Elektroforesis protein serum dalam keadaan sehat dan sehat Badak putih selatan yang terluka

(Ceratotherium simum simum)

Abstrak

Investigasi fraksi globulin dengan elektroforesis protein serum (SPE) adalah langkah pertama

menuju evaluasi proteome di badak putih selatan (Ceratotherium simum simum). Selanjutnya,

identifikasi perubahan globulin pada hewan dengan perburuan dan cedera lain dapat memandu

penemuan biomarker peradangan yang berpotensi bermanfaat. Tujuan dari penelitian ini

adalah untuk mengembangkan interval referensi untuk gel agarosa SPE di badak putih yang

sehat dan untuk membandingkan hasil elektroforesis protein serum ini dengan yang dari hewan

dengan trauma jaringan. Interval referensi untuk protein serum total dan elektroforesis gel

agarosa fraksi albumin dan globulin dihasilkan dengan menggunakan sampel serum dari 49

badak putih dewasa freeranging sehat. Sistem gerbang standar dengan identifikasi protein

spesifik dengan spektrometri massa dibantu dalam identifikasi fraksi. Enam fraksi globulin

diidentifikasi: α1a, α1b, α2, β1, β2 dan γ. Interval referensi dihasilkan secara total protein serum

(76-111 g / L), albumin (10-27 g / L) dan fraksi globulin (α1a: 1,6–3,2 g / L; α1b: 1,7-3,6 g / L; α2:

16.1–26.6 g / L; β1: 6.6–18.2 g / L; β2: 11,8–30,4 g / L; γ: 10.4–23.1 g / L; rasio albumin: globulin:

0,12-0,39). Hasilnya dibandingkan dengan 30 hewan dengan berbagai derajat dan kronisitas

trauma jaringan. Hewan yang terluka memiliki konsentrasi total protein serum, albumin,

globulin total, globulin α dan β1 yang lebih rendah, persentase yang lebih rendah dari globulin

α2 dan β1, dan persentase β2 dan ul globulin yang lebih tinggi. Protein ini berubah mirip

dengan yang terlihat pada pasien manusia dengan luka daripada fase akut klasik atau respons

inflamasi kronis.
Pengantar

Badak putih selatan, Ceratotherium simum simum (selanjutnya disebut sebagai badak

putih), banyak ditangkap di Afrika selatan, dengan lebih dari 4.000 hewan terbunuh di Afrika

Selatan antara 2013 dan akhir 2016 [1]. Angka-angka ini tidak termasuk hewan-hewan itu yang

selamat dari upaya perburuan dan selanjutnya dirawat oleh dokter hewan. Sebagai contoh, 54

badak yang terluka dirawat oleh dokter hewan Taman Nasional Afrika Selatan dari 2014-2016,

31 di antaranya akhirnya mengalami eutanasia karena cedera mereka [2]. Setidaknya 38 anak

badak yatim piatu dirawat di Afrika Selatan pada akhir 2016, banyak di antaranya diperlukan

perawatan hewan selama proses rehabilitasi mereka [1].

Patologi klinis memainkan peran penting dalam diagnosis dan pemantauan penyakit

hewan, dan interval referensi kimia klinis untuk badak putih untuk berbagai analisis metode

baru-baru ini diterbitkan [3, 4]. Yang perlu diperhatikan dalam penelitian baru-baru ini, serta

studi yang lebih tua, adalah konsentrasi tinggi protein total serum atau plasma (terutama

globulin) dan rendah konsentrasi albumin pada spesies ini [4]. Berarti konsentrasi dilaporkan

untuk total serum atau rentang protein plasma dari 76-101 g / L, albumin 25–28 g / L dan

globulin dari 66–77 g / L

[3–8]. Sebagai perbandingan, sarana atau median dilaporkan untuk badak hitam, Diceros

bicornis, adalah 81-95 g / L untuk protein serum total (TSP), 35-36 g / L untuk albumin dan 46-

54 g / L untuk globulin [5, 9, 10]. Nilai median untuk TSP 81 g / L, albumin 39 g / L dan globulin

miliki 39 g / L telah diterbitkan untuk badak Sumatera (Dicerorhinus sumatrensis) [11].

Serum protein elektroforesis (SPE) dianggap sebagai standar referensi untuk

penentuan albumin dan globulin [12]. Globulin terdiri dari ratusan protein berbeda, yang

bermigrasi ke fraksi yang didefinisikan, secara konvensional dikelompokkan sebagai α-, β-, dan
γ-globulin. Itu Kelompok α-globulin mengandung protein fase akut positif, β-globulin termasuk

transferrin, faktor komplemen, lipoprotein dan beberapa imunoglobulin. Mayoritas

imunoglobulin telah dijelaskan bermigrasi ke fraksi dalam banyak spesies, termasuk

Perissodactyl lain seperti kuda [13-16]. Variasi dalam protein serum dengan konsentrasi di atas

0,5 g / L dapat mengakibatkan perubahan pada pola elektroforesis dan konsentrasi berbagai

fraksi. Penurunan albumin dan peningkatan α2-globulin, α2-macroglobulin dan haptoglobin,

terjadi secara khas pada peradangan akut sebagai bagian dari respon fase akut, sementara

peningkatan poliklonal dalam imunoglobulin (fraksi β2 dan)) terjadi dengan peradangan kronis

[16, 17]. Badak putih dengan trauma jaringan yang disebabkan oleh luka tembak atau

perkelahian mungkin mempertahankan kerusakan pada struktur jaringan lunak dan tulang.

