A.

Judul penelitian
Effect of Tamarind Seed Extract (Tamarindus indica) on Blood Sugar Levels,
Malondialdehyde, HbA1c, Pancreatic Histipathology, TNF α and Interleukin 6 of Wistar
strain of male rats (Rattus norvegicus) induced by alloxan.

Pengaruh Pemberian Ekstrak Biji Asam Jawa (Tamarindus Indica) Terhadap Gula Darah,
Malondialdehid, Hba1c, Histo PA Pankreas, TNF Α Dan Interleukin 6 Tikus Putih Jantan
(Rattus Norvegicus) Induksi Aloksan.

1. Lokasi Penelitian
Lokasi penelitian di Rumah Sakit Umum Universitas Muhammadiyah Malang dan
Laboratorium Biomedik FK UMM
2. Tidak
3. Tidak

B. Identifikasi
1. Peneliti Utama (CV dilampirkan)

C. Ringkasan Protokol Penelitian

1. Ringkasan 200 kata
Diabetes.melitus (DM) adalah.kelompok.penyakit.metabolik.yang.disebabkan
.kelainan dari sekresi insulin maupun dari .kerja insulin.ataupun.keduanya.
Diabetes..melitus merupakan....penyakit yang menyerang metabolik
dengan..karakterisitik hyperglycemia .oleh..karena kelainan..sekresi insulin, dari
kerja.insulin..atau dari keduanya.. Dari berbagai penelitian dapat menunjukkan bahwa
angka prevalensi dan insidensi DM meningkat di seluruh negara. WHO telah
memprediksi bahwa adanya peningkatan jumlah penyandang diabetes yang cukup besar
di tahun yang akan datang di Indonesia yaitu dengan prediksi kenaikan jumlah
penyandang DM di Indonesia dari 8,4 juta pada tahun 2000 akan menjadi sekitar 21,3
juta yaitu pada tahun 2030 (Konsensus Pengelolaan dan Pencegahan DM tipe 2 di
Indonesia, 2015).
Aloksan adalah senyawa hidrofilik dan tidak stabil yang menyebabkan agen

diabetogenik (Irdalisa, Safrida, Khairil, Abdullah, & Sabri, 2015). Induksi aloksan dapat

memberikan efek rusaknya sel beta pankeas melalui transporter GLUT-2 .yang

akan..meningkatkan pelepasan..insulin..dan protein di.dalam.sel beta..pankres. Keadaan

1
 hiperglikemia ini menyebabkan peningkatan kadar HbA1c dan MDA. Kadar gula darah,

HbA1c, MDA dan histopatologi pankreas kemudian menjadi parameter penting dalam

mengetahui pengaruh ekstrak biji asam jawa terhadap diabetes. Menurut identifikasi

fitokimia, biji asam jawa (Tamarindus indica) mengandung tanin, saponin, glikosida,

flavonoid, dan polifenol. Disamping itu polifenol dan flavonoid dapat menunjukkan efek

antidiabetik, serta efek antioksidan ekstrak tersebut sebagai alternatif antioksidan alami

sebagai terapi pada diabetes melitus

2. Penilitian ini mengapa harus dilakukan, manfaat penelitian untuk penduduk di wilayah
penelitian dilakukan

Mengapa harus dilakukan

Diabetesxmelitusi merupakani suatui penyakiti metaboliki dengani karakteristiki
hiperglikemiai yangi terjadixkarenaxkelainanxsekresi insulin, kerja insulin, atau keduanya.
(Setiati, et al., 2014) Menurut International Diabetes Federation Atlas, jumlahi penderitai
diabetes dengan usia 18-99 tahun di tahun 2017 yakni 451 juta orang. Angka-angka ini
diperkirakan akan meningkat menjadi 693 juta pada tahun 2045. Di tahun 2017, sekitar 5 juta
kematian dalam rentang usia 20-99 tahun di seluruh dunia disebabkan oleh diabetes. (IDF,
2018) Hasil Riset Kesehatan Dasar (Riskesdas) tahun 2018 menunjukkan bahwa prevalensi
diabetes di Indonesia meningkat dibandingkan dengan tahun 2013. Tahun 2013 prevalensi
diabetes sebesar 6,5% sedangkan di tahun 2018 meningkat menjadi 8,5%. (Kemenkes, 2018)

Berbagai macam terapi telah tersedia untuk diabetes mellitus, mulai dari penggunaan

metformin, glimepiride untuk menurunkan pemecahan glikogen oleh hati dan

meningkatkan sensitivitas sel terhadap insulin hingga penggunaan analog insulin itu

sendiri. Obat-obatan tersebut tentu memiliki efek samping tersendiri seperti risiko

hipoglikemi, mual, ketoacidosis, nyeri perut dan gejala lainnya (American Diabetes

Association, 2018). Tentunya di indonesia sendri banyak sekali bahan alam yang dapat

dimanfaatkan untuk dijadikannya terapi herbal yang dapat memeperingan biaya

pengobatan.

2
 manfaat penelitian untuk penduduk di wilayah penelitian dilakukan
Hasil dari penelitian ini diharapkan dapat menambah pengetahuan masyarakat dan
memberikan data ilmiah mengenai diabetes mellitus dan potensi biji asamm jawa sebagai
alternatif pengobatan diabetes mellitus.

D. Isu etik

Penggunaan hewan coba mencit, jumlah dan replikasinya.

Cara mengatasi :

Menggunakan prisip 3R (Replacement, Reduction, Refinement) untuk hewan coba.

