Identifikasi dan Kuantifikasi Ester Zeaxanthin pada Tanaman Menggunakan

Kromatografi Cair − Spektrometri Massa

Abstrak

Telah disarankan bahwa lutein dan zeaxanthin dapat mengurangi risiko degenerasi makula
terkait usia. Yang mengejutkan, oleoresin yang kaya akan zeaxanthin belum tersedia di
pasaran. Beberapa penulis telah melaporkan peningkatan stabilitas xantofil teresterifikasi,
sehingga tanaman yang mengandung ester zeaxanthin diselidiki untuk membangun sumber
berharga untuk produksi oleoresin tahan lama. Kromatografi cair - spektrometri massa ionisasi
kimia tekanan atmosfer [LC- (APCI) MS] digunakan untuk mengidentifikasi secara pasti ester
zeaxanthin dari campuran standar dan dalam beberapa ekstrak tanaman. Ester Zeaxanthin
dihitung berdasarkan massa molekul masing-masing menggunakan zeaxanthin untuk kalibrasi;
zeaxanthin total ditentukan setelah saponifikasi alikuot ekstrak. Jadi, wolfberry kering (L y c i
u m b a r b a r u m), lentera Cina (P h y s a l k e k e n g i), lada jeruk (Capsicum annuum), dan
buckthorn laut (Hippophae rhamnoides) terbukti menjadi sumber ester zeaxanthin yang
berharga. Metode LC-MS saat ini memungkinkan analisis ester zeaxanthin yang lebih rinci
daripada yang dilaporkan sebelumnya.

Pendahuluan

Zeaxanthin (â, â-carotene-3,3′-diol) dan lutein (â, -carotene3,3′-diol) tersebar luas di tanaman.
Karena karotenoid sangat berwarna, mereka banyak digunakan sebagai pewarna makanan.
1. Lada Merah (Capsicum annuum L.). Ester capsanthin yang terjadi pada lada merah
telah dipelajari secara luas (mis., Ref 17-19). Lebih sedikit informasi yang tersedia
mengenai ester zeaxanthin asli, yang terjadi sebagai konstituen minor. Biacs dan Daood

BAHAN
Bahan kimia. Minyak bumi ringan (fraksi didih 40-60 ° C), metanol, etil asetat, dan aseton
dibeli dari Merck (Darmstadt, Jerman); tert-butil metil eter, n-heksana, piridin (99,8%, lebih
dari saringan molekuler), lauroil klorida, miristoil klorida, palmitoil klorida, dan stearoil
klorida (kemurnian semua asil klorida) 99%) berasal dari Sigma-Aldrich (Taufkirchen,
Jerman); dan silika gel (0,063-0,2 mm) berasal dari J. T. Baker (Griesheim, Jerman).

Semua pelarut disuling sebelum digunakan. Air dengan kemurnian tinggi disiapkan dengan
sistem pemurnian air Milli-Q 185 Plus (Millipore, Eschborn, Jerman).

Zeaxanthin sebagai bahan referensi disediakan dengan murah hati oleh Roche Vitamins (Basel,
Swiss). Sampel Tumbuhan. Paprika merah dan oranye segar (Ca. annuum L.), cabai Thailand
oranye (Ca. annuum L.), bunga zucchini (Cu. Pepo L.), kesemek (D. kaki L.), dan biji jagung
manis segar ( Z. mays L.), diperoleh dari toko eceran. Wolfberry kering-panas (L. barbarum
L.) yang berasal dari Cina disediakan oleh Rich Nature Nutraceutical Labs, Lynnwood,.
Lentera Cina segar (P. alkekengi) bersama dengan sekam matang merahnya (tidak dikeringkan)
diperoleh dari penjual bunga R. Mergenthaler, Stuttgart, Jerman. Berry buckthorn laut beku
yang baru dalam (H. rhamnoides L.) dari Jerman dan Rumania disediakan oleh Bayernwald
Fru¨chteverwertung GmbH, Hengersberg, Jerman. Benih segar dari ginkgo (G. biloba L.),
varietas squash (butternut bush; Cu. Moschata), dan pahit (Ce. Orbiculatus Thunb.) Diperoleh
dari B&T World Seeds, Olonzac, Prancis (http: // www. b-and-t-world-seeds.com).