Hewan-hewan ini tentu memiliki keduanya peradangan akut atau kronis, lokal atau sistemik.

Luka dikaitkan dengan keadaan katabolik, dan permintaan protein dapat meningkat 250% pada

pasien luka manusia sebagai protein diperlukan dalam setiap fase penyembuhan luka [18].

Perbedaan konsentrasi protein serum dan komposisi antara badak putih yang terluka dan sehat

dapat didiagnosis dan bermanfaat secara prognostik.

Empat penelitian sebelumnya, dilakukan antara 1976 dan 1994, melaporkan hasil SPE

membran selulosa asetat pada badak putih yang sehat [6-8, 19]. Hanya satu dari penelitian ini

yang menjelaskan dan menampilkan electrophoretogram [7]. Membran selulosa asetat telah

digantikan oleh gel agarosa untuk SPE; pola migrasi tidak identik dengan dua matriks ini, dan

informasi untuk gel agarose SPE untuk badak putih kurang [20]. Selain itu, perubahan SPE belum

telah diselidiki pada badak putih yang terluka.

Tujuan pertama dari penelitian ini adalah untuk menghasilkan interval referensi untuk

TSP dan agarosa gel Fraksi SPE pada badak putih yang sehat. Tujuan kedua adalah
membandingkan nilai protein dari badak putih dengan trauma jaringan ke kelompok sehat

untuk mengidentifikasi secara klinis perubahan yang relevan.

Material dan Metode

Mempelajari populasi dan sampel

Kelompok sampel referensi terdiri dari 50 badak putih dewasa yang bebas jantan dan

jantan dari Taman Nasional Kruger di Afrika Selatan (23˚49ʹ60 ʺS, 31˚30ʹ0 ʺE). Hewan-hewan ini

diamobilisasi terutama untuk keperluan manajemen atau translokasi. Imobilisasi dilakukan

menurut Komite Penggunaan dan Perawatan Hewan Taman Nasional Afrika Selatan Prosedur

Operasi Standar yang disetujui untuk Pengambilan, Pengangkutan dan Pemeliharaan di

Indonesia Memegang Fasilitas Satwa Liar. Protokol imobilisasi yang digunakan untuk hewan-

hewan ini telah sepenuhnya dijelaskan di tempat lain [4]. Pengambilan sampel darah dilakukan

dalam waktu 15 menit setelah imobilisasi. Darah dikumpulkan langsung ke dalam tabung

pengumpul vakum serum (Greiner Bio-One, Lasec S.A., PTY LTD Cape Town, 7405, Afrika

Selatan) dari vena auricular. Sampel ditempatkan tegak membeku dalam tas pendingin dengan

balok es dan diproses dalam waktu tiga jam setelah pengumpulan. Tabung sampel disentrifugasi

pada 1300 g selama 10 menit, dan serum dicampurkan ke dalam cryotube (Greiner Bio-One,

Lasec S.A., PTY LTD Cape Town, 7405, Afrika Selatan) dan dibekukan selama 22 bulan di -80˚C.

Pemeriksaan fisik dilakukan pada hewan yang tidak bergerak, dan yang menunjukkan

tidak kelainan dianggap sehat. Usia diperkirakan dari tanduk dan ukuran tubuh dan hewan

dikategorikan sebagai anak sapi (<2,5 tahun), subadult (2,5-7,0 tahun) dan dewasa (> 7,0)

tahun) [3, 21]. Badak putih diperkirakan berumur kurang dari tujuh tahun atau menunjukkan

peluru atau luka dehorning atau kelainan lain dikeluarkan dari sampel referensi kelompok.

Sampel serum dari 30 badak putih dengan trauma jaringan juga dianalisis. Terluka
hewan dibagi lagi menjadi hewan yang memiliki akut (durasi cedera dua hari) atau cedera

kronis, ketika informasi ini tersedia dalam catatan klinis. Dua puluh tiga di antaranya hewan,

termasuk dua anak sapi, berasal dari Taman Nasional Kruger, dan sampel dikumpulkan

menggunakan protokol yang dijelaskan di atas. Sampel-sampel ini dibekukan pada -80˚C selama

6–27 bulan. Empat sampel diterima oleh laboratorium patologi klinis Rumah Sakit Akademik

Hewan Onderstepoort (OVAH) sebagai bagian dari proyek penelitian lain yang menyelidiki

cedera. badak putih. Protokol imobilisasi dan kondisi pengambilan sampel untuk keempat

individu ini tidak diketahui. Sampel dari tiga anak badak putih yang dirawat sebagai pasien rawat

inap di OVAH juga dimasukkan. Sampel-sampel ini dikumpulkan tanpa imobilisasi dari vena

auricular. Untuk tujuh orang terakhir ini, serum diterima oleh laboratorium dalam tabung vakum

serum yang dibiarkan membeku selama 30 menit dan disentrifugasi pada 2100 g selama 8

menit. Serum itu dibiasakan dan dibekukan pada -20˚C selama 6-8 bulan untuk anak sapi, dan

pada -80˚C selama 28-36 bulan untuk empat orang dewasa lainnya.

Sampel yang berasal dari Taman Nasional Kruger kemudian diangkut beku di atas es ke

laboratorium patologi klinis di OVAH dan disimpan lagi pada -80˚C. Sebagian besar sampel dari

hewan yang terluka juga digunakan untuk proyek lain dan karenanya menjadi sasaran

setidaknya satu siklus tambahan pencairan-pencairan-pencairan. Sampel dikeluarkan jika

hemolisis kotor, lipemia atau icterus hadir.

