VII.

Pembahasan

Sterilisasi adalah suatu proses untuk membunuh semua jasad renik yang

ada, jika ditumbuhkan di alam suatu medium tidak ada jasad renik yang dapat

berkembang biak. Sterilisasi harus dapat membunuh renik yang paling tahan

panas yaitu spora bakteri (Fardias, 1992).

Dalam hal ini sterilisasi adalah tahap awal yang penting dari proses pengujian

mikrobiologi. Tujuan dilakukan sterislisasi adalah agar alat-alat yang berada di

laboratorium tidak terkontaminasi dengan mikroorganisme yang ada di

lingkungan sekitar. Sterilisasi terdiri dari 5 metode, dalam percobaan ini

dilakukan sterilisasi dengan metode sterilisasi uap (panas lembab). Dari setiap

metode sterilisasi, masing masing memiliki kelebihan dan kekyrangannya .Salah

satunya adalah pada metode sterilisasi uap (panas lembab) memiliki kelebihan

yaitu yang pertama waktu proses sterilisasi lebih cepat karena menggunakan uap

panas dan tekanan. Yang kedua dapat digunakan untuk sterilisasi hampir untuk

semua alat, termasuk alat ukur. Yang ketiga adanya tetesan uap air pada alat dan

bahan yang disterilkan. Yang keempat dapat mensterilkan alat dan bahan

hingga tidak ada oraganisme yang hidup lagi. Selain memiliki kelebihan metode

sterilisasi uap (panas lembab) juga memiliki kekurangan yaitu yang pertama

sangat bergantung pada adanya kelembapan dan temperatur yang ditingkatkan .

Yang kedua uap air yang menetes dapat merusak media-media tertentu. Yang

ketiga harus menggunakan air mendidih karena upanya memenuhikompartemen

autoklaf dan terdesak keluar dari klep pengaman. Yang keempat autoklaf

membutuhkan sumber panas yang terus menerus. Yang kelima autoklaf

membutuhkan selalu perawatan yang terus menerus. Metode sterilisasi uap

memiliki pinsip yaitu berdasarkan suhu dan tekanan tinggi yang diberikan kepada

alat dan media yang akan disterilisasikan dengan menggunakan alat autoklaf.

Autoklaf adalah salah satu alat yang digunakan untuk mensterilisasi alat-alat yang

ada dilaboratorium. Menurut (Suriawiria,2005) prinsip kerja autoklaf yaitu pada

saat sumber panas dinyalakan, air dalam autoklaf lama kelamaan akan mendidih

kemudian uap air yang terbentuk mendesak udara untuk mengisi autoklaf. Setelah

uadara dalam autoklaf diganti dengan uap air, katup udara/ uap ditutup sehingga

tekanan udara dalam autoklaf naik. Pada saat tercapainya tekanan dan suhu yang

sesuai, maka proses sterilisasi dimulai dan timer mulai menghitung waktu

mundur. Setelah proses sterilisasi selesai, maka sumber panas dimatikan dan

tekanan dibiarkan turun perlahan hingga mencapai suhu 0°C dan 0 psi (Autoklaf

tidak boleh dibuka sebelum tekanan mencapai 0 psi). Prinsip alat Autoklaf ini

adalah mensterilkan alat dan bahan berdasarkan menggunakan tekanan uap

optimum untuk sterilisasi pada tekanan 15 Psi (pounds per square inci) dan suhu

121°C selama waktu 20 menit Mekanisme kerja alat autoklaf adalah yang pertama

sebelum melakukan sterilisasi dilakukan pengecekan dahulu banyaknya jumlah air

dalam autoklaf. Jika air kurang dari batas yang ditentukan, maka air harus

ditambahkan sampai batas tersebut (gunakan akuades untuk menghindari karak

dan karat). Yang kedua masukkan peralatan dan media yang akan disterilisasikan.

