3.

2 Hilangnya efektifitas vektor pertukaran alel menggunakan I-SceI

endonuklease dan verifikasi penggantian gen eag dengan kaset spcr

Kami menguji tingkat eliminasi vektor pertukaran alelik ketika ISceI

endonuklease diekspresikan dalam strain host. Kinetika eliminasi vektor pertukaran
alelik pKMUSD dari strain B. anthracis A16R dianalisis sesuai dengan metode yang
diterbitkan sebelumnya (Wolfson et al., 1982). Ekspresi I-SceI endonuclease
menghasilkan penghapusan cepat vektor pertukaran alelik pKMUSD. Tingkat eliminasi
pKMUSD setelah satu bagian adalah 97,5% ketika pSS4332 hadir, sedangkan> 50%
bakteri mengandung vektor pKMUSD ketika pSS4332 tidak ada (Gbr. 4). Ini
menunjukkan bahwa pertukaran alel antara vektor pertukaran alel pKMUSD dan genom
inang sangat dipercepat.

Selanjutnya, kami menggunakan vektor pertukaran alelik ini untuk

melumpuhkan gen eag pada kromosom A16R. Analisis PCR dilakukan dengan
menggunakan dua pasang primer identifikasi eksternal eagus_F / R dan eagsd_F / R dan
satu pasang primer identifikasi internal eagin_F / R (Tabel 1, Gambar 5A) untuk
menentukan apakah gen eag telah diganti oleh kaset spcr. Hasil penelitian menunjukkan
bahwa gen eag hadir dalam strain tipe liar A16R tetapi tidak dalam A16RΔeag :: spc.
Dua pasang primer eksternal secara khusus memperkuat pita PCR dalam A16RΔeag ::
spc (Gbr. 5A). Sekuensing data yang diperoleh dengan menggunakan fragmen PCR
yang diamplifikasi dengan dua primer eksternal konsisten dengan gen eag yang
digantikan oleh gen spcr (Gambar 5A). Analisis western blot menggunakan antibodi
anti-EA1 menunjukkan bahwa ada pita protein spesifik pada strain A16R B. anthracis
yang tidak ada pada A16R △ eag :: spc. Secara keseluruhan, hasil ini menunjukkan
bahwa gen eag telah digantikan oleh gen spcr (Gbr. 5B)

Pada tahun 2006, Brian K. Dan rekannya menghapus plcR, pagA, lef, cya dan
gen spo0A B. anthracis menggunakan skema pertukaran alelik yang didorong oleh 1-
SceI nuclease dengan konsentrasi 20% –100% (Janes and Stibitz, 2006; Tischer et al.,
2006). Dengan menggunakan protokol yang dikembangkan dalam penelitian ini, mutan
yang ideal diperoleh setelah hanya tiga bagian dengan menyaring 50 klon. Tiga
percobaan independen menunjukkan bahwa sekitar 85% –100% (43/50, 45/50, 50/50)
dari klon cmc spr telah diganti oleh kaset spcr dengan cara yang benar. Kami juga
menghapus beberapa gen B. anthracis lainnya, seperti BA2380, atxA, mntA, qoxA,
abrB, dan sigF, menggunakan metode ini, dengan laju pertukaran alel yang mirip
dengan yang terjadi pada penghapusan eag. Bahwa metode kami memiliki tingkat
pertukaran alel yang lebih tinggi dari klon cmr sps mungkin karena kami menggunakan
layar antibiotik ganda.