Sebelum analisis, kumpulan sampel dibiarkan mencair pada suhu kamar, dicampur dan

disentrifugasi pada 2100 g selama 8 menit.

Analisis sampel
 Total protein serum. TSP diukur dengan reaksi biuret pada basah otomatis penganalisa

kimia, Cobas Integra 400 Plus (Produk Roche (Pty) Ltd, Basel, Swiss). Pemeliharaan alat analisis

dilakukan sesuai dengan pedoman pabrik dan kinerja pengujian dipantau oleh kontrol kualitas

internal harian dan kontrol kualitas eksternal bulanan sesuai dengan protokol laboratorium.

Elektroforesis. Elektroforesis dilakukan pada agarosa gel split beta menggunakan

platform Interlab Pretty otomatis (Interlab S.r.L., Roma, Italia) menurut produsennya. instruksi.

Volume sampel yang dibutuhkan adalah 30 μL dengan tempat untuk 13 sampel pada setiap gel.

Tegangan 400 V diterapkan selama delapan menit, diikuti dengan fiksasi dan pewarnaan dengan

asam biru noda. Setelah gel dikeringkan, mereka ditempatkan pada pemindai flat-bed untuk

analisis densitometri. Hasil ditampilkan menggunakan program perangkat lunak Elfolab (Interlab

S.r.L., Roma, Italia). Fraksi protein diidentifikasi pada elektroforetogram yang dihasilkan dan

secara visual pada gel. Pecahan dipisahkan menggunakan metode standar menggunakan jarak

migrasi relatif (Rf), dimana jarak relatif dari titik tengah dari setiap puncak (dalam mm)

dibandingkan dengan titik tengah dari puncak albumin (dalam mm), dijaga agar tetap konstan

mungkin [22]. Gating dan penamaan fraksi dilanjutkan sebagai berikut: puncak anodal pertama

diidentifikasi sebagai albumin dan yang pertama gerbang ditempatkan di palung katodal ke

puncak ini; gerbang yang membedakan antara α- dan β-globulin ditempatkan di titik tengah

penelusuran, di palung kecil di antara dua puncak langsung anodal dan katodal ke titik tengah;

α-globulin dibagi lagi menjadi dua fraksi α1 kecil dan satu fraksi α2 besar berdasarkan pada

keberadaan tiga puncak; β1 globulin diidentifikasi sebagai puncak pertama setelah gerbang α2-

β; β2 -globulin sebagai puncak berikutnya; gerbang β-γ ditempatkan pada takik katodal ke

puncak β2. Untuk verifikasi, Rf dari masing-masing fraksi ini dibandingkan dan ditemukan

serupa dengan yang berasal dari kucing, anjing, kuda, sapi, dan domba. [22]. Konsentrasi
protein relatif di setiap fraksi dikalikan dengan konsentrasi TSP yang ditentukan oleh metode

biuret untuk memberikan konsentrasi protein absolut di setiap fraksi pecahan

Ketidaktepatan intra-gel dievaluasi dengan menjalankan satu sampel di semua 13

tempat pada satu gel, dan ketidaktepatan antar-gel dievaluasi dengan menjalankan sampel yang

sama ini di posisi 1 pada delapan gel yang berbeda selama beberapa hari. Tiga alikuot dari

sampel yang sama digunakan untuk yang terakhir percobaan. Masing-masing alikuot disimpan

hingga 48 jam pada suhu 4˚C setelah pencairan. Semua sampel dianalisis oleh satu operator

(EHH) dalam waktu 24 jam dari total protein otomatis dan pengukuran albumin

Konfirmasi penunjukan α-globulin. Untuk mengkonfirmasi bahwa globulin ketiga

puncak adalah α2 dan bukan β1, pita yang ditunjuk sebagai α1b dan α2 dianalisis lebih lanjut

dengan tujuan khusus mengidentifikasi protein yang diketahui bermigrasi ke dalam fraksi ini.

Spesimen masing-masing pita dari empat jalur yang berbeda dikeluarkan dari gel yang

digunakan untuk ketidaktepatan intra-gel belajar. Persiapan sampel dan analisis proteomik,

seperti dijelaskan di bawah, dilakukan oleh Unit Proteomik, Fasilitas Analitik Pusat, Universitas

Stellenbosch, Stellenbosch, Selatan Afrika. Metode yang digunakan untuk ekstraksi protein,

kromatografi cair (LC) dan spektrometri massa (MS) dirangkum di bawah ini. Detail lengkap

dapat ditemukan dalam Teks S1.

Pita dihancurkan dengan asetonitril 10% dalam 100 mM Tris pH 8 sebelum reduksi

dengan 2 mM triscarboxyethyl phosphine dalam 100 mM NH4HCO3 dan kemudian dicuci

dengan 100 mM NH4HCO3. Protein dicerna dengan rehidrasi potongan gel dalam larutan

trypsin dan diinkubasi pada suhu 37 overnightC semalam. Peptida diekstraksi dari potongan gel

sekali dengan 50 μL air dan sekali dengan asetonitril 50%. Reagen digest residual dihilangkan

menggunakan in-house diproduksi tip panggung C18. Sampel terikat yang dihasilkan dicuci

dengan 30 μL dari air larutan yang mengandung asetonitril 2% dan TFA 0,1% sebelum elusi
dengan 30 μL air larutan yang mengandung 50% asetonitril dan 0,05% TFA. Eluat diuapkan

sampai kering. Peptida kering dilarutkan dalam larutan berair yang mengandung asetonitril 2%

dan 0,1% FA untuk analisis LC-MS. LC dilakukan pada Thermo Scientific Ultimate 3000 RSLC

(Thermo Fisher Scientific) dilengkapi dengan kolom perangkap C18 2 cm x 100 μm dan 35 cm x

75 μm kolom analitik C18 yang diproduksi sendiri (Aeris C18, 3,6 μm; Fenomeneks, Torrance,

CA, USA). Untuk sistem pelarut, Pelarut A (pelarut pemuatan) terdiri dari 2% asetonitril berair

dengan 0,1% FA dan Pelarut B terdiri dari asetonitril berair 100%. NONA dilakukan

menggunakan spektrometer massa Thermo Scientific Fusion (Thermo Fischer Scientific) yang

dilengkapi dengan sumber ionisasi Flex Nanospray. File mentah yang dihasilkan oleh massa

spektrometer diimpor ke SearchGUI (Compomics, Ghent, Belgia) dan algoritma X! Tandem

dipilih. Interogasi basis data dilakukan terhadap gabungan database yang dibuat menggunakan

Uniprot [23] memesan database Perissodactyla dan database kontaminan dengan pembelahan

semi-tryptic yang memungkinkan untuk 2 pembelahan yang tidak terjawab. Toleransi massa

prekursor adalah diatur ke 10 ppm dan toleransi massa fragmen diatur ke 0,02 Da. Deamidasi

protein (NQ) dan oksidasi (M) diizinkan sebagai modifikasi dinamis. Output file msf dari

Proteome Discoverer diimpor ke Scaffold Q + (versi 4.4.6, Proteome Software Inc., Portland, OR)

dan validasi tambahan dilakukan. Protein dianggap positif diidentifikasi jika probabilitas

identifikasi protein adalah 100%.

Analisis data

Interval referensi. Perhitungan interval referensi 95% untuk TSP, SPE albumin dan

Fraksi globulin SPE dilakukan dengan menggunakan Reference Value Advisor (RefVal) versi 2.1,

menurut pedoman yang diterbitkan untuk spesies hewan [24, 25]. Histogram dari data tersebut

diperiksa secara visual. Tes Dixon dan Tukey digunakan untuk mengidentifikasi outlier, dan tes
AndersonDarling dan McWilliams digunakan untuk menilai normalitas dan simetri. Nilai Pv

<0,27 digunakan dengan uji Anderson-Darling untuk meningkatkan spesifisitas [26]; P diatur

pada <0,05 untuk tes jalan. Transformasi Box-Cox diterapkan pada data non-Gaussian. Itu

Metode robust digunakan untuk penentuan batas referensi pada asli atau ditransformasikan

secara normal set data terdistribusi. Jika data tidak terdistribusi normal, metode non-parametrik

adalah terapan. Interval kepercayaan 90% (CI) dari batas dihitung menggunakan non-parametrik

metode bootstrap [27]. Hasil dibandingkan untuk semua fraksi untuk perempuan versus laki-laki

menggunakan tes Mann-Whitney U

Perbandingan hewan sehat dan terluka. Semua statistik berikut diterapkan untuk

kelompok yang terluka secara keseluruhan, dan untuk subkelompok yang cedera akut dan

kronis. Deskriptif statistik dilakukan pada data untuk fraksi TSP, SPE albumin dan SPE globulin.

Uji Shapiro-Wilk dengan P <0,05 digunakan untuk menilai normalitas. Hasil dari badak putih

yang terluka dibandingkan dengan yang dari hewan sehat, menggunakan Mann-Whitney (data

nonparametrik) atau uji-t (data parametrik) (P <0,05). Frekuensi hasil dari cedera hewan yang

berada di luar interval referensi dihitung untuk setiap analit. Statistik analisis dilakukan

menggunakan MedCalc untuk Windows, versi 17.6 (Perangkat Lunak MedCalc, Ostend,

Belgium).

Persetujuan etis khusus untuk protokol penelitian ini diberikan oleh Komite Etika

Hewan Universitas Pretoria (nomor sertifikat yang berlaku V042-15, V011-17). Fakultas Ilmu

Kedokteran Hewan, Universitas Pretoria berwenang untuk bekerja dengan badak putih di bawah

persyaratan Izin Berdiri, Terancam atau Spesies yang Dilindungi (TOPS) S02655, S03007, S03013.

Taman Nasional Afrika Selatan diizinkan untuk bekerja dengan badak putih di bawah ketentuan

Izin Mendirikan TOPS S21201, S03317, dan S07620. Izin TOPS dikeluarkan oleh Departemen

Urusan Lingkungan, Pemerintah Republik Afrika Selatan.

 Hasil Populasi penelitian Kelompok sampel referensi terdiri dari 50 badak putih

dewasa, termasuk 25 jantan dan 25 perempuan. Hewan-hewan ini ditemukan di bagian selatan

Taman Nasional Kruger, dari

Tabel 1. Isyarat ringkasan dan informasi klinis untuk 30 badak putih dengan trauma jaringan

batas taman selatan hingga daerah Tshokwane. Satu laki-laki, kemungkinan besar mengalami

dehidrasi, adalah dikecualikan dari perhitungan interval referensi karena konsentrasi albumin

yang tinggi, yang diidentifikasi sebagai pencilan oleh tes Tukey dan Dixon. Isyarat dan klinis

lengkap informasi untuk 30 badak putih yang terluka disajikan di Tabel S1, dengan ringkasan

informasi ini disajikan pada Tabel 1. Kronisitas cedera diperkirakan untuk 28 hewan. Dua sampel

tersedia untuk dua anak sapi dari OVAH.