METODE
Sintesis Ester Zeaxanthin.

Zeaxanthin diisolasi dari paprika jeruk (Ca. annuum L.). Buah-buahan dipotong kecil-kecil,
sebagian dihomogenisasi dengan Ultra Turrax T 25 (Janke & Kunkel, Staufen, Jerman), dan
homogenat diekstraksi segera dengan minyak metanol / etil asetat / ringan (1: 1: 1 v / v / v)
sampai residu padat tidak berwarna. Ekstrak gabungan disabunkan dengan KOH metanol
(30%, b / v) dalam dietil eter semalaman. Zeaxanthin diisolasi menggunakan kromatografi
kolom terbuka pada silika gel. Untuk elusi, campuran minyak tanah ringan / aseton 94: 6 (v /
v) diterapkan. Konsentrasi larutan yang dihasilkan dihitung berdasarkan nilai 144,5 × 103 [L /
(mol‚cm)] dalam etanol pada 450 nm (39) dan massa molekul 568,9 g / mol. Selanjutnya,
zeaxanthin mono dan diester disintesis seperti yang dijelaskan sebelumnya (40). Singkatnya,
zeaxanthin (0,5-1 mg) dilarutkan dalam piridin (2 mL), dan masing-masing asil klorida (400
μL) ditambahkan secara bertahap selama 3 jam. Larutan reaksi dipindahkan ke corong pemisah,
dicuci dengan air dua kali, dikeringkan dengan natrium sulfat anhidrat, dan diuapkan sampai
kering. Residu dilarutkan kembali dalam etanol (5 mL) dan disimpan pada -20 ° C. Untuk
memisahkan semua trans-monoester dari diester dan juga cis-isomer, HPLC semipreparatif
pada bahan C30 digunakan dengan menggunakan campuran pelarut isokratik yang terdiri dari
metanol dan TBME. Untuk ester laurat dan miristat, campuran 60:40 (v / v) digunakan; untuk
ester palmitat dan stearat, 45:55 (v / v) diterapkan. Langsung setelah isolasi, fraksi gabungan
dari beberapa pemisahan diuapkan sampai kering di bawah cahaya redup, dilarutkan kembali
dalam etanol, dan disimpan pada -20 ° C.
Persiapan Sampel.
Ekstraksi Karotenoid.

Bagian dipotong menjadi potongan-potongan kecil dan dihomogenisasi selama 10-15 detik.
Sampel lampion China (buah-buahan, 3 g; sekam, 0,5 g), oranye dan paprika merah (masing-
masing 5 g), cabai Thailand oranye (2 g), buckthorn laut (10 g), wolfberry (2 g), kesemek (5)
g), biji jagung manis (10 g), dan bunga zucchini (10 g) diekstraksi tiga kali dengan campuran
metanol / etil asetat / minyak ringan (1: 1: 1 v / v / v; masing-masing 50 mL). Biji dari ginkgo,
butternut bush, dan bitterweet digiling dan diekstraksi juga (masing-masing 2 g). Supernatan
dikumpulkan dan disaring, dikeringkan dengan natrium sulfat anhidrat, dan diuapkan sampai
kering. Residu dilarutkan dalam TBME / metanol (1: 1, v / v; 10 mL) dan dikenai analisis MS
HPLC / DAD atau LC- (APCI).
Saponifikasi.
Untuk saponifikasi, suatu alikuot ekstrak kasar (5-10 mL) diuapkan sampai kering di bawah
tekanan tereduksi dan dilarutkan kembali dalam dietil eter (100 mL). Setelah penambahan
KOH metanol (30%, b / v; 5 mL), labu disimpan semalam. Campuran reaksi dipindahkan ke
corong pemisah, dicuci dengan air tiga kali, dikeringkan dengan natrium sulfat anhidrat,
diuapkan sampai kering di bawah tekanan tereduksi, dan dikenai analisis HPLC (volume akhir)
5-10 mL, sesuai dengan volume yang digunakan untuk saponifikasi ).
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (HPLC) dan LC (APCI) MS.
Aparatur dan Ketentuan.