Replacement : menggantikan hewan coba dengaan alterative lain, misal model computer dan

in vitro ( galur sel atau kultur jaringan ). Pada penelitian ini, peneliti akan melakukan

in silico untuk mengetahui afinitas antara reseptor dan ligan ( B-Glucan dan resesptor )

dan pengukuran IL-12, IL-10, Th-1 dan Th-2 secara Elisa dan Fluowcytometry

menggunakan in vitro makrofag dari spleen.

Reduction : mengurangi jumlah sesuia kaidah ilmiah. Jumlah mencit yang digunakan

menggunakan rumus Federer,1991

Perhitungan jumlah sampel

Besar sample pada penelitian ini dihitung menggunakan pendekatan resource

equation method (Charan & Kantharia, 2013). Rumus yang digunakan dalam

resource equation method adalah sebagai berikut (Arifin & Zahiruddin, 2017) :

n = (DF/k)+1

n = jumlah subjek per kelompok perlakuan

DF = degree of freedom k = banyaknya kelompok perlakuan

3
Rentang DF yang dapat diterima pada penelitian ini adalah 10-20% (Arifin & Zahiruddin,

2017). Sehingga dilakukan substitusi DF = 10% dan DF = 20% untuk mendapatkan jumlah

sampel maksimal dan minimal. Terdapat 5 kelompok perlakuan, yaitu satu kelompok kontrol

dan empat kelompok perlakuan, sehingga:

Jumlah minimal dan maksimal sampel perkelompok :

Minimum n = 10/k + 1 Maksimum n = 20/k + 1

Minimum n = 10/5 + 1 Maksimum n = 20/5 + 1

Minimum n = 2 +1 Maksimum n = 4+1

Minimum n = 3 Maksimum n = 5

Jumlah minimal dan maksimal sampel :

N minimum = minimum n x k

N minimum = 3 x 5

N minimum = 15

N maksimum = maksimum n x k

N maksimum = 5 x 5

N maksimum = 25

Dari rumus perhitungan di atas didapatkan jumlah rentang sampel di setiap perlakuan

sebanyak 3-5 tikus per kelompok. Peneliti memilih menggunakan 4 tikus per kelompok

sebagai nilai median dari perhitungan di atas.

Refinement : menggunakan hewan coba pada ordo yang paling rendah pada skala evolusi.

Peneliti menggunakan tikus Strain Wistar Jantan (Rattus norvegicus) .

E. Ringkasan hasil Studi sesuai penelitian

2.12 Diabetes Melitus

Diabetes adalah gangguan metabolik kronis yang muncul sebagai akibat dari
4
 kerusakan fungsi sekresi insulin sel beta pankreas atau tubuh tidak dapat menggunakan

insulin secara efektif. Kondisi ini mengarah pada peningkatan kadar glukosa darah yang

disebut hiperglikemia. Terdapat dua bentuk utama diabetes yang biasanya diidentifikasi,

yaitu diabetes tipe 1, juga dikenal sebagai diabetes awitan muda, dan diabetes tipe 2,

sebelumnya disebut sebagai diabetes awitan dewasa (Radenković et al, 2016).

2.12.1 Patofisiologi Diabetes Melitus

Diabetes mellitus tipe 1 dicirikan oleh destruksi autoimun sel-sel beta yang

memproduksi insulin di pankreas oleh CD4 + dan sel T CD8 + dan makrofag yang

menginfiltrasi pankreas. Kerusakan sel β pankreas yang disebabkan oleh

mekanisme autoimun mengarah pada defisiensi sekresi insulin yang menghasilkan

gangguan metabolik yang terkait dengan diabetes mellitus tipe I. Selain hilangnya

sekresi insulin, fungsi sel α pankreas yang abnormal juga menyebabkan sekresi

glukagon yang berlebihan pada pasien diabetes mellitus tipe I. Biasanya,

hiperglikemia menyebabkan sekresi glukagon berkurang. Namun, pada pasien

dengan diabetes mellitus tipe I, sekresi glukagon tidak ditekan oleh hiperglikemia.

(Baynest, 2015).

Ada hubungan langsung antara hiperglikemia dengan respon fisiologis dan

perilaku. Kapan pun terjadi-hiperglikemia, otakPmengenalinya danumengirim

pesan melalui impuls saraf ke pankreas dan organ lainnya untuk mengembalikan

kondisi hiperglikemia menjadi normal. Pada diabetes tipe II, mekanisme ini rusak

sehingga

5
 menimbulkan dua kelainan patologis utama pada diabetes tipe II, yaitu

gangguan sekresi insulin melalui disfungsi sel β pankreas, dan

efektivitas insulin yang terganggu melalui resistensi insulin (Baynest,

2015).

Dalam situasi dimana resistensi terhadap7insulin mendominasi,

massa sel β mengalami transformasi yang mampugmeningkatkan suplai

insulin dan mengkompensasi permintaan yang berlebihan. Pada pasien

dengan diabetes mellitus tipe II, konsentrasi insulin plasma (baik dalam

keadaan puasa maupun ketika distimulasi oleh makanan) biasanya

meningkat dan, walaupun "relatif" terhadap tingkat keparahan resistensi

insulin, konsentrasi insulin plasma tidak cukup untuk mempertahankan

homeostasis glukosa normal. Mengingat hubungan antara

sekresi7insulin dan sensitivitas tindakan hormon dalam kontrol

homeostasishglukosa yang rumit, secara praktis tidak mungkin

memisahkan kontribusi masing-masing terhadap9etio-patogenesis

diabetes melllitus tipe II. Resistensi insulin dan hiperinsulinemia

akhirnya menyebabkan gangguan toleransi glukosa (Baynest, 2015).