Analisis sampel
 Total protein. Uji TSP memenuhi sasaran kinerja analitis selama belajar. Perkiraan

ketidaktepatan (CV) yang berasal dari hasil kontrol kualitas internal adalah 2,1%.

Elektroforesis. Tujuh fraksi protein diidentifikasi: albumin, α1a, α1b, dan α2 globulin,

β1 dan β2 globulin dan γ-globulin. Sebuah electrophoretogram khas dari putih sehat badak

ditunjukkan pada Gambar 1A. Ketidaktepatan intra dan antar gel ditunjukkan pada Tabel 2. Nilai

untuk Rf untuk setiap fraksi, sebagai a

Spektrometri massa. Secara total, 78 protein diidentifikasi dengan identifikasi protein

probabilitas 100% (Tabel S2). Pola migrasi elektroforetik telah dilaporkan selama 22 dari ini

untuk beberapa spesies (termasuk kuda, Perissodactyl lain) yang ditunjukkan pada Tabel 3.

Mengenai band α1b potensial, tujuh protein yang diidentifikasi telah dijelaskan untuk

bermigrasi ke fraksi α1, 11 ke fraksi α2 dan empat ke fraksi β; dan pada pita α2 potensial, lima

protein telah dilaporkan bermigrasi ke α1, 13 ke α2 dan sembilan ke β [12-15, 28–30]. Mayoritas

protein yang diidentifikasi dalam kedua pita adalah α-globulin, dan ini diambil sebagai

konfirmasi bahwa pita-pita ini mewakili fraksi α daripada fraksi β.

Interval referensi

Satu orang dikeluarkan karena dicurigai mengalami dehidrasi, seperti dijelaskan di

atas. Referensi interval dihitung dari 49 badak putih yang sehat. Statistik deskriptif, statistik
Gambar 1. Penelusuran gel agarosa gel dari badak putih. (A) Khas pola elektroforesis gel agarosa

serum dari badak putih dewasa yang sehat (sampel 15). TSP 85 g / L, A / G 0,22. (B) Pria dewasa

(jumlah sampel 54) dengan luas melawan luka (akut) memiliki hipoproteinemia dengan

hipoalbuminemia dan menurun di semua fraksi globulin terlepas dari γ-globulin. TSP 53 g / L,

A / G 0,22. (C) Betis betina (sampel 80) pasca bedah kolik (akut) dengan pneumonia aspirasi

hipoproteinemia berat dengan penurunan nyata dalam α2-, β- dan γ-globulin. TSP 48 g / L, A / G

0,46. (D) Pria dewasa (sampel 64) dengan beberapa luka peluru (kronis) memiliki konsentrasi

protein untuk semua fraksi dalam referensi interval, tetapi penelusuran elektroforetogram

menunjukkan gammopati poliklonal relatif dari β-2 dan γ -globulin. TSP 78 g / L, A / G 0,21.

Fraksi dari kiri ke kanan adalah: albumin, α1a, α1b, α2, β1, β2 dan γ -globulin. Angka berwarna

kuning skrip menunjukkan persentase setiap fraksi. TSP: Total protein serum, A / G: Albumin:

globulin ratio, SPE: Serum protein elektroforesis.

metode dan RI yang diturunkan untuk populasi ini disajikan pada Tabel 4. Tidak ada perbedaan

ditemukan di antara jenis kelamin untuk salah satu fraksi.

Perbandingan hewan sehat dan terluka

Hasil dari 32 sampel dari 30 badak putih dengan trauma jaringan dibandingkan dengan

hasil dari 49 hewan dalam kelompok sehat. Seperti yang ditunjukkan pada Tabel 5, TSP, albumin,

semua α-globulin,

Tabel 2. Perkiraan ketidaktepatan dan nilai Rf untuk fraksi protein yang berbeda dalam serum

badak putih pada Platform elektroforesis cantik Interlab.

Tabel 3. Protein

diidentifikasi dalam kandidat α1b dan α2 band, dengan migrasi elektroforesis yang dilaporkan

pada spesies lain, seperti yang dilaporkan sebelumnya [12-15, 28-30].

Konsentrasi β1-globulin dan total SPE globulin lebih rendah pada hewan yang terluka sebagai

kelompok. Proporsi α2- dan β1-globulin juga lebih rendah, tetapi proporsi γ-globulin lebih tinggi.

Kelainan yang paling umum pada hewan yang terluka (semua) adalah hipoproteinemia,

hipoglobulinemia, dan penurunan konsentrasi α2- dan β1-globulin. Tidak ada binatang yang

terluka menunjukkan peningkatan konsentrasi α- atau β1-globulin atau proporsi α2-globulin.

Hasil serupa ketika membandingkan subkelompok dengan cedera akut dan kronis dengan

kelompok sehat. Sekitar setengah dari hewan dengan luka kronis mengalami penurunan β2 dan

konsentrasi globulin total; yang ketiga memiliki konsentrasi γ-globulin rendah dan rasio albumin:

globulin (A / G) yang tinggi. SPE

Tabel 4. Interval referensi protein serum untuk badak putih.