Untuk bakteri Gram-positif, rekombinasi homolog, mutagenesis transposisi, dan

mutagenesis insersi berbasis kelompok II telah digunakan untuk inaktivasi gen. Namun,
metode mutagenesis yang paling umum digunakan adalah rekombinasi homolog. Ini
biasanya peristiwa langka, jadi strategi untuk meningkatkan efisiensi rekombinasi
homolog sangat penting (Janes and Stibitz, 2006; Schuch et al., 2015; Shatalin and
Neyfakh, 2005). Banyak metode telah diajukan yang secara artifisial meningkatkan
efisiensi rekombinasi homolog endogen. Keberhasilan sistem rekombinasi λ Merah
untuk bergabung kembali dalam E. coli memberikan dasar untuk desain eksperimental
awal (Datsenko and Wanner, 2000; Tischer et al., 2006). Dengan menggunakan protein
rekombinasi yang dikodekan oleh mikobakteriofage, sistem rekombinasi untuk
mikobakteri dikembangkan berdasarkan sistem RecE / T (Van Kessel dan Hatfull,
2007). Protokol yang sama juga telah diterapkan pada bakteri asam laktat dan B. subtilis
(Van Pijkeren dan Britton, 2012; Van Pijkeren et al., 2012; Wang et al., 2012). Namun,
untuk B. anthracis, tidak ada metode yang efektif untuk mengubah DNA untai tunggal
menjadi sel yang kompeten dan kemudian memastikan kestabilannya dalam sel B.
anthracis. Dengan demikian, sulit untuk menggunakan sistem RecE / T dalam kasus ini.
Dengan demikian, penelitian telah difokuskan pada peningkatan efisiensi pertukaran
alelik antara kromosom dan plasmid target. Plasmid yang biasanya digunakan dalam B.
anthracis berdasarkan pada replikasi pE194ts yang banyak digunakan (misalnya,
pMAD, pKSV7) dapat mereplikasi dalam B. anthracis, tetapi proses curing tidak efisien
bahkan pada suhu tertinggi yang ditoleransi oleh bakteri ini (44 ° C), pada yang lebih
dari 50% sel mempertahankan plasmid dalam bentuk bebas. Plasmid berbasis replika
pWV01 juga membutuhkan lebih dari 20 bagian untuk kehilangan target plasmid, yang
tidak praktis dan itupun tidak menjamin kesuksesan (Shatalin dan Neyfakh, 2005).
Dengan demikian, pemeliharaan pada suhu nonpermissive sangat penting selama
perjalanan sel tanpa adanya pemilihan antibiotik yang diberikan oleh plasmid.
Pendekatan untuk memfasilitasi peristiwa rekombinasi ini melibatkan penggunaan
pembelahan spesifik lokasi, yang dimediasi oleh enzim restriksi I-SceI, dari situs I-SceI
serumpun yang ada dalam vektor pertukaran alelik tetapi tidak di tempat lain dalam
kromosom bakteri. Metode ini awalnya digunakan dalam E. coli, dan diadaptasi untuk
digunakan dalam B. anthracis oleh Stibitz dan rekan kerjanya (Janes dan Stibitz, 2006;
Schuch et al., 2015).

Untuk mengatasi masalah ini, kami memperkenalkan situs I-SceI ke dalam

vektor pertukaran alelik. Setelah vektor pertukaran alelik ditransformasikan menjadi B.
anthracis, plasmid kedua, pSS4332, yang menyatakan endonuklease I-SceI,
diperkenalkan untuk mencerna plasmid pertama yang menghasilkan vektor pertukaran
alelik linier selama lewat. Vektor pertukaran alel linear dipaksa untuk dimasukkan ke
dalam kromosom dengan pertumbuhan pada suhu tinggi bersamaan dengan pemilihan
untuk spektinomisin sebagai konsekuensi dari peristiwa rekombinasi homolog pertama.
Tingkat kehilangan vektor pertukaran alel akhir meningkat secara signifikan
menggunakan metode ini. Metode ini juga dapat mensimulasikan penargetan gen
menggunakan fragmen DNA linier sampai batas tertentu dan sangat meningkatkan
efisiensi rekombinasi homolog. Pendekatan ini juga akan memfasilitasi acara
rekombinasi kedua dengan memilih melawan bakteri di mana kromosom telah rusak
dan merangsang rekombinasi dari urutan homolog mengapit untuk memperbaiki lesi.
Perbaikan istirahat ini dengan peristiwa rekombinasi kedua menghasilkan hilangnya
plasmid terintegrasi dan strain pengganti gen yang diinginkan kemudian dapat diperoleh
dengan skrining resistensi antibiotik yang sesuai (Gambar. 6).

Dalam penelitian ini, situs I-SceI, yang terletak di luar dua sekuens genom
homolog, diperkenalkan ke dalam plasmid target. Rekombinasi antara target plasmid
dan DNA genom secara paksa diinduksi oleh tiga faktor, yaitu, induksi endonuklease I-
SceI untuk memulai pembelahan spesifik lokasi, suhu nonpermisif, dan antibiotik.
Dengan menggunakan strategi ini, eag dan beberapa gen B. anthracis lainnya telah
dihapus dengan sangat efisien dalam waktu kurang lebih 3 minggu dengan pekerjaan
penyaringan yang lebih sedikit. B. anthracis, B. weihenstephanensis, B. mycoides, B.
pseudomycoides, B. cereus, dan B. thuringiensis semuanya termasuk dalam kelompok
B. cereus, yang ditemukan di berbagai habitat. Meskipun kelompok B. cereus secara
keseluruhan fenotip dan genetik heterogen, secara mengejutkan, strain dari spesies
konstitutif yang berbeda terkait erat pada tingkat kromosom. Oleh karena itu, kami
berspekulasi bahwa pertukaran alel efisiensi tinggi yang didorong oleh I-SceI
endonuklease yang dijelaskan di sini dapat diterapkan pada spesies lain dari kelompok
B. cereus

Fleksibilitas, kecepatan, dan efisiensi dari berbagai kloning fragmen DNA dan
teknik penggantian gen yang dilaporkan di sini harus menjadikannya alat yang berharga
untuk menyelidiki fungsi gen pada B. anthracis dan spesies lain dari kelompok B.
cereus