Lalu tutup autoklaf dengan rapat kemudian kencangkan baut pengaman agar tidak

ada uap yang keluar dari tutup autoklaf (klep pengaman jangan dikencangkan

terlebih dahulu). Nyalakan autoklaf dan atur timer dengan waktu 20 menit dan
suhu 121°C. Selanjutnya tunggu hingga air mendidih sehingga uapnya memenuhi

kompartemen autoklaf dan terdesak keluar dari klep pengaman. Kemudian klep

pengaman ditutup (dikencangkan) dan ditunggu sampai selesai. Perhitungan

waktu 20 menit dimulai sejak tekanan telah menapai 2 atm. Dan yang terakhir

adalah jika alarm tanda selesai telah berbunyi, maka tunggu suhu dan tekanan

dalam kompartemen turun hingga sama dengan tekanan udara yang ada di

lingkungan (jarum pada tekanan menunjukkan ke angka nol) . Setelah itu klep-

klep pengaman dapat dibuka dan alat-alat yang disterilisasikan dapat dikeluarkan

dari autoklaf dengan hati-hati (jangan membuka tutup autoklaf terlalu cepat

karena dapat menyebabkan keretakan pada alat gelas karena adanya perubahan

suhu yang terlalu cepat). ( Gupte,1990 )

Kondisi-kondisi yang digunakan untuk sterilisasi uap dengan menggunakan alat

autoklaf adalah dengan suhu 115,5°C, suhu 121,5°C, dan suhu 126,5°C. Dari

ketiga suhu tersebut yang digunakan dalam percobaan dengan menggunakan alat

autoklaf ini adalah suhu 121°C. Karena sebagian besar alat autoklaf digunakan

pada suhu tersebut dengan tekanan 15 lbs (SI: 103,4 Kpa). Alasan digunakan

metode sterilisasi uap karena sterilisasi uap merupakan metode yang paling efektif

dan ideal karena pertama uap merupakan pembawa (carrier) energi termal paling

efektif dan semua lapisan pelindung luar mikroorganisme dapat dilunakkan,

sehingga memunginkan terjadinya koagulasi. Yang kedua bersifat nontoksik,

mudah diperoleh, dan relative mudah dikontrol. Pada suhu jenuh uap air (100oC)

dengan tekanan 1 atmosfer ternyata masih kurang dalam membunuh kuman yang

resisten. Oleh karena itu, kita harus mengupayakan agar suhu jenuh uap
ditingkatkan dengan cara meningkatkan tekanananya. Kemudian, kita dapat

melakukannya dalam wadah tertutup rapat agar dapat tercapai suhu sterilisasi,

yaitu 121oC atau lebih (Irianto,2006).

Selain itu, alasan digunakan pada suhu ini karena alat-alat gelas tidak akan

memuai pada suhu tersebut sehingga tidak terjadi perubahan ukuran alat. Dalam

proses sterilisasi uap yang bertujuan dapat membunuh mikroba (penghancuran

secara lengkap semua mikroba hidup dan spora-sporanya) hal ini dapat terjadi

karena adanya mekanisme penghancuran bakteri yang dipengaruhi oleh suhu yang

terdapat pada alat autoklaf. Suhu yang tinggi maka akan mengakibatkan adanya

uap air yang panas yang dapat menimbulkan kerusakan total terhadap sel mikroba

yang memiliki materi genetik yaitu DNA atau RNA yang memiliki peranan

penting dalam kehidupan normal sel mikroba tersebut. Mekanisme pengahancuran

bakteri oleh uap air panas adalah karena terjadinya denaturasi dan koagulasi

beberapa protein essensial dari organisme tersebut. Penurunan tekanan pada

autoklaf tidak dimaksudkan untuk membunuh mikroorganisme, melainkan

meningkatkan suhu dalam autoklaf. Suhu yang tinggi inilah yang akan membunuh

mikroorganisme. Autoklaf terutama ditujukan untuk membunuh endospora,

yaitu sel resisten yang diproduksi oleh bakteri, sel ini tahan terhadap pemanasan,

kekeringan, dan antibiotik. Pada spesies yang sama, endospora dapat bertahan

pada kondisi lingkungan yang dapat membunuh sel vegetatif bakteri tersebut.

Endospora dapat dibunuh pada suhu 100 °C, yang merupakan titik didih air pada

tekanan atmosfer normal. Pada suhu 121 °C, endospora dapat dibunuh dalam

waktu 4-5 menit, dimana sel vegetatif bakteri dapat dibunuh hanya dalam waktu
6-30 detik pada suhu 65 °C. Perhitungan waktu sterilisasi autoklaf dimulai ketika

suhu di dalam autoklaf mencapai 121 °C. Dalam hal ini sterilisasi uap lebih efektif

untuk membunuh mikroba dalam waktu yang lebih singkat yaitu 20 menit

dibandingkan dengan metode sterilisasi lainnya yaitu contohnya sterilisasi panas

kering yang kurang efektif untuk membunuh mikroba sehingga memerlukan suhu

yang lebih tinggi yaitu 160°C-170°C dan waktu yang lebih lama yaitu sekitar 1-2

jam.