NG menunjukkan distribusi non-Gaussian; G, Gaussian; T, transformasi Box-Cox data; R, metode

yang kuat; NP, metode non-parametrik; RI, interval referensi; LRL, batas referensi lebih rendah;

URL, batas referensi atas; A / G, rasio albumin: globulinRasio 1 CI terhadap RI melebihi 20%

penelusuran dari tiga hewan yang terluka ditunjukkan pada Gambar 1B – 1D; dengan yang

sesuai deskripsi penelusuran dalam legenda untuk Gambar 1.

Diskusi

Elektroforesis

Perkiraan ketidaktepatan untuk Pretty Interlab lebih tinggi dari yang dilaporkan untuk

lainnya spesies pada platform lain dan juga lebih tinggi dari yang dilaporkan oleh pabrikan ini

untuk serum manusia [20, 31-33]. Kedua ketidaktepatan intra dan antar gel kurang dari 8%

untuk semua fraksi dalam publikasi ini. Dalam penelitian kami, pemisahan fraksi sangat standar.

Variasi dalam fraksi gating karena itu tidak mungkin telah memberikan kontribusi signifikan

terhadap ketidaktepatan tersebut. Ketidakcocokan antar gel yang tinggi yang ditemukan dalam

penelitian ini dapat dijelaskan sebagian dengan perubahan dalam fraksi protein selama

pendinginan alikuot hingga 48 jam seperti ini telah dilaporkan terjadi dalam serum kuda, kaprin,

dan sapi [34-36]. Namun, ini tidak menjelaskan tingginya ketidaktepatan ditemukan dalam satu

gel. Ini mungkin karena efek matriks yang terkait dengan serum badak putih, kualitas gel

agarosa atau faktor-faktor yang melekat pada sistem otomatis itu sendiri. Seperti ini platform

tertentu belum digunakan dalam publikasi mengenai spesies hewan lain, the sumber kesalahan

sulit untuk ditentukan. Karena ketidaktepatan yang tinggi ini, perubahan kecil dalam fraksi

protein yang mungkin terlihat dalam pengukuran serial dari satu individu seharusnya tidak lebih

ditafsirkan sebagai relevan secara klinis.

Keterbatasan preanalitik utama dari penelitian ini adalah bahwa sampel serum

dibekukan berbeda suhu dan untuk berbagai periode waktu sebelum analisis. Ini mungkin telah

menghasilkan perubahan diferensial dalam fraksi protein dan mempengaruhi akurasi dan

interpretasi hasil
dilaporkan di sini. Namun, karena pengambilan sampel oportunistik yang diperlukan untuk

penelitian ini, itu tidak mungkin untuk membakukan durasi dan ketentuan untuk penyimpanan

semua sampel.

Hasil elektroforesis gel agarosa berbeda dari SPE selulosa asetat yang diterbitkan data

untuk badak putih dengan heterogenitas dalam konsentrasi untuk setiap fraksi antara penelitian

ini dan penelitian lain serta antara studi membran selulosa asetat [6-8]. Perbedaan antara

matriks agarosa dan selulosa asetat mungkin hanya memainkan peran kecil [20]. Heterogenitas

dalam sistem uji gel agarosa, khususnya buffer dan noda dapat mempengaruhi hasil [13] Variasi

dalam metode gating fraksi mungkin memiliki efek yang jauh lebih besar. Ini diperkuat oleh

variasi yang terlihat dalam studi selulosa asetat [6-8]. Variasi dalam penamaan dan nilai fraksi

karena "efek manusia" telah dilaporkan pada kucing, kuda dan burung, misalnya [32, 37, 38].

Menggunakan metode standar, seperti yang dilakukan dalam penelitian kami, untuk fraksi

terpisah mengurangi ketidaktepatan dan meningkatkan keandalan dan telah berhasil digunakan

dalam penelitian lain, tiga di antaranya melibatkan kuda [22, 32, 37, 39, 40]. Penamaan globulin
fraksi umumnya berproduksi sesuai dengan konvensi tetapi juga dapat bervariasi untuk satu

spesies antara studi yang berbeda dan tidak memiliki standarisasi [32, 41]. Rekomendasi untuk

studi SPE akan bagi peneliti untuk menggambarkan metode gating, menyajikan penelusuran

yang khas sebagai contoh, dan gunakan metode standar untuk membuka semua sampel dari

spesies tertentu.

Metode lain dapat digunakan untuk mengidentifikasi fraksi dengan lebih akurat. Ini

adalah berdasarkan identifikasi protein spesifik dalam fraksi dan termasuk pertukaran

kromatografi, pewarnaan khusus, dan spektrometri massa [14, 15, 28, 42]. Untuk penelitian

kami, sebutan dari fraksi ketiga, globulin besar sebagai α2- daripada β1-globulin dikonfirmasi

oleh temuan, melalui analisis proteomik, bahwa mayoritas protein dalam fraksi ini telah

digambarkan memiliki migrasi α-globulin pada spesies lain, termasuk kuda. Namun demikian

dapat dilihat pada Tabel 3, banyak protein tidak bermigrasi hanya ke satu fraksi dan memiliki

lebih luas distribusi migrasi daripada yang diasumsikan secara konvensional. Selain itu, migrasi

protein tidak identik di seluruh spesies dan protein dapat hadir dalam fraksi yang berbeda pada

hewan yang berbeda. Ini bisa disebabkan oleh variabilitas dalam pola glikosilasi, adanya

fragmen protein, atau isoform berbeda [13, 28]

Lebar CI dari batas referensi melebihi lebar RI lebih dari 20% untuk beberapa fraksi

protein terutama untuk batas referensi atas. Ini menggambarkan tinggi tingkat ketidakpastian di

sekitar batas referensi ini. Ini adalah refleksi dari sampel kecil ukuran, dan kehati-hatian harus

diambil ketika menafsirkan hasil yang mendekati batas referensi ini sebagai baik benar-benar

normal atau abnormal [25].

