CD9 monoclonal antibody-conjugated PEGylated liposomes for targeted delivery of

rapamycin in the treatment of cellular senescence

Penuaan sel disebabkan oleh pertumbuhan sel yang ireversibel, melibatkan perubahan
morfologi, peningkatan regulasi aktivitas senescence-associated-β-galactosidase (SA-β-gal),
perubahan regulasi siklus sel, dan fosforilasi p53, p21, dan p16. Berdasarkan sinyal pengaktifannya,
penuaan selular dapat dibagi menjadi penuaan replikatif dan penuaan dini akibat stres
(SIPS).Penuaan replikatif terkait dengan pemendekan atau kehilangan telomere, fungsi telomere,
SIPS dapat terjadi sebagai respons terhadap berbagai tekanan, termasuk stress oksidatif, kerusakan
DNA, atau kerusakan akibat obat kemoterapi.
Doxorubicin banyak digunakan dalam pengobatan berbagai kanker. Beberapa penelitian
telah difokuskan pada mekanisme molekuler doxorubicin-induced senescence terkait dengan p53
dan p16- jalur pRb, yang menghasilkan senescence-associated secretory phenotypes (SASP); ini
ditandai dengan peningkatan aktivitas SA-β-gal dan ekspresi cdk-1, menurunkan aktivitas
telomerase, dan akumulasi pada tahap G2 / M
CD9 termasuk sel glikoprotein, kelompok tetraspanins dengan empat domain
transmembran, yang mengatur berbagai aktivitas seluler termasuk migrasi sel, proliferasi, dan
adhesi. Overexpression dari CD9 telah dikaitkan dengan perkembangan jaringan kanker. Interaksi
CD9 dan mortalin, CD9(protein 75 kDa HSPA9B), telah dikaitkan dengan penuaan sel dan mitosis
pada kanker prostat. Selain itu, ekspresi CD9 diregulasi di sel-sel endotel vaskular dan sel-sel
fibroblast. Temuan ini mempromosikan aplikasi potensial dari CD9 sebagai biomarker untuk sel
usia lanjut, serta target terapeutik pendekatan anti-penuaan.
Aktivasi mTOR, yang memediasi beberapa proses seluler, termasuk proliferasi sel dan
penangkapan siklus sel, memainkan peran penting dalam membentuk fenotipe senescent.
Penghambatan mTOR oleh rapamycin akan memperlambat penuaan sel dengan memperbaiki
proliferasi sel dan pengurangan aktivitas SA-β-gal. Liposom telah terbukti menjadi obat yang
sangat baik untuk obat-obatan hidrofobik seperti rapamycin. Terapi liposom dapat ditingkatkan oleh
PEGylation untuk memperpanjang waktu di sirkulasi darah, atau penggabungan dengan cholesteryl
hemisuccinate (CHEMS), sebuah acidic cholesterol ester, untuk menginduksi obat yang
pelepasanya tergantung pH. Karena kelebihan ini liposom telah digunakan dalam pengobatan
banyak penyakit untuk melindungi terhadap penuaan sel
Dalam studi ini, kami mengembangkan pengiriman baru yang ditargetkan sistem inhibitor
mTOR untuk mengatasi penuaan dini. Antibodi monoklonal CD9 (CD9mAb) digunakan sebagai
ligan untuk menargetkan sel-sel tua dan dihubungkan dengan permukaan liposom PEGylated (LR-
CD9mAb). Sifat fisik liposom PEGylated meliputi distribusi ukuran partikel, morfologi, profil
pelepasan obat, dan efikasi konjugasi antibodi.
 Rapamycin-loaded PEGylated liposomes (LR) disiapkan dengan menggunakan metode ekstrusi .
DPPC, VitE-PEG5000-Mal, CHEMS, kolesterol (70: 2: 5: 20 rasio molar), dan rapamycin
dilarutkan dalam 5 ml campuran diklorometana / metanol (4: 1). Setelah mengeluarkan pelarut
dengan menggunakan rotary evaporasi, hidrasi film lipid dengan phosphatebuffered saline (PBS).
Terbentuk liposom yang kemudian diekstrusi melalui membran 100 nm untuk membentuk
rapamycin-loaded Liposom PEGylated
Antibodi CD9 dimodifikasi dengan menambahkan gugus thiol yang bereaksi dengan
kelompok maleimide VitE-PEG5000-Mal. MAb dengan gugus thiol ditambahkan dengan 2-
iminothiolane hydrochloride dan pencampuran selama 30 menit pada 25 ° C, diikuti oleh pemisahan
menggunakan kolom Sephadex G-25 untuk menghapus reaktan berlebih. Selanjutnya,Campurkan
mAb ke dalam formulasi nanopartikulat pada rasio molar 1:50 dibandingkan dengan VitE-
PEG5000- Mal, diikuti dengan pengadukan pada 4 ° C selama 12 jam. LR-CD9mAb nanopartikel
(gambar 1) dikumpulkan dan dipekatkan menggunakan Vivaspin 6 kolom (Sartorius, Goettingen,
Jerman) (4000 rpm / 15 mnt). Efisiensi konjugasi ditentukan oleh assay protein albumin serum
bovine dan SDS-PAGE
1. Ukuran pasrtikel dan zeta potensial
Ukuran partikel, distribusi ukuran (PDI), dan ZP LR dan LRCD9mAb dievaluasi oleh
jaringan hamburan laser dinamis oleh menggunakan Zetasizer pada 25 ° C.