2.12.2 Aloksan

Aloksan adalah zat yang sering digunakan untuk induksi dalam

penelitian eksperimental diabetes mellitus. Aloksan memiliki

beberapanmekanisme kerja yang menjadi dasar sifat diabetogeniknya. Mekanisme

pertama adalah aloksan berikatan dengan grup -SH pada situs pengikat gula milik

enzim glukokinase dan menyebabkan enzim tersebut inaktif. Mekanisme ini

diperkuat dengan adanya zat-zat pereduksi di dalam sel beta pankreas seperti

GSH, cysteine, ascorbate dan grup sulfhydryl yang terikat protein (-SH).

Mekanisme kedua adalah siklus redoks dari aloksan yang memproduksi ROS dan

superoxide radicals. ROS dan superoxide radicals kemudian akan merusak DNA

sel beta pankreas dengan cara menghilangkan kemampuan sel untuk memperbaiki

DNAnya sendiri. Mekanisme ketiga adalah kemampuan aloksan untuk

meningkatkan kadar ion kalsium bebas di dalam sel beta pankreas. Peningkatan

kadar kalsium bebas disebabkan oleh kemampuan aloksan mendepolarisasi sel

beta pankreas sehingga membuka kanal kasium dan menyebabkan influx ion

kalsium. Keadaan ini menyebabkan pelepasan insulin suprafisiologis yang dapat

diamati pada fase awal pemberian aloksan. (Rohilla, 2012)

2.12.3

Taksonomi

Fenugreek atau kelabat dengan nama ilmiah trigonella foenum-

graecum L. tumbuh di banyak negara terutama di kawasan Asia.

Fenugreek telah dikenal sebagai suplemen makanan atau obat-obatan.

Fenugreek telah banyak digunakan untuk penyakit metabolik

termasuk hiperglikemia dan diabetes. Salah satu aplikasinya yaitu

dijadikan obat diet suplemen dengan serat fenugreek untuk

mengontrol glukosa darah.

57
 Tanaman Fenugreek dan Biji Fenugreek, Naicker, 2014.

Klasifikasi fenugreek secara botani (Meghwal, et al, 2012).

Kingdom : Plantae
Divisi : Magnoliophyta
Kelas : Magnoliopsida
Ordo : Fabales
Famili : Fabaceae
Genus : Trigonella
Spesies : Trigonella foenum graceum

2.5.2 Kandungan kimia

Uji Golongan Kimia Ekstrak Biji fenugreek (Srinivasan, K, 2006).

58
2.5.3 serat mucilage galactomannan, 4-hydroxyisoleucine pada kulit batang
matoa

Menurut Fatchiyah, 2011 diet serat mucilage galactomannan dapat

mengurangi kebutuhan akan insulin. Menurunnya kebutuhan insulin berarti

juga menurunkan aktivitas sel β pankreas dalam produksi insulin. Akibatnya

jika terdapat penurunan aktivitas sel, maka regenerasi sel akan terganggu,

untuk itu diharapkan mengkonsumsi serat mucilage galactomannan yang tinggi

agar dapat meningkatkan produksi insulin dan membantu proses kerja ATP

yang seharusnya digunakan untuk sekresi insulin dari vesikel dan digunakan

dalam melakukan regenerasi sel β pankreas.

Serta senyawa khas 4-hydroxyisoleucine ini adalah jenis isomer, asam

amino, ditemukan di biji fenugreek ini yang memiliki efek pada glukosa dan

metabolisme lipid dan dapat digunakan untuk mengontrol diabetes, obesitas

dan dislipidemia, karena 4-hydroxyisoleucine terbukti menstimulasi sekresi

insulin mampu meragsang sel β pankreas, menurunkan resistensi insulin pada

otot dan hati (Karviarasan, 2009).

2.6 MDA

2.6.1 Definisi

Malondialdehida (MDA) adalah salah satu dari produk sekunder

aldehid dari peroksidasi lipid. Akibat dari proses degradasi radikal bebas OH

terhadap PUFA menghasilkan senyawa ini, yang nantinya menjadi senyawa

radikal yang sangat reaktif. Senyawa dialdehid yang merupakan produk akhir

peroksidasi lipid di dalam tubuh yang berupa MDA yang memiliki tiga rantai

59
 karbon dengan rumus molekul C3H4O2 (Khrisna dkk, 2016). MDA juga

merupakan produk dekomposisi dari asam amino, karbohidrat kompleks,

pentosa dan heksosa. Selain itu, MDA juga merupakan produk yang dihasilkan

oleh radikal bebas melalui reaksi ionisasi dalam tubuh dan produk samping

biosintesis prostaglandin yang merupakan produk akhir oksidasi lipid

membran. Selain itu, MDA juga merupakan metabolit komponen sel yang

dihasilkan oleh radikal bebas. Oleh karena itu, konsentrasi MDA yang tinggi

menunjukkan adanya proses oksidasi dalam membran sel. Status antioksidan

yang tinggi biasanya diikuti oleh penurunan kadar MDA (Winarsi dkk, 2003).

F. Gambaran singkat tentang lokasi Penelitian

1. Lokasi penelitian di Biomedik Fakultas Kedoktera Universitas

Muhammadiyah Malang, Institut Biosains Universitas Brawijaya dan Rumah

Sakit Umum Universitas Muhammadiyah Malang. Masing – masing

Laboratorium mempunyai penangung jawab dan asisten Laboratorium yang

berkompeten di bidangnya.