Cara menentukan status kesehatan populasi sampel referensi dalam penelitian ini

terbatas, dan badak “sehat” mungkin menderita kondisi yang tidak terdeteksiselama

pemeriksaan klinis. Namun, badak putih menderita beberapa penyakit klinis, terutama dalam
kondisi jarak bebas. Diakui bahwa hewan-hewan ini tidak bebas parasit, karena beban kutu

normal diamati, tetapi tidak dianggap sebagai masalah kesehatan. Selain itu, efek imobilisasi

(baik obat dan stres prosedur), pada perubahan protein serum dalam badak putih tidak

diketahui. Namun, baik badak putih yang sehat dan terluka diimobilisasi menggunakan

kombinasi obat yang sama, selain betis yang terluka. Meskipun suatu keterbatasan, imobilisasi

kemungkinan akan memiliki efek yang serupa pada keduanya badak sehat dan terluka. Rusa

ekor putih yang diimobilisasi terbukti memiliki konsentrasi albumin dan protein total yang lebih

rendah dibandingkan dengan rusa yang dikekang secara fisik, walaupun perbedaannya tidak

signifikan secara klinis. Perubahan ini berspekulasi karena obat terkait peningkatan

permeabilitas kapiler yang mengakibatkan hemodilusi dan penurunan relatif pada protein

serum [43].

Badak putih memiliki konsentrasi globulin yang tinggi dan konsentrasi albumin yang

rendah, dengan A / G yang dihasilkan lebih rendah dibandingkan dengan spesies lain, termasuk

kuda. Ini muncul menjadi kasus untuk populasi bebas dan tawanan. Interval referensi untuk

captive badak putih yang disediakan oleh database Species360 untuk satwa liar yang ditangkap

adalah: protein total 55–99 g / L (166 individu), albumin 11-36 g / L (147 individu) dan globulin

30-77 g / L (153) individu) (metode analitis tidak dijelaskan) [44]. Globulin, dan dengan demikian

total protein, konsentrasi dalam badak putih bebas-rentang tampaknya sekitar 10 g / L lebih

tinggi daripada di hewan tawanan.

Sebagian besar globulin terdiri dari α2-, β2- dan γ-globulin. Karena ini adalah dua

fraksi terakhir mengandung berbagai kelas antibodi, tampaknya badak putih yang hidup bebas

mungkin secara alami memiliki konsentrasi imunoglobulin yang tinggi. Ini perlu dikonfirmasi

oleh immunoelectrophoresis jika antibodi spesifik badak menjadi tersedia di masa depan. Itu

fisiologi di balik ini tidak jelas. Imunoglobulin diproduksi oleh B-limfosit. Putih jumlah leukosit
perifer badak adalah neutrofil, bukan didominasi limfosit, dan jumlah limfosit absolut mirip

dengan yang dilaporkan untuk kuda domestik, keledai dan badak hitam [9, 44-48]. Limfosit

badak putih tidak menunjukkan peningkatan respon proliferatif terhadap stimulasi mitogen atau

antigen dibandingkan dengan badak India dan Sumatera meskipun respon limfosit lebih unggul

daripada badak hitam [49]. Peningkatan jumlah limfosit atau reaktivitas karena itu tampaknya

tidak menjadi alasan utama konsentrasi imunoglobulin yang tinggi pada badak putih.

Konsentrasi globulin yang lebih tinggi terlihat pada hewan jelajah bebas versus hewan

peliharaan mungkin terkait sebagian dengan keberadaan ekto- dan endoparasit. Berbagai

spesies kutu, serta larva lalat bot gastrointestinal, Strongylid dan cacing kremi telah

diidentifikasi pada badak putih yang bebas [50]. Selain itu, prevalensi tinggi (36-49%) dari infeksi

Theileria bicornis non-patogen telah terjadi dilaporkan pada spesies ini [51, 52]. Antibodi IgG2

yang netral telah terbukti berperan dalam kekebalan terhadap Theileria pada sapi [53]. Kuda

dengan piroplasmosis kuda ditemukan memiliki peningkatan glob-globulin dibandingkan dengan

kontrol yang sehat karena respon imun humoral [54].

Dua protein utama yang bermigrasi ke fraksi α2-globulin adalah fase akut positif

protein haptoglobin dan α2-makroglobulin. Haptoglobin adalah protein pengikat hemoglobin

yang juga memiliki peran anti-oksidan dan imunomodulator, sedangkan α2-makroglobulin

adalah protease inhibitor [55, 56]. Pengukuran langsung konsentrasi haptoglobin pada badak

putih akan menjelaskan apakah protein ini memberikan kontribusi signifikan terhadap α2-

globulin besar hadir dalam spesies ini. Investigasi lebih lanjut dari respon fase akut juga

diperlukan.

Protein serum memainkan peran utama dalam tekanan onkotik koloid darah (COP)

dengan albumin mengerahkan efek utama. Meskipun albumin telah dilaporkan mengerahkan

jumlah dua kali lipat tekanan onkotik seperti globulin pada manusia dan 4,4 kali lebih banyak
dari globulin pada sapi, γ-globulin sendiri berkontribusi signifikan terhadap COP [57, 58].

