(41.1.

30) Asam Lemak dalam Minyak Ikan Enkapsulasi dan Minyak Ikan
Metil dan Etil Ester (Metode GC)

A. Prinsip
Metil ester dianalis dengan GC (Gas Chromatography). Instrument
GC dilengkapi dengan column bersilika yang mempunyai fase cair
poliglikol. Metode ini dapat menentukan 24 jenis asam lemak EPA dan
DHA.
B. Alat dan Bahan
 Gas chromatograph
 GC column dengan ukuran silica 30 mm x 0,25 mm
 Penangas air dengan temperature stabil (100⁰C)
 Tabung ulir 16x125 mm
 Botol vial dengan tutup
 Timbangan analitik (±0,0001 g)
 Sumber nitrogen
 Labu volumetrik 25 dan 100 ml, pipet volumetrik 1 dan 2 ml, dan pipet
pasteur
C. Reagen
 BF3 12% dalam methanol 2 ml
 Metil dan etil ester yang kemurniannya ditentukan oleh analisis TLC
dan GC
 Sodium hidroksida, methanol, isooktan, dan sodium klorida
D. Persiapan larutan
 Natrium hidroksida alkoholik. Dibuat dengan melarutkan 2 gram
NaOH dan metanol dan diencerkan dalam 100 ml metanol
 Natrium klorida (larutan jenuh). Dibuat dengan mencampurkan 36
gram NaCl dalam 100 ml H2O
E. Persiapan standarisasi
 Penimbang 25 mg dari 23:0 metil etil ester standar internal ke dalam
pipet volumetric 25 ml
 Pengenceran dengan isooktan
  Pengambilan sampel 1 ml dan pemasukan ke dalam tabung ulir lalu
tutup
 Evaporasi
F. Persiapan sampel dan analisis
 Minyak (semua minyak diaplikasikan pada material enkapsulasi.
Termasuk pada asam lemak nonesterifikasi, dengan pengecualian pada
etil ester)
Prosedur kerja :
- Penimbangan 25 mg minyak yang mengandung metil ester IS
- Penambahan 1,5 ml 0,5 M NaOH metanolik
- Pengadukan dan pemanasan pada 100⁰C
- Pendinginan dan penambahan 2 ml BF3 dalam campuran metanol
blanket dengan nitrogen
- Penutupan
- Pencampuran dan pemanasan selama 30 menit pada 100⁰C
- Pendinginan sampai 30-40⁰C
- Penambahan 1 ml isooktan, blanket dengan N2
- Penutupan dan pengadukan dengan kencang selama 30 detik ketika
masih panas
- Penambahan 5 ml larutan NaCl jenuh, blanket dengan N2
- Penutupan dan pengadukan
- Pendinginan dalam suhu ruang
- Pemisahan isooktan dari fase cairan yang bawah pada gelas piala,
blanket dengan N2 lalu tutup
- Ektraksi fase cair dengan 1 ml isooktan
- Injeksi 1-2 µL ke dalam system GC
 Metil atau etil ester s
- Penimbangan ≤ 15 mg (±0,1 mg) metil atau etil ester ke dalam
tabung reaksi yang mengandung ester IS
- Penambahan 1 ml isooktan, blanket dengan N2
- Pencampuran dan penutupan
- Injeksi 1-2 µL ke dalam system GC
G. Perhitungan
 % asam lemak = [ Ax/(AT-AIS)] x 100
Ax : jumlah area dari metil atau etil ester X
AT : total area untuk kromatogram
AIS : jumlah area dari IS
 Berat EPA dan DHA dalam minyak
𝐴𝑥 .𝑊(𝐼𝑆).𝐶𝐹𝑥
EPA atau DHA (mg/g) = 𝑋 100
𝐴(𝐼𝑆).𝑊𝑠.1,08

1,08 : faktor yang diperlukan untuk menyatakan hasil mg asam

lemak/gram minyak (bukan sebagai etil ester)

(41.1.31) Asam Erucic dalam Minyak dan Lemak

(Metode Thin Layer dan Gas Kromatografi)