2. Ketersediaan fasilitas

a. pemeliharaan, induksi dan perlakuan (pemberian ekstrak) hewan coba

dilakukan di institut biosains universitas brawijaya

b. pemeriksaan kadar gula darah, MDA, HbA1c dan histopatologi pankreas

dilakukan di Rumah Sakit Umum Universitas Muhammadiyah Malang

karena fasilitas yang memadai dan pakar yang ahli di bidangnya.

60
3. demografi

Institut Biosains terletak di Universitas Brawijaya yang dekat dengan fakultas

kedokteran universitas muhammadiyah malang. Rumah Sakit Umum

Universitas Muhammadiyah Malang merupakan satu badan usaha yang

dimiliki UMM sehingga mempermudah akses untuk keperluan penelitian.

G. Desain Penelitian

1.2 Rumusan Masalah

Berdasarkan latar belakang yang diuraikan di atas maka pokok permasalahan yang

timbul adalah :

Apakah ekstrak Biji Klabet (Trigonella foenum graecum) berpengaruh

terhadap kadar gula darah, HbA1c, MDA dan histopatologi pankreas tikus

jantan (Rattus norvegicus) strain Wistar yang diinduksi aloksan?

Dari pokok permasalahan tersebut, dapat dibuat submasalah sebagai berikut :

1.2.1 Apakah pemberian ekstrak Biji Klabet (Trigonella foenum graecum) dapat

menurunkan kadar gula darah tikus jantan (Rattus norvegicus) strain Wistar

yang diinduksi aloksan?

1.2.2 Apakah pemberian ekstrak Biji Klabet (Trigonella foenum graecum) dapat

menurunkan kadar HbA1c tikus jantan (Rattus norvegicus) strain Wistar

yang diinduksi aloksan?

1.2.3 Apakah pemberian ekstrak Biji Klabet (Trigonella foenum graecum) dapat

menurunkan kadar MDA tikus jantan (Rattus norvegicus) strain Wistar yang

diinduksi aloksan?

61
1.2.6 Apakah pemberian ekstrak Biji Klabet (Trigonella foenum graecum)

berpengaruh terhadap histopatologi pulau Langerhans pankreas tikus jantan

(Rattus norvegicus) strain Wistar yang diinduksi aloksan?

1.3 Tujuan Penelitian

1.3.1 Tujuan Umum

Tujuan umum penelitian ini adalah mengukur pengaruh ekstrak Biji Klabet

(Trigonella foenum graecum) terhadap kadar gula darah, HbA1c, MDA dan

gambaran histopatologi pulau Langerhans pankreas tikus jantan (Rattus

norvegicus) strain Wistar yang diinduksi aloksan.

1.3.2 Tujuan Khusus

1.3.2.1 Mengukur pengaruh ekstrak Biji Klabet (Trigonella foenum graecum)

terhadap kadar gula darah tikus jantan (Rattus norvegicus) strain Wistar

yang diinduksi aloksan.

1.3.2.2 Mengukur pengaruh ekstrak Biji Klabet (Trigonella foenum graecum)

terhadap kadar HbA1c tikus jantan (Rattus norvegicus) strain Wistar yang

diinduksi aloksan.

1.3.2.3 Mengukur pengaruh ekstrak Biji Klabet (Trigonella foenum graecum)

terhadap kadar MDA tikus jantan (Rattus norvegicus) strain Wistar yang

diinduksi aloksan.

1.3.2.4 Mengukur pengaruh ekstrak Biji Klabet (Trigonella foenum graecum)

terhadap gambarana histopatologi pulau Langerhans pankreas tikus jantan

(Rattus norvegicus) strain Wistar yang diinduksi aloksan.

3.2 Hipotesis Penelitian

62
 Berdasarkan latar belakang, tinjauan pustaka, kerangka konseptual dan

tujuan yang ingin dicapai melalui penelitian ini, maka dapat dirumuskan hipotesis

penelitian, bahwa : yang diuraikan di atas maka pokok permasalahan yang timbul

adalah :

Terdapat pengaruh pemberian ekstrak Biji Klabet (Trigonella foenum

graecum) terhadap kadar gula darah, HbA1c, MDA dan gambaran

histopatologi pulau Langerhans pankreas tikus jantan (Rattus norvegicus)

strain Wistar yang diinduksi aloksan.

Sebagai subhipotesis dari penelitian adalah sebagai berikut :

3.2.1 Pemberian ekstrak kulit Biji Klabet (Trigonella foenum graecum) pada tikus

jantan (Rattus norvegicus) strain Wistar yang diinduksi aloksan dapat

menurunkan kadar gula darah

3.2.2 Pemberian ekstrak kulit Biji Klabet (Trigonella foenum graecum) pada tikus

jantan (Rattus norvegicus) strain Wistar yang diinduksi aloksan dapat

menurunkan kadar HbA1c

3.2.3 Pemberian ekstrak Biji Klabet (Trigonella foenum graecum) pada tikus

jantan (Rattus norvegicus) strain Wistar yang diinduksi aloksan dapat

menurunkan kadar MDA

3.2.4 Pemberian ekstrak Biji Klabet (Trigonella foenum graecum) pada tikus

jantan (Rattus norvegicus) strain Wistar yang diinduksi aloksan

mempengaruhi gambaran histopatologi pulau Langerhans pankreas.

63
4.5 Variabel Penelitian
1. Variabel Bebas (Independent variable), sebagai variabel bebas adalah

ekstrak Biji Klabet (Trigonella foenum graecum)

2. Variabel tergantung (Dependent variable) adalah kadar gula darah,

HbA1c, MDA dan gambaran histopatologi pulau Langerhans pankreas

tikus jantan (Rattus norvegicus) strain Wistar yang diinduksi aloksan.