2. Kakarakteristik morfologi
Mikroskop elektron transmisi (TEM) digunakan untuk mengkarakterisasi morfologi
nanopartikel pada tegangan 100 kV. Sampel disiapkan dengan menyebarkan setetes demi setetes
formulasi nanopartikel, diwarnai dengan 2% larutan asam fosfotungtat, pada TEM
3. Drug-loading capacity (LC)
Jumlah obat yang terperangkap dalam nanopartikel itu ditentukan dengan menyaring
formulasi melalui Amicon tabung sentrifugal.efisiensi enkapsulasi (EE) dan LC dihitung
menggunakan persamaan berikut (W adalah bobot dalam mg):
 Konsentrasi rapamycin sebagai obat bebas dapat ditentukan dengan (HPLC)
menggunakan kolom C18 (150 × 4,6 mm, 5 μm, GL).Fase geraknya terdiri dari amonium asetat
(10 mM) dan asetonitril (25:75), laju alir 1 ml/min dan panjang gelombang 278 nm
4. Pelepasa obat secara in-vitro
Pelepasan secara in vitro rapamycin pada LR-CD9mAb diukur pada pH 7,4 (PBS) dan
pH 5.0 (saline buffered acetate, ABS). Selain itu, media dilengkapi dengan 5% serum bovin
untuk membandingkan perbedaan profil pelepasan obat dalam media yang mengandung serum
dan bebas serum.1 ml LR-CD9mAb ditambahkan ke dalam kantong dialisis (MWCO 3,5 kDa),
kemudian disimpan dalam media 35 ml pada 37 ° C dan dikocok pada 100. Pada berbagai
interval waktu, 0,5 ml Aliquot diambil dan diganti dengan yang baru. kemudian analisis
menggunakan HPLC.
5. Cell culture
HDFs ditanam di DMEM dilengkapi dengan 10% serum bovine dan 1% penicillin /
streptomisin.
6. Senescence induction in HDFs
Penuaan sel prematur diinduksi dengan 250 nm doxorubicin selama 4 jam.
7. SA-β-gal assay
Sel diinkubasi pada 37 ° C dan ditambahkan dengan formulasi nanopartikel. Setelah
mencuci dengan PBS, sel-sel dibilas dengan 4% paraformaldehyde dan kemudian diwarnai
dengan larutan X-gal,inkubasi selama 16 jam. Pengembangan warna biru terdeteksi di bawah
mikroskop cahaya.