Peningkatan konsentrasi yang terakhir menyebabkan penurunan kompensasi dalam produksi

albumin untuk mempertahankan tekanan onkotik [59]. Ini mungkin menjadi alasan untuk

konsentrasi albumin rendah di badak putih, sebagai kompensasi untuk konsentrasi globulin

tinggi. Sebuah studi menyelidiki COP secara sehat sapi, anjing, kuda dan tikus menemukan

bahwa sampel dengan A / G rendah memiliki COP lebih rendah daripada sampel dengan A / G

yang lebih tinggi, ketika TSP sama [58]. Selanjutnya, dalam sebuah penelitian memeriksa COP di

spesies satwa liar, badak putih ditemukan memiliki COP 21,4 ± 3,9 mmHg, terhadap ujung

bawah kisaran (dari 15 mmHg di steenbok ke 64 mmHg di rusa kutub biru; lainnya hindgut

fermentor: gajah Afrika 47.0 ± 12.9 mmHg, zebra Burchell 40.0 ± 16.1 mmHg, Zebra gunung 25,8

± 13,1 mmHg) [57]. Temuan ini menarik karena mereka menyarankan kompensasi yang

berlebihan dari penurunan albumin, karena COP adalah normal rendah. Albumin juga

merupakan protein fase akut negatif, dan respons fase akut mungkin merupakan mekanisme

lain yang berkontribusi terhadap konsentrasi rendah protein ini pada spesies ini [56].

Perbandingan hewan sehat dan terluka. Kebanyakan badak putih dengan trauma

jaringan tidak menunjukkan reaksi fase akut yang khas. Hipoproteinemia dengan

hipoalbuminemia dan penurunan α2- dan β1 globulin adalah perubahan yang paling umum.

Perubahan-perubahan ini terkait dengan adanya luka dan trauma jaringan pada hewan-hewan

ini. Persamaan dengan manusia pasien luka dapat ditarik (frasa "pasien luka manusia"

selanjutnya menggambarkan pasien dengan cedera tempur, luka bakar, ulkus diabetes dan luka

tekan, di antara penyebab lainnya luka). Pasien manusia dengan luka dapat kehilangan hingga

100 g protein melalui eksudasi luka per hari [60]. Pasien dengan luka bakar derajat dua meliputi

20% luas permukaan tubuh ditemukan kehilangan setara dengan seluruh massa protein serum
mereka lebih dari 24 jam, yang menyebabkan perkembangan hipoproteinemia dan

hipoalbuminemia selama 48 jam pertama pasca cedera [61]. Haptoglobin dan berbagai kelas

imunoglobulin telah diidentifikasi pada eksudat luka [61, 62]. Karena keadaan katabolik yang

terkait dengan trauma, hilangnya protein melalui eksudasi luka, dan peningkatan permintaan

protein oleh penyembuhan luka, suplementasi protein diet dianggap penting untuk pasien luka

manusia [60]. Persyaratan protein adalah lebih tinggi untuk pasien dengan luka yang lebih besar,

lebih dalam, dan mereka yang mengalami infeksi luka, saluran dalam, dan jumlah tinggi jaringan

yang tidak dapat hidup. Diperlukan waktu hingga empat minggu untuk menormalkan

konsentrasi protein serum pada pasien ini, bahkan ketika diberi makan diet protein tinggi [60].

Seperti yang terluka hewan tidak menerima protein tambahan dalam makanan mereka, tidak

diketahui apakah hipoproteinemia bisa diperbaiki secara nutrisi. Respons inflamasi akut atau

kronis berdasarkan pengukuran TSP dan konsentrasi globulin dapat ditutupi oleh peningkatan

permintaan protein. Hal ini dapat dilihat pada penelusuran pada Gambar 1B dan 1D - individu

ini memiliki fraksi β2 dan γ-globulin yang relatif tinggi dibandingkan dengan protein lain, yang

mengindikasikan kronik peradangan. Betis yang ditunjukkan pada Gambar 1C menampilkan

hipoproteinemia dan hipoglobulinemia berat, mungkin karena kurangnya nutrisi yang memadai

dan penekanan kekebalan.

Keterbatasan perbandingan ini adalah bahwa badak putih dari berbagai tahap

kehidupan, di bawah peternakan yang bervariasi dan mungkin diimobilisasi menggunakan dosis

obat dan kombinasi yang berbeda. termasuk dalam kelompok dengan trauma jaringan

sedangkan kelompok sehat hanya terdiri dari hewan dewasa. Namun konsentrasi TSP, albumin,

dan globulin tidak ditemukan berbeda orang dewasa badak putih, sub-dewasa, atau anak sapi

dalam penelitian lain [3].

Kesimpulan

Konsentrasi globulin serum yang tinggi dari badak putih disebabkan oleh α2-, β2- dan

γglobulin yang tinggi. Ini menunjukkan sistem kekebalan humoral yang sangat aktif: mungkin

adaptasi terhadap prevalensi tinggi yang ditularkan melalui darah dan parasit lainnya. Kontribusi

haptoglobin terhadap konsentrasi tinggi α2-globulin perlu penelitian lebih lanjut. Analisis

proteome serum lengkap dari berbagai hewan yang sehat dan sakit akan memberikan data yang

lebih komprehensif dan seharusnya diteliti lebih lanjut. Badak putih dengan trauma jaringan

menunjukkan perubahan protein tipikal pasien luka dan respon fase akut tidak jelas. Studi

tambahan mengevaluasi efek suplementasi protein diet harus dipertimbangkan pada pasien ini.