Abstrak

Makalah ini menjelaskan metode kromatografi gas-spektrofotometri massa (GC-MS) dengan

pemantauan ion terpilih (SIM) untuk pengukuran kadar kokain urin. Kokain dan kodein (standar
internal, IS) diekstraksi dari urin manusia dengan campuran dietileter dan etilasetat pada pH basa
dengan ekstraksi cair-cair. Kurva kalibrasi linier pada rentang konsentrasi 50-2000 ng mL-1. Nilai
presisi intra dan inter-hari untuk kokain dalam urin manusia kurang dari 6,9, dan akurasi (kesalahan
relatif) lebih baik dari 6,8%. Pemulihan analitis kokain dari urin manusia rata-rata mencapai 92,9%.
Batas deteksi (LOD) dan kuantifikasi (LOQ) kokain adalah 15 dan 50 ng mL-1, masing-masing. Studi
stabilitas menunjukkan bahwa kokain stabil dalam urin manusia setelah inkubasi 8 jam pada suhu
kamar atau setelah penyimpanan 1 minggu pada suhu -20 0C dengan tiga siklus pembekuan.

Pengenalan

Kokain (Gambar 1) adalah salah satu obat zat berbahaya terkontrol yang paling banyak
disalahgunakan setelah amobarbital, secobarbital, dan metadon. Kokain adalah stimulan yang sangat
aktif, dan beberapa program melaporkan sejumlah besar spesimen urin positif kokain karena kokain
mengalami biotransformasi luas sehingga menyisakan jumlah minimal dari obat induk yang ada [1,2].
Menurut Institut Nasional Penyalahgunaan Narkoba di National Institutes of Health, sebuah
penelitian pada tahun 1996 menunjukkan bahwa 'crack' kokain terus mendominasi masalah narkoba
di negara ini [3]. Pada tahun 1996, 1,75 juta orang menggunakan kokain, baik dalam bentuk asam
maupun basa, di Amerika Serikat. Kokain mengalami reaksi dalam tubuh membentuk sejumlah
metabolit utama seperti benzoylecgonine dan ecgonine methyl ester [4,5] yang kemudian
diekskresikan dalam urin, keringat, air liur dan feses. Ketika kokain dicerna dengan alkohol, metabolit
lain, cocaethylene, diproduksi di hati yang menyebabkan efek euforia intensif [6].

Kokain dan metabolitnya dapat diukur dengan beberapa teknik analitis termasuk immunoassay [7],
HPLC [8-12], kromatografi gas [13-16], dan GC-MS [17-23]. Secara umum, metode-metode ini fokus
pada penentuan kokain, benzoylecgonine atau ecgonine methyl ester.

Teknik Immunoassay tidak selalu spesifik. Karena dapat mendeteksi kokain yang bebas dan
terkonjugasi. HPLC digabungkan dengan detektor UV telah banyak diadopsi untuk menentukan kadar
kokain dalam sampel biologis, tetapi biasanya membutuhkan derivatisasi pascakolom untuk
meningkatkan sensitivitasnya selama analisis. Waktu retensi yang digunakan untuk identifikasi dalam
HPLC juga tidak terlalu dapat direproduksi. Spektrometri massa menawarkan informasi struktural
kokain dan sensitivitas tinggi, serta spesifisitas dalam deteksi. Oleh karena itu, GC-MS menyediakan
metode alternatif untuk analisis kokain.

Sistem ekstraksi fase padat telah dilaporkan untuk menghilangkan banyak kokain dan metabolit
secara cepat dan efisien [24]. Kemampuan kolom fase terikat kopolimer ini untuk mengekstraksi
metabolit kokain baik dasar maupun aniphoter memungkinkan desain uji untuk penentuan simultan
beberapa metabolit kokain. Metode-metode ini juga merupakan metode paling komprehensif yang
dapat mengekstraksi kokain dalam satu prosedur ekstraksi tunggal.

