Prosedur Skrining

Proses untuk mengidentifikasi suatu klon yang membawa gen tertentu yang diinginkan di antara
sejumlah besar klon lainnya di dalam perpustakaan gen dinamakan skrining. Pada dasarnya skrining
dilakukan dengan teknik hibridisasi menggunakan suatu molekul pelacak DNA (DNA probe). Beberapa
pengetahuan mengenai gen yang akan dicari, atau produknya, diperlukan dalam pembuatan molekul
pelacak bagi gen tersebut. Di dalam proses skrining, molekul pelacak akan menempel pada sekuens DNA
yang komplementer dengannya sehingga klon yang diinginkan dapat dikenali.

Apabila diperoleh protein yang merupakan produk gen tertentu dalam jumlah yang memungkinkan
untuk penentuan sekuens asam aminonya, maka dari informasi sekuens asam amino ini dapat disusun
beberapa kemungkinan sekuens DNA yang menyandinya. Selanjutnya, informasi sekuens DNA yang
disusun dapat digunakan untuk membuat molekul pelacak.

Hibridisasi koloni dan plak

Seleksi transforman dengan vektor rekombinan yang dikonstruksi menggunakan vektor λ dilakukan
dengan melihat terbentuknya plak pada medium kultur sel inang. Sementara itu, seleksi transforman
dengan vektor rekombinan yang dikonstruksi menggunakan plasmid dilakukan dengan melihat
pertumbuhan koloni pada medium seleksi (lihat Bab XI). Namun, prosedur skrining bagi kedua sistem
kloning tersebut pada dasarnya sama saja.

Langkah pertama adalah mentransfer DNA di dalam plak atau koloni ke suatu membran nilon atau
nitroselulosa. Untuk plak, DNA λ dapat langsung diperoleh dan ditransfer ke membran karena plak
merupakan area tempat keberadaan bakteri inang yang mengalami lisis. Akan tetapi, jika yang ditransfer
ke membran adalah koloni-koloni bakteri, maka perlu dilakukan lisis sel bakteri untuk mendapatkan DNA.
Sebelumnya, dibuat replika bagi koloni-koloni yang ditransfer tersebut di dalam medium kultur yang
baru.

Lisis sel bakteri biasanya dilakukan dengan merendam membran nilon di dalam sodium dodesil sulfat
(SDS) dan protease. Selanjutnya, DNA yang keluar dari sel didenaturasi menggunakan alkali sehingga
diperoleh DNA untai tunggal, yang kemudian difiksasi ke membran dengan pengeringan atau iradiasi UV.
Membran dicelupkan ke dalam larutan pelacak DNA dan diinkubasi agar terjadi hibridisasi antara
pelacak, yang juga berupa untai tunggal, dan beberapa DNA untai tunggal yang komplementer
dengannya. Pelacak DNA biasanya diberi label radioaktif.

Setelah hibridisasi, membran dicuci untuk menghilangkan sisa-sisa pelacak yang tidak terhibridisasi.
Beberapa DNA di dalam membran yang mengalami hibridisasi divisualisasikan menggunakