Kromatografi Lapis Tipis Tujuan : Setelah melakukan praktikum diharapkan mahasiswa dapat ‘© Memahami prinsip pemisahan senyawa aktifdengan kromatografi lapis tipis * Memahami parameter-parameter penting dalam metode pemisahan dengan kromatografi lapis tipis Pendahuluan Kurkumin merupakan zat wama kuning yang berasal dari tanaman kunyit (Cureumae domesticae Val.) _Kurkumin (diftruloilmetan) ~—memiliki_turunan/derivat —berupa demetoksikurkumin dan bis-demetoksikurkumin, Ketiga senyawa ini disebut kurkuminoid secara keseluruhan. Dalam kurkuminoid, kandungan kurkumin sebesar 77%, demetoksikurkumin 17% dan bisdemetoksikurkumin 3% (Anggarwal, 1995). Sifit kepolaran dari yang paling polar sampai yang non polar adalah sebagai berikut kurkumin, demetoksikurkumin, kemudian bis- demetoksikurkumin (Aggarwal, et.al., 2006). 2 0 ‘cho! Saar er aig Och, Ho ~ on Kurkumin (1) 2 9 cH wees OL HoT Demetoksikurkumin (2) Bisdemetoksikurkumin (3) oH Gambar 1 Struktur kurkumin Sifit-sifat kurkumin adalah memiliki berat molekul = 368,37 g/mol (C =68,47 %; H= 5.47%; O= 26,06 %), berwama kuning muda, titik lebur 183 °C dan larut dalam pelarut organik (metanol, etanol atau benzena), asam asetat glasial serta tidak larut dalam air.Kromatografi lapis tipis adalah suatu cara pemisahan yang berdasarkan pada pembagian campuran senyawa dalam dua fise, dimana fase gerak bergerak tethadap fise diam yang berupa suatu bidang datar. Teknik kromatograi umumnya membutuhkan zat terlarut terdistribusi di antara dua ise, satu diantaranya diam (Lise diam), yang lainya bergerak (fise gerak). Fase gerak membawa zat terlarut melalui media, hingga terpisah dari zat terlarut Jainnya, yang terelusi lebih awal atau lebih akhir, Umumnya zat terlarut dibawa melalui media pemisah oleh aliran suatu pdarut berbentuk cairan atau gas yang disebut cluen. Fase diam dapat menjadi zat penjerap, seperti halnya penjerap alumina yang diaktifkan, silika gel dan resin penukar ion. Komposisi fise gerak yang digunakan dapat mempengaruhi variasi retensi analit untuk pemisahan yang optimum. Sehingga fise gerak dapat disesuaikan komposisinya agar diperoleh kepolaran relatif yang mirip dengan sampel untuk memperolch pemisahan yang optimum. Kepolaran pelarut merupakan ukuran Kekuatan pelarut untuk mengelusi suatu senyawa. Kepolaran pelarut dinyatakan dalam bentuk indeks polaritas (IP). Pengurangan kepolaran pelarut dapat dilakukan dengan penambahan Heksana p.a, sedangkan peningkatan kepolaran pelaurt dapat dilakukan dengan penambahan air atau asam asetat glasial p.a schingga mencapai nilai Rf dalam range optimum antara 0.2-0.8. Penentuan nilai Rfsampel sebagai berikut : Rf = Jarak yang ditempuh oleh zat Jarak yang ditempuh oleh pelarut Bahan : © Sampel (jamu tradisional dan obat herbal terstandar (OHT)) Pelarut 1 (Klorofirm : Asam atetat glasial = 9.5 : 0.5) « Pelarut 2(Klorofirm : Heksana : Asam asetat glasial = 8.5 : 0.5: 1) © Etanol pa © Chamber dan penutup Plat kromatografi lapis tipis (silica) © Labu takar 25 ml © Tabung effendort «© Pipetmikro Metode : Pembuatan Fase Gerak Campuran fise gerak yang digunakan dibuat dalam perbandingan sebagai berikut : Komposisi Fase Klorofrn (ml) Treksana (milly Asam asetat glasial Gerak (ml) Komposi 5 5 05 Komposisi 8.5 05 T Setiap komposisi Bse gorak tersebut dibuat untuk 2 Kall ulangan.Pembuatan Pelarut Sebanyak 25 ml Metanol p.a ditambahkan asam astetat glasial dengan perbandingan (9 : 1). hingga mencapai nilai pH 4.0. Pembuatan Sampel OHT. Scbanyak 15 ml sampel OHT cair dihomogenkan dengan pengadukan menggunakan magnetic stirrer selama 15 menit. Lalu, dimasukkan ke dalam labu takar 25 ml kemudian diencerkan dengan methanol p.a pH 4.0 hingga batas tera, diperoleh Jarutan sampel Konsentrasi (v/v) 60% Larutan tersebut kemudian disari untuk penarikan senyawa kimia kurkumin dalam sampel menggunakan ultrasonikator selama 15 menit Jamu Tradisional, Sebanyak 5 mg sampel jamu tradisional dilarutkan dalam 10 ml methanol p-a pH 4.0, Larutan tersebut lalu dimasukkan dalam labu takar 25 ml dan ditambahkan methanol p.a pH 4.0 hingga batas tera, diperoleh sampel dengan konsentrasi 200 ppm Larutan sampel lalu disari menggunakan ultrasonikator selama 15 meni, Pembuatan Larutan Standar Kurkumin Sebanyak 25 mg standar kurkumin dilarutkan dalam 10 ml methanol p.a pH 4.0 lalu dimasukkan dalam labu takar 25 ml ditambahkan methanol p.a pH 4.0 hingga batas tera, diperoleh larutan stok 1000 ppm. Lalu dilakukan pengenceran dengan methanol p.apHl 4.0 untuk memperoleh larutan standar kurkumin dengan konsentrasi 500 ppm dan 200 ppm pada volume total 2 ml. Pemisahan dengan KLT Bejana (chamber) KLT dijenuhkan terlebih dahulu dengan fise gerak. Setelah jenuh, lempeng KLT silica gel disiapkan dengan pembuata garis start dan finish, pengembangan dilakukan setinggi 10 em, Lalu, sampel dan larutan standar sebanyak +/-3 iL ditotolkan pada garis start, Setelah selesai proses pemisahan, segera keluarkan lempeng KLT silica gel. keringkan dan secepatnya diamati di bawah sinar UV. Hitung nilai Rfnya.