Diskripsi detail tentang penelitian

4.6 Definisi Operasional Variabel

Variabel Definisi Alat Ukur Skala Variabel

Operasional
Gula Darah Kadar gula darah Glucose meter Ratio
yang terkandung
dalam darah yang
diambil dari vena
ekor tikus.
HbA1c Jumlah kandungan HPLC Rasio
HbA1c dalam
plasma darah tikus
yang diukur
sesudah
perlakuan.
MDA Jumlah kandungan spektrofotometri Rasio
MDA dalam
plasma darah tikus
yang diukur
sesudah perlakuan
Histopatologi Jumlah seluruh Mikroskop Rasio
pulau sel endokrin
Langerhans dalam pulau
pankreas Langerhans per 5
lapang pandang.

TNF α Jumlah Elisa Rasio

Kandungan TNF
α dalam plasma
darah yang
diukur setelah
perlakuan
IL-6 Jumlah Elisa Rasio
Kandungan TNF
α dalam plasma
darah yang
diukur setelah
perlakuan

64
4.7 Prosedur Pemeriksaan
4.7.1 Pembuatan Ekstrak Biji Klabet (Trigonella foenum graecum)
Pembuatan ekstrak Biji Klabet (Trigonella foenum graecum) dimulai dengan
pengambilan simplisia kemudian dilakukan sortasi terlebih dahulu. Simplisia yang
telah disortasi kemudian dihaluskan menggunakan penggiling sehingga
didapatkan serbuk simplisia dari Biji Klabet (Trigonella foenum graecum).
Simplisia yang telah dihaluskan kemudian diekstraksi dengan cara maserasi
menggunakan pelarut etanol 95% selama 3x24 jam kemudian diganti dengan
pelarut yang baru. Ekstrak yang dihasilkan selanjutnya dipekatkan menggunakan
rotatory evaporator lalu penguapan dilanjutkan dengan menggunakan waterbath
hingga diperoleh berat ekstrak yang konstan (Rahmawati, Febriana, & Tjitraresmi,
2016).
4.7.2 Analisa pemberian perlakuan ekstrak Biji Klabet (Trigonella foenum
graecum) terhadap kadar gula darah dengan glucometer
Pengukuran kadar gula darah tikus dilakukan dengan

menggunakan glukosa meter digital dengan merk AccuChek® dan test strips merk

AccuChek® yang diambil dari ujung ekor tikus yang sebelumnya sudah disayat

terlebih dahulu (Prasetyo, Denashurya, Putri, & Ilmiawan, 2016). Keadaan

hiperglikemi tikus setelah diinduksi aloksan adalah >200 mg/dl (Louis, Yuvaraj,

Madhavachandran, & Anandan, 2015).

4.7.3 Analisa pemberian perlakuan ekstrak Biji Klabet (Trigonella foenum

graecum) terhadap kadar HbA1c dengan HPLC

Pengukuran HbA1c tikus dilakukan menggunakan metode HPLC. Pengambilan

darah tikus dilakukan dari ventrikel jantung tikus dengan cara cardiac puncture.

Darah yang diambil kemudian dimasukkan ke dalam tube berisi EDTA untuk

kemudian dimasukkan ke dalam HPLC untuk analisis secara otomatis.

4.7.4 Pengukuran MDA

Kadar MDA diukur dengan alat spektrofotometri dengan menggunakan metode

Thiobarbituric acid Reactive Substance (TBARs) assay yang di amati

menggunakan spektrofotometri UV-Vis.

65
4.7.5 Pemeriksaan Histopatologi Pulau Langerhans Pankreas

Pankreas tikus diambil melalui pembedahan kemudian dijadikan preparat

untuk pemeriksaan histologi. Pewarnaan organ pankreas dilakukan dengan
pewarna HE dan pembacaan preparat dengan mikroskop pembesaran 400x
dibawah supervisi ahli patologi anatomi

66
 4.8 Alur Penelitian

Pengumpulan Biji Klabet (Trigonella foenum graecum)

Pembuatan ekstrak Biji Klabet (Trigonella foenum graecum)

15 ekor tikus Strain Wistar (Rattus norvegicus)

Adaptasi, pemberian makan BR-1, dan minum aquadest (hari ke 1-7)

Dipuasakan selama 18 jam (hari ke 8 )

K (+) P1 P2 P3 P4

Diinduksi aloksan 150mg/kgBB + pakan BR-1 dan minum aquadest (Hari ke 8)

Pengukuran Gula Darah (Hari ke 10)

K (+) P1 P2 P3 P4

Pemberian Pemberian Pemberian ekstrak Pemberian ekstrak Pemberian ekstrak

makan BR-1 + glimepiride biji klabet 100 biji klabet 200 biji klabet 400
minum 4mg/kg dan diberi mg/200 grBB dan mg/200 grBB dan mg/200 grBB dan
makan BR-1 + diberi makan BR-1 diberi makan BR-1 + diberi makan BR-1
aquadest (hari
minum aquadest + minum aquadest minum aquadest + minum aquadest
ke 24-37)
(hari ke 24-37) (hari ke 24-37) (hari ke 24-37) (hari ke 24-37)

Pengambilan darah dan pankreas tikus (Hari ke 37)

Pengukuran gula darah, HbA1c, MDA, dan pemeriksaan histopatologi pankreas tikus(Hari ke 37)

Analisis data

67
68
H. Sampling
4.2 Sampel dan subyek penelitian
Sampel adalah : Lima belas tikus putih jantan (Rattus norvegicus) strain wistar dengan

berat badan sekitar ± 200- 240 gram berusia 2-3 bulan.