A. Prinsip
Asam lemak dikonversi menjadi metil ester, kemudian dipisahkan
dengan suhu rendah pada kromatografi thin layer (TLC) dan dikuantisasi
dengan kromatografi gas.
B. Peralatan
 Gelas piala 50 ml, labu minyak 100 dan 500 ml, pointed bottom glass
tubes
 Alat distilasi
 Kolom (200 x 10 mm) untuk silica gel
 Oven
 Aplikator TLC
 Plat TLC (20 x 20 cm)
 Tank TLC dengan tutup
 Unit pembekuan dalam TLC (-20⁰C- (-25⁰C)
 Lampu UV
 Gas kromatografi
C. Reagen
 n-Heksan
 Toluen
  Metanol 50% (v/v)
 Etil eter bebas dari peroksida dan residu
 Pelarut TLC (Toluen-n-Heksan 90+10 v/v)
 Larutan metil erucate standar (5 mg/ml). dibuat dengan 50 mg metil
erucate dalam 3-4 ml heksan dan encerkan menjadi 10 ml dengan
heksan
 Larutan silver nitrate (200 g/l) dibuat dengan melarutkan 24 gram
AgNO3 dalam H2O dan encerkan sampai 120 ml dengan H2O
 Larutan metil tetrakosanoat (0,25 mg/ml) dibuat dengan
mencampurkan 25 mg metil tetrakosanoat dalam 3-4 ml heksan dan
encerkan sampai 100 ml dengan heksan
 Reagen spray TLC (0,5 gram 2,7’-dichlorofluorescein/L) dibuat
dengan melarutkan 50 gram 2,7’-dichlorofluorescein dalam 100 ml
50% larutan metil alkohol dengan pemanasan dan pengadukan
D. Persiapan untuk metil ester asam lemak
Mengambil sampel uji representative sebanyak 400 mg minyak atau
lemak dan menyiapkan larutan metil ester asam lemak dalam heksana (20-
50 mg/ml).
E. Thin Layer Chromatogragraphy
 Persiapan plat TLC : tempatkan 60 gram serbuk silica pada labu
minyak dengan menambahkan 120 ml larutan AgNO3 , kemudian
dilakukan pengocokan 1 menit sampai homogen. Simpan bubur
silika dalam plat dengan ketebalan 0,5 mm, lakukan pengeringan
selama 30 menit dalam keadaan gelap kemudian dikeringkan dalam
100 ± 2 ° C oven selama 2,5 jam.
 Pengaplikasian metil ester : menggunakan aplikator untuk
menambahkan 50 µL larutan metil ester dengan cara
menggoreskannya sepanjang 50 mm pada bagian kiri plat (40 mm
dari samping dan 10 mm dari bawah). Kemudian lakukan juga ada
100 µL larutan dengan volume yang sama dngan larutan metil ester
dan larutan standar metil erucat di sisi kanan plat. Aplikasikan juga
50 µL larutan standar metil erucat pada bagian kiri plat yang lain.
  Pengembangan plat : penuangan pelarut TLC ke dalam kolom
sekitar 5 mm dan kolom ditutup. Simpan dalam penyimpanan beku
-22⁰C. Setelah 2 jam simpan plat dengan hati-hati dalam kolom dan
biaarkan pelarut naik ½ sampai 2/3 dari ketinggian plat. Melepaskan
plat memungkinkan pelarut mengalir keluar dan menguapkan sisa
pelarut dari plat dengan aliran N2.. Ganti plat dalam kolom dan
biarkan pelarut naik ke atas plat. Kemudian lakukan cara
sebelumnya. Setelah itu semprot plat dengan reagen penyemprot dan
lihat plat di bawah sinar UV dan temukan garis yang mengandung
metil erucat.
 Pemisahan fraksi metil ester : memisahkan bagian yang
mengandung metil erucate yang berasal dari bagian uji (fraksi 1).
Lalu hapus lapisan yang mengandung sisa asam lemak dari bagian
uji yang terletak di atas dan di bawah bagian metil erucate ke dalam
gelas kimia yang terpisah (fraksi 2). Kemudian tuang 1 ml larutan
standar internal metil tetracosanoate dan 10 ml etil eter pada gelas
kimia kemudian dilakukan pengadukan dan penuangan ke dalam
kolom terpisah yang masing-masing mengandung 1 gram silika gel.
Setelah itu lakukan pengekstrakan metil ester menggunakan 10 ml
etil eter. Lalu pengumpulan filtrat dalam labu minyak 100 ml dan
dilakukan penguapan pelarut.
F. Gas Kromatografi
(Lihat prosedur 41.1.29)
Prosedur tambahan penerapan gas kromatografi dapat dilakukan dengan
cara :
 Penambahan 1-2 µL heksan metil ester yang diperoleh dari fraksi 1
yang mengandung metil erucate yang berasal dari sampel dan fraksi
2 yang mengandung sisa ester metil asam lemak. Pengukuran ukuran
area puncak dari kromatogram dengan integrator elektronik.
G. Perhitungan
Untuk menghitung kadar asam erucat dari pengujian dapat dinyatakan
sebagai (%) metil ester dari total asam ester metil yang terdapat dalam
sampel
𝐸
𝐴𝑠𝑎𝑚 𝑒𝑟𝑢𝑐𝑖𝑐(%) = 𝑥 100
𝑚1 𝑚2
𝐼1 𝑥 [( 𝐼1 ) + ( 𝐼2 )

E = Puncak metil erucate berasal dari fraksi 1 dan 2

I1 dan I2 = Puncak standar internal dari fraksi 1 dan 2
Jika area puncak ditentukan dalam % maka M1 dan M2 dihitung dengan
sebagai berikut
M1 = 100 – I1
M2 = 100 – I2
Perhitungan tersebut mengabaikan asam tetrakosanoat. Jika asam
tetrakosanoat diperhitungkan dalam sampel (I2) maka dapat dihitung
dengan
I2 = I1-I3
Dimana
𝑇𝑥𝑃
𝐼3
𝑃1
I3 = bagian dari I2 yang mewakili metil tetracosanoate
P = luas puncak metil palmitat dari kromatogram fraksi 2
T dan P1 = puncak metil tetrakosanoat dan metil palmitat

H. Presisi
 Repeabilitas
 Reproduksibilitas