Pada survei literatur yang luas, tidak ada metode ekstraksi fase cair-cair yang dilaporkan hingga saat
ini untuk penentuan kokain oleh GC-MS dalam urin manusia. Oleh karena itu, dalam penelitian ini,
sistem ekstraksi fase cair-cair telah digunakan. Kemudian, kami melaporkan GC-MS dengan metode
SIM untuk penentuan kokain dalam urin manusia menggunakan metodologi standar internal.
Metode yang dikembangkan divalidasi dengan menggunakan parameter linearitas, stabilitas, presisi,
akurasi dan sensitivitas sesuai dengan pedoman Konferensi Internasional tentang Harmonisasi (ICH)
[25]. Keuntungan dari metode ini termasuk prosedur ekstraksi langkah sederhana dan tunggal
menggunakan bahan kimia murah dan waktu jangka pendek.

Bahan dan metode

1. Bahan kimia dan reagen

Kokain dan kodein sebagai İnternal Standard (IS) diperoleh dari Laboratorium Polisi Kriminal
(Erzurum, Turki). Butil klorida, dietileter, etilasetat, heksana, diklorometana, asetonitril dan butanol
dibeli dari Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA).

2. GCMS

Analisis kromatografi dilakukan pada sistem kromatografi gas Agilent 6890N yang dilengkapi dengan
5973 series mass selective detector, 7673 series autosampler, dan chemstation (Agilent Technologies,
Palo Alto, CA). Kolom HP-5 MS dengan ketebalan film 0,25 μm (30 m × 0,25 mm I.D., USA) digunakan
untuk pemisahan. Injeksi splitless digunakan dan gas pembawa adalah helium pada laju aliran 1 mL
min-1. Suhu injektor dan detektor adalah 250 0C. Parameter detektor MS adalah suhu saluran
transfer 290 0

3. Persiapan stok dan solusi standar

Solusi standar stok kokain dan IS disiapkan dengan asetonitril dengan konsentrasi 5000 ng mLC,
penundaan pelarut 3 menit dan energi elektron 70 eV.-1 dan disimpan pada -20 ° C di bawah
pendingin. Larutan standar pada konsentrasi kokain 50, 200, 400, 800, 1200, 1600 dan 2000 ng mL-1
dibuat dengan mengencerkan dengan larutan stok asetonitril sesuai volume larutan. Persiapan solusi
kerja urin; jumlah yang sesuai dari larutan kokain standar bersama dengan 500 ng mL-1 IS dibubuhi
dalam 1,0 mL urin dan kemudian diekstraksi dengan metode ekstraksi cair-cair. Solusi kontrol kualitas
(QC) disiapkan dengan menambahkan alikuot dari larutan kerja standar kokain ke konsentrasi akhir
150, 1000 dan 1750 ng mL-1, 0,1 mL IS (500 ng mL-1) dan 1,0 mL kosong urin.

4. prosedur ekstraksi

Sampel urin kosong 1,0 mL dipindahkan ke tabung centrifuge 12 mL bersama dengan larutan 0,1 mL
IS (500 ng) dan 0,5 mL 1 M larutan natrium hidroksida. Setelah pencampuran vortex selama 5 detik, 4
mL dietileter dan etilasetat ditambahkan (3: 1, v / v), campuran vortex selama 30 detik dan kemudian
disentrifugasi pada 3000 x g selama 3 menit. Lapisan organik dipindahkan ke tabung lain dan
diuapkan sampai kering pada suhu kamar di bawah gas nitrogen. Residu kering dilarutkan dalam 1
mL asetonitril. Kemudian 1 μL aliquot diinjeksikan ke sistem GC-MS. Spektrum massa kokain dan IS
ditunjukkan pada Gambar 2.

5. metode validasi

Rasio area-puncak (kokain untuk IS) ditentukan dalam rangkap tiga. Kurva kalibrasi diperoleh dengan
fitting linear kuadrat-terkecil dari rasio luas puncak versus jumlah kokain. Presisi intra dan inter-run
dinilai dari hasil QC. Nilai rata-rata dan RSD untuk QC pada tiga tingkat konsentrasi dihitung selama
enam kali validasi. Nilai-nilai ini kemudian digunakan untuk menghitung presisi intra-dan antar-lari
(RSD) dengan analisis varian satu arah. Keakuratan metode ditentukan dengan menghitung
persentase penyimpangan yang diamati dalam analisis QC dan dinyatakan sebagai kesalahan relatif
(RE). Ketepatan dan akurasi setiap nilai QC tidak boleh melebihi deviasi 15%, kecuali untuk sampel
QC untuk batas kuantifikasi (LOQ) di mana 20% dapat diterima.