Dibagi secara acak menjadi lima kelompok :

a. Kelompok Kontrol (+)

Pemberian aloksan single dose 150 mg/kgBB.
b. Kelompok P I
Pemberian aloksan single dose 150mg/kgBB dilanjutkan dengan pemberian

obat glimepiride 4mg/kgBB ().

c. Kelompok P II
pemberian aloksan single dose 150 mg/kgBB dilanjutkan dengan pemberian

ekstrak biji klabet 100 mg/200 grBB.

d. Kelompok P III
Pemberian aloksan single dose 150 mg/kgBB dilanjutkan dengan pemberian

ekstrak biji klabet 200 mg/200 grBB.

e. Kelompok P IV
Pemberian aloksan single dose 150 mg/kgBB dilanjutkan dengan pemberian

ekstrak biji klabet 400 mg/200 grBB.

4.3 Perhitungan jumlah sampel

Besar sample pada penelitian ini dihitung menggunakan pendekatan resource

equation method (Charan & Kantharia, 2013). Rumus yang digunakan dalam

resource equation method adalah sebagai berikut (Arifin & Zahiruddin, 2017) :

n = (DF/k)+1

n = jumlah subjek per kelompok perlakuan

DF = degree of freedom k = banyaknya kelompok perlakuan

69
Rentang DF yang dapat diterima pada penelitian ini adalah 10-20% (Arifin & Zahiruddin, 2017).

Sehingga dilakukan substitusi DF = 10% dan DF = 20% untuk mendapatkan jumlah sampel

maksimal dan minimal. Terdapat 5 kelompok perlakuan, yaitu satu kelompok kontrol dan empat

kelompok perlakuan, sehingga:

Jumlah minimal dan maksimal sampel perkelompok :

Minimum n = 10/k + 1 Maksimum n = 20/k + 1

Minimum n = 10/5 + 1 Maksimum n = 20/5 + 1

Minimum n = 2 +1 Maksimum n = 4+1

Minimum n = 3 Maksimum n = 5

Jumlah minimal dan maksimal sampel :

N minimum = minimum n x k

N minimum = 3 x 5

N minimum = 15

N maksimum = maksimum n x k

N maksimum = 5 x 5

N maksimum = 25

Dari rumus perhitungan di atas didapatkan jumlah rentang sampel di setiap perlakuan sebanyak
3-5 tikus per kelompok. Peneliti memilih menggunakan 3 tikus per kelompok yang merupakan
jumlah minimal yang tetap bermakna secara statistik.
I. Intervensi
Tidak relevan
J. monitoring
Tidak relevn
K. Penghentian Penelitian
Tidak relevan
L. Adverse Event
Tidak relevn
M. Penanganan Komplikasi
Tidak relevan
N. Manfaat
1.4 Manfaat Penelitian secara pribadi

Ditemukannya teori dan data pendukung mengenai efek Biji Klabet (Trigonella foenum

graecum) terhadap kadar gula darah, HbA1c, MDA dan histopatologi pulau Langerhans

pankreas tikus jantan Rattus norvegicus) strain Wistar yang diinduksi aloksan.

1.4.2 Manfaat Penelitian bagi penduduk

Hasil dari penelitian ini diharapkan dapat menambah pengetahuan masyarakat mengenai

diabetes mellitus dan potensi kulit kayu batang matoa sebagai alternatif pengobatan

diabetes mellitus.

O. Jaminan

Tidak relevan

P. IC

Tidak relevan

Q. Wali

Tidak relevan

R. Bujukan

Tidak relevan

S. Penjagaan Kerahasiaan
Tidak Relevan

T. Rencana Analisis

Tidak relevan

U. Monitor keamanan

Tidak relevan

V.

Tidak relevan

W.

Tidak relevan

X.

Tidak relevan

Y. Pubilkasi

Tidak relevan

Z.

Tidak relevan

AA.

BB

DAFTAR PUSTAKA
Abbas, A. K. (2015) CELLULAR AND MOLECULAR IMMUNOLOGY. Eighth. Canada:
Elsevier Inc.
Anusuya, S. and Sathiyabama, M. (2014) ‘Preparation of beta-D-glucan nanoparticles and its
antifungal activity.’, International journal of biological macromolecules. Netherlands, 70,
pp. 440–443. doi: 10.1016/j.ijbiomac.2014.07.011.
Awate, S., Babiuk, L. A. and Mutwiri, G. (2013) ‘Mechanisms of action of adjuvants’, 4(May),
pp. 1–10. doi: 10.3389/fimmu.2013.00114.
Budak, F., Göral, G. and Oral, H. B. (2008) ‘Interferon-Gamma Production in Human T Cells
Via IL-12’, Turk J Immunol, 13, pp. 21–26.
Camilli, G., Tabouret, G. and Quintin, J. (2018) ‘The Complexity of Fungal β-Glucan in Health
and Disease: Effects on the Mononuclear Phagocyte System’, Frontiers in Immunology.
doi: 10.3389/fimmu.2018.00673.
Christensen, D. (2016) ‘Vaccine adjuvants : Why and how’, Human Vaccines &
Immunotherapeutics. Taylor & Francis, 12(10), pp. 2709–2711. doi:
10.1080/21645515.2016.1219003.
Crump, J. A. et al. (2015) ‘Epidemiology, clinical presentation, laboratory diagnosis,
antimicrobial resistance, and antimicrobial management of invasive Salmonella
infections’, Clinical Microbiology Reviews. doi: 10.1128/CMR.00002-15.
Crump, J. A. and Chb, M. B. (2017) ‘Epidemiology and global burden of disease of typhoid
fever McKinlay Professor of Global Health’, (October).
Crump, J. A., Luby, S. P. and Mintz, E. D. (2004) ‘The global burden of typhoid fever’,
002295(03).
Delves, P. J. et al. (2017) Roitt’s Essential Immunology. 13th edn. Chichester: John Wiley &
Sons. Available at: http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?
artid=4322159&tool=pmcentrez&rendertype=abstract.
Depkes RI (2007) ‘Pedoman pengobatan dasar di puskesmas 2007’.
Dougan, G. and Baker, S. (2014) ‘Salmonella enterica Serovar Typhi and the Pathogenesis of
Typhoid Fever’, Annual Review of Microbiology, 68(1), pp. 317–336. doi:
10.1146/annurev-micro-091313-103739.
Dugassa, J. (2017) ‘REVIEW ON ANTIBIOTIC RESISTANCE AND ITS MECHANISM OF
DEVELOPMENT’, Journal of Health, Health, Medicine and Nursing, Vol.1, Iss(April),
 pp. 1–17.
Engen, P. A. et al. (2012) ‘The Gastrointestinal Microbiome’, (Cdc).
Frempong, S. N. et al. (2018) ‘Economic evaluation of typhoid - a review.’, Expert review of
pharmacoeconomics & outcomes research. England, 18(6), pp. 601–607. doi:
10.1080/14737167.2018.1503952.
Fuentes, A.-L. et al. (2014) ‘Lipopolysaccharide-mediated enhancement of zymosan
phagocytosis by RAW 264.7 macrophages is independent of opsonins, laminarin,
mannan, and complement receptor 3.’, The Journal of surgical research. United States,
189(2), pp. 304–312. doi: 10.1016/j.jss.2014.03.024.
Giannini, M. J. S. M. (2019) ‘Candida species : current epidemiology , pathogenicity , biofilm
formation , natural antifungal products and new therapeutic options’, (2013), pp. 10–24.
doi: 10.1099/jmm.0.045054-0.
Gomes, C. M. et al. (2010) ‘Molecular imaging with SPECT as a tool for drug development ☆’,
Advanced Drug Delivery Reviews. Elsevier B.V. doi: 10.1016/j.addr.2010.09.015.
Hamid, N. and Jain, S. K. (2007) ‘Immunological, cellular and molecular events in typhoid
fever’, Indian Journal of Biochemistry and Biophysics, 44(5), pp. 320–330.
Higginson, E. E., Simon, R. and Tennant, S. M. (2016) ‘Animal models for salmonellosis:
Applications in vaccine research’, Clinical and Vaccine Immunology, pp. 746–756. doi:
10.1128/CVI.00258-16.
Jandhyala, S. M. et al. (2015) ‘role of the normal gut microbiota’, 21(29), pp. 8787–8803. doi:
10.3748/wjg.v21.i29.8787.
Juel, H. B. et al. (2018) ‘Salmonella Typhi bactericidal antibodies reduce disease severity but do
not protect against typhoid fever in a controlled human infection model’, Frontiers in
Immunology, 8(JAN). doi: 10.3389/fimmu.2017.01916.
Kaur, J. and Jain, S. K. (2012) ‘Role of antigens and virulence factors of S almonella enterica
serovar Typhi in its pathogenesis’, Microbiological Research. Elsevier GmbH., 167(4),
pp. 199–210. doi: 10.1016/j.micres.2011.08.001.
Kobiyama, K. et al. (2016) ‘Species-dependent role of type I IFNs and IL-12 in the CTL
response induced by humanized CpG complexed with beta-glucan.’, European journal of
immunology. Germany, 46(5), pp. 1142–1151. doi: 10.1002/eji.201546059.
Kraaij, M. D., van Dijk, A. and Haagsman, H. P. (2017) ‘CATH-2 and LL-37 increase mannose
 receptor expression, antigen presentation and the endocytic capacity of chicken
mononuclear phagocytes.’, Molecular immunology. England, 90, pp. 118–125. doi:
10.1016/j.molimm.2017.07.005.
Larry D. Hanke, P. . (2014) Handbook of analytical Methods for materials FOURIER
TRANSFORM-INFRARED SPECTROSCOPY.
Leentjens, J. et al. (2014) ‘The effects of orally administered Beta-glucan on innate immune
responses in humans, a randomized open-label intervention pilot-study.’, PloS one.
United States, 9(9), p. e108794. doi: 10.1371/journal.pone.0108794.
Maclennan, C. A., Martin, L. B. and Micoli, F. (2014) ‘Vaccines against invasive Salmonella
disease Current status and future directions’, (June), pp. 1478–1493.