HPLC terdiri dari sistem modular HP 1100 (Hewlett-Packard GmbH, Waldbronn, Jerman)
dengan detektor array dioda (DAD, 450 nm). Untuk pemisahan, kolom analitik YMC 250 ×
4,6 mm, 5 μm, YMC (YMC Eropa, Schermbeck, Jerman) dengan bahan fase terbalik C30
termasuk 10 × 4,0 mm i.d. precolumn digunakan dan disimpan pada suhu 35 ° C. LC- (APCI)
MS dilakukan pada sistem HPLC modular HP 1100, digabungkan ke Micromass (Manchester,
UK). VG platform II spektrometer massa quadrupole quadrupole II. Parameter MS dan fase
seluler telah dirinci (40). Spektrum massa ester zeaxanthin diperoleh dengan kisaran
pemindaian m / z 400-1200. Data diproses dengan perangkat lunak MassLynx 3.2.
Kalibrasi.

Kalibrasi zeaxanthin dilakukan pada kisaran 0,3-15 mg / L menggunakan zeaxanthin yang

diperoleh dari lada jeruk (lihat di atas). Kurva kalibrasi dibuat dengan memplot area puncak
(DAD, 450 nm) versus konsentrasi. Untuk perhitungan ester zeaxanthin, grafik yang sama
diterapkan, menentukan konsentrasi zeaxanthin dalam mikromol per liter. Konsentrasi ester
zeaxanthin dihitung sesuai dengan massa molekul masing-masing. Batas Deteksi Zeaxanthin
Diesters [LC- (APCI) MS]. Untuk memperkirakan batas deteksi diester zeaxanthin, zeaxanthin
dipalmitate digunakan sebagai senyawa model. Atas dasar intensitas ion fragmen pada m / z
1045,9 ([M + H] +), rasio signal-to-noise 3: 1, dan volume injeksi 20 μL, batas deteksi
diperkirakan mencapai menjadi 0,4 ug / mL.

HASIL DAN DISKUSI

Metode Performa. Untuk mengevaluasi penerapan metode HPLC untuk pemisahan ester
zeaxanthin, delapan monoester zeaxanthin dan diester homogen (C12, C14, C16, dan C18; 1-
8) disintesis dan dipisahkan pada kolom C30. Gambar 1 menggambarkan struktur senyawa ini.
Gambar 2 menunjukkan kromatogram yang dihasilkan dan menunjukkan penerapan metode
untuk analisis ester zeaxanthin. Analisis berganda dan penambahan senyawa standar yang
disintesis membuktikan stabilitas xantofil ester selama ekstraksi. Puncak kecil berhubungan
dengan isomer isomer, tidak lengkap

dihapus oleh HPLC semipreparatif. Untuk identifikasi tegas, campuran standar dan semua
ekstrak yang diperoleh dari tanaman dianalisis menggunakan LC- (APCI) MS dalam mode
positif. Dalam setiap kasus, ion kuasimolekul ([M + H] +) jelas terdeteksi. Jalur fragmentasi
didominasi oleh hilangnya satu asam lemak ([M + H - FA] +) atau dua ([M + H - 2FA] +).
Dalam kasus zeaxanthin monoester, ini mengarah pada pembentukan m / z 551,4, sedangkan
diester membentuk m / z 533,4, "tulang punggung" zeaxanthin. Spektrum massa teladan yang
diperoleh dari zeaxanthin dipalmitate (7) diberikan pada Gambar 3, dan kumpulan data yang
digunakan untuk identifikasi 1-8 disajikan pada Tabel 1. Jalur fragmentasi yang dijelaskan
tidak hanya memungkinkan untuk mengidentifikasi ester homogen tetapi juga memungkinkan
untuk penugasan ester campuran, yang juga terjadi dalam ekstrak tanaman dianalisis. Dengan
demikian, semua ester karotenoid dijelaskan