Dalam praktikum ini dilakukan dua percobaan yaitu yang pertama

persiapan dan sterilisasi alat dan yang kedua adalah pembuatan dan sterilisasi

media serta larutan pengencer. Hal yang dilakukan pada percobaan pertama yaitu

sebelum alat-alat dilakukan sterilisasi, alat alat dicuci lalu dikeringkan terlebih

dahulu. Setelah itu, alat-alat yang memiliki mulut seperti tabung reaksi,

erlenmeyer, botol media, gelas ukur, labu takar, pipet ditutup dengan kapas

berlemak yang dibungkus dengan kain kasa yang fungsinya untuk supaya

menyatukan kapas kapas lemak yang digunakan untuk menutup mulut pada alat. .

Alasan digunakannya kapas berlemak karena kapas berlemak berfungsi sebagai

penutup, pembatas, dan pelindung pada alat alat laboratorium. Selain itu kapas

berlemak tidak menyerap air karena mengandung minyak sehingga air tidak bisa

masuk terserap ke dalam kapas serta tidak dapat berkumpul pada alat karena

kapas berlemak ini memiliki sifat lipid dan yang terakhir fungsi kegunaan dari

kapas berlemak adalah untuk mengurangi kontaminasi mikroba dan uap air yang

masuk pada alat-alat laboratorium. Setelah alat alat yang mempunyai mulut

ditutup dengan kapas berlemak, selanjutnya ditutup lagi dengan alumunium foil
dan diikat dengan benang kasur. Alasan digunakannya alumunium foil adalah

karena aluminium foil bersifat insulator yaitu meredam panas dan untuk

mengahalangi air yang masuk ke dalam alat yang disterilisasikan. Untuk alat alat

yang tidak memiliki mulut contohnya seperti cawan petri, sebelum dimasukan ke

dalam autoklaf juga dilakukan hal yang sama yaitu ditutup dengan alumunium

foil. Tujuan secara umum dari penutupan alat alat yang akan disterilisasikan baik

yang mempunyai mulut ataupun tidak di dalam autoklaf adalah untuk

menghindari terbentuknya uap air di dinding dan pada alat-alat yang dipanaskan

dan agar alat benar-benar steril dari kontaminasi mikroba. Setelah semua alat-alat

yang memiliki mulut ditutup dengan kapas berlemak dan alumunium foil

selanjutnya alat tersebut dilakukan sterilisasi dengan menggunakan autoklaf pada

suhu 121° C dengan waktu 20 menit. Setelah itu, disimpan ditempat terbuka yang

bertujuan untuk menghilangkan uap air yang masih tersisa.

Pada precobaan kedua dilakukan pembuatan dan sterilisasi media serta

larutan pengencer. Media yang digunakan dalam percobaan ini adalah Nutrien

Nutrien Agar dan Nutrien Broth. Perbedaan antara media Nutrien Agar dan

Nutrien Broth adalah pada proses identifikasinya. Pada Nutrien Agar

indentifikasinya berdasarkan pertumbuhan koloni dan warna sedangkan pada

Nutrien Broth identifikasinya berdasarkan kekeruhan. Pada Nutrien Agar (NA)

merupakan suatu medium yang berbentuk padat, yang merupakan perpaduan

antara bahan alamiah dan senyawa-senyawa kimia. Nutrien Agar dibuat dari

campuran ekstrak daging dan peptone dengan menggunakan agar sebagai

pemadat. Dalam hal ini agar digunakan sebagai pemadat, karena sifatnya yang
mudah membeku dan mengandung karbohidrat yang berupa galaktam sehingga

tidak mudah diuraikan oleh mikroorganisme. Dalam hal ini ekstrak beef dan

pepton digunakan sebagai bahan dasar karena merupakan sumber protein,

nitrogen, vitamin serta karbohidrat yang sangat dibutuhkan oleh mikroorganisme

untuk tumbuh dan berkembang. Medium Nutrien Agar (NA) merupakan medium

yang berwarna coklat muda yang memiliki konsistensi yang padat dimana

medium ini berasal dari sintetik. Fungsi dari Nutrien Agar adalah untuk pengujian

aktivitas bakteri dan pada media Nutrien Agar mengandung nutrisi untuk

pertumbuhan bakteri. Pada Nutrien Broth (NB) adalah medium yang berbentuk

cair dengan bahan dasar adalah ekstrak beef dan peptone. Perbedaan konsentris

antara Nutrient Agar dengan Nutrient Broth yaitu Nutrient Agar berbentuk padat

dan Nutrient Broth berbentuk cair. Susunan kimianya sama-sama sintetik. Fungsi

kimia dari nutrient agar dan nutrient broth sebagai medium umum. Medium

Nutrient Broth (NB) merupakan medium yang berwarna coklat yang memiliki

konsistensi yang cair. Medium ini berasal dari sintetik dan memiliki kegunaan

sebagai medium untuk pertumbuhan bakteri sama seperti medium Nutrien Agar.