Martinez, M. et al. (2018) ‘Phytochemical composition and beta-glucan content of barley
genotypes from two different geographic origins for human health food production.’,
Food chemistry. England, 245, pp. 61–70. doi: 10.1016/j.foodchem.2017.09.026.
Menkes RI (2006) ‘Keputusan Menteri Kesehatan Republik Indonesia Nomor 364/
Menkes/SK/V/2006 tentang Pedoman Pengendalian Demam Tifoid.pdf’.
Mogasale, V. et al. (2014) ‘Burden of typhoid fever in low-income and middle-income countries:
A systematic, literature-based update with risk-factor adjustment’, The Lancet Global
Health. Mogasale et al. Open Access article distributed under the terms of CC BY-NC-
SA, 2(10), pp. e570–e580. doi: 10.1016/S2214-109X(14)70301-8.
Neville, B. A., Enfert, C. and Bougnoux, M. (2015) ‘Candida albicans commensalism in the
gastrointestinal tract’, (August), pp. 1–13. doi: 10.1093/femsyr/fov081.
Palucka, K., Banchereau, J. and Mellman, I. (2010) ‘Review Designing Vaccines Based on
Biology of Human Dendritic Cell Subsets’, Immunity. Elsevier Inc., 33(4), pp. 464–478.
doi: 10.1016/j.immuni.2010.10.007.
Patel, K. (2012) ‘A review on herbal immunoadjuvant’, International Journal of Pharmacy and
LifeSciences, 3(3), pp. 1568–1576. doi: 10.1007/s13596-011-0019-1.
Pitarch, A. and Sa, M. (2017) ‘Sequential Fractionation and Two-dimensional Gel Analysis
Unravels the Complexity of the Dimorphic Fungus Candida albicans Cell Wall Proteome
*’, (January 2003). doi: 10.1074/mcp.M200062-MCP200.
Poulos, C. et al. (2011) ‘Cost of illness due to typhoid fever in five Asian countries’, 16(3), pp.
314–323. doi: 10.1111/j.1365-3156.2010.02711.x.
Purba, I. E. et al. (2016) ‘Program Pengendalian Demam Tifoid di Indonesia : tantangan dan
peluang’, pp. 99–108.
Raffatellu, M. et al. (2008) ‘Clinical pathogenesis of typhoid fever.’, Journal of infection in
developing countries, 2(4), pp. 260–266. doi: 10.3855/jidc.219.
Roberts, M. C. (2018) ‘Mechanisms of Bacterial Resistance to Antimicrobial Agents’, (January).
doi: 10.1128/microbiolspec.ARBA-0019-2017.
Rowland, I. et al. (2018) ‘Gut microbiota functions : metabolism of nutrients and other food
components’, European Journal of Nutrition. Springer Berlin Heidelberg, 57(1), pp. 1–
24. doi: 10.1007/s00394-017-1445-8.
Rusek, P. et al. (2018) ‘Infectious Agents as Stimuli of Trained Innate Immunity.’, International
journal of molecular sciences. Switzerland, 19(2). doi: 10.3390/ijms19020456.
Sheikh, A. et al. (2011) ‘Interferon-γ and proliferation responses to Salmonella enterica serotype
Typhi proteins in patients with S. Typhi bacteremia in Dhaka, Bangladesh’, PLoS
Neglected Tropical Diseases, 5(6). doi: 10.1371/journal.pntd.0001193.
Slayton, R. B., Date, K. A. and Mintz, E. D. (2013) ‘Vaccination for typhoid fever in Sub-
Saharan Africa’, (April), pp. 903–906.
Sluyters, R. C. Van et al. (2002) GUIDELINES FOR THE CARE AND USE OF MAMMALS IN
NEUROSCIENCE AND BEHAVIORAL RESEARCH, Rock and Soil Mechanics. doi:
10.17226/10732.
Smith, R. E. et al. (1999) ‘Immune-stimulating complexes induce an IL-12-dependent cascade of
innate immune responses’, The Journal of Immunology ·, 162(June 2014), pp. 5536–
5546.
Ugboko, H. and De, N. (2017) ‘Mechanisms of Antibiotic resistance in Salmonella typhi Review
Article Mechanisms of Antibiotic resistance in Salmonella typhi Introduction Salmonella
typhi is is a particular Salmonella’, (December).
Vetvicka, V. (2011) ‘Glucan-immunostimulant, adjuvant, potential drug’, 2(2), pp. 115–119. doi:
10.5306/wjco.v2.i2.115.
Vetvicka, V. and Vetvickova, J. (2015) ‘Glucan supplementation enhances the immune response
against an influenza challenge in mice’, 3(13), pp. 1–7. doi: 10.3978/j.issn.2305-
5839.2015.01.08.
WHO (2003) ‘Background document : The diagnosis , treatment and and prevention of typhoid
 fever’.
Winarsih, S. et al. (2019) ‘β-Glucan of Candida albicans Cell Wall Extract Inhibits salmonella
typhimurium Colonization by Potentiating Cellular Immunity (CD8+ and CD4+ T
Cells)’, Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical Journal of the Brazilian
Society of Tropical Medicine, 52:e201802.
Wu, W. et al. (2018) ‘Cathelicidin-WA attenuates LPS-induced inflammation and redox
imbalance through activation of AMPK signaling.’, Free radical biology & medicine.
United States, 129, pp. 338–353. doi: 10.1016/j.freeradbiomed.2018.09.045.
Xing, Z., Zganiacz, A. and Santosuosso, M. (2000) ‘Role of IL-12 in macrophage activation
during intracellular infection: IL-12 and mycobacteria synergistically release TNF-alpha
and nitric oxide from macrophages via IFN-gamma induction.’, Journal of leukocyte
biology, 68(6), pp. 897–902. doi: 10.1189/JLB.68.6.897.
Zechner-Krpan, V. et al. (2010) ‘Characterization of β-glucans isolated from brewer’s yeast and
dried by different methods’, Food Technology and Biotechnology, 48(2), pp. 189–197.
doi: 10.1016/j.fgb.2004.11.006.
Zhang, X. L., Jeza, V. T. and Pan, Q. (2008) ‘Salmonella typhi: From a human pathogen to a
vaccine vector’, Cellular and Molecular Immunology, pp. 91–97. doi:
10.1038/cmi.2008.11.