Selain itu fungsi lainnya adalah untuk suspensi bakteri yaitu dalam pengujian

dilakukan pembiakan murni bakteri, agar bakteri yang akan digunakan supaya

selalu tetap dalam kondisi segar. Selain Bakteri juga sebagai medium

pertumbuhan jamur. Akan tetapi lebih banyak digunakan pertumbuhan bakteri

karena bakteri terdiri dari protein dan jamur terdiri dari karbohidrat pada Nutrien

Agar dan Nutrien Broth juga mengandung protein dan karbohidrat sehingga

bakteri dan jamur dapat tumbuh.

Hal pertama yang dilakukan pada percobaan kedua yaitu menimbang media

Nutrien Agar sebanyak 2,86 gram yang dilarutkan dalam akuades sebanyak 143

ml dan Nutrien Broth sebanyak 0,88 gram yang dilarutkan dalam akuades

sebanyak 110 ml yang terdapat dalam erlenmeyer. Dalam praktikum percobaan ini

jumlah banyaknya Nutrien Agar, Nutrien Broth dan akuades yang digunakan

ditambah 10% dari jumlah yang seharusnya. Setelah itu kedua erlenmeyer

dipanaskan diatas alat pemanas dan diaduk dengan menggunakan alat magnetic

stirrer yang bertujuan untuk melarutkan Nutrien Agar dan Nutrien Broth pada

akuades sampai larutan tidak keruh/ jernih. Setelah itu erlenmeyer yang berisi

media Nutrien Agar dan Nutrien Broth ditutup dengan kapas berlemak yang

dibungkus dengan kain kasa. Dan selanjurnya ditutup dengan aluminium foil

sebagaimana seperti pada percobaan sterilisasi alat sebelumnya dan tujuannya pun

sama. Secara umum, dengan menutup atau membungkus alat alat yang akan

disterilisaskan hal ini dilakukan dengan tujuan untuk menghindari terbentuknya

uap air di dinding dan pada alat-alat yang dipanaskan dan agar alat benar-benar

steril dari kontaminasi mikroba. Selanjutnya erlenmeyer tersebut dilakukan

sterilisasi dengan menggunakan autoklaf pada suhu 121° C dengan waktu 20

menit. Teknik sterilisasi pada media yaitu dengan menggunakan teknik sterilisasi

secara fisik dengan dilakukan pemanasan bertekanan dari metode sterilisasi uap

(panas lembab). Setelah itu dilakukan sterilisasi, selanjutnya disimpan di suhu

kamar kemudian dimasukkan ke dalam lemari pendingin untuk disimpan. Setelah

didiamkan selama 24 jam hasil pengamatan pada Nutrien Agar wujudnya berubah

yang asalnya cair menjadi padat (seperti agar), dan warnanya tetap berwarna
orange pekat dan jernih, selain itu juga tidak ada pertumbuhan bakteri atau kapang

pada media tersebut. Hasil pengamatan pada Nutrien Broth wujudnya tidak

berubah tetap dalam kondisi cair dan warnanya tetap kuning pekat dan jernih,

selain itu juga tidak ada pertumbuhan bakteri atau kapang pada media tersebut

.Dalam hal ini dengan ketidakadaannya pertumbuhan bakteri pada media Nutrient

Agar dan Nutrient Broth maka percobaan proses sterilisasi dinyatakan sempurna.
Daftar pustaka pembahasan

Fardiaz, S. 1992. Mikrobiologi Pangan I. PT. Gramedia Pustaka Utama. Jakarta.

Gupte, S. 1990. Mikrobiologi Dasar. Binarupa Aksara. Jakarta.

Irianto,Koes. 2006. Mikrobiologi Jilid 1. Yrama Widya : Bandung.

Suriawiria, U. 2005. Mikrobiologi Dasar. Papas Sinar Sinanti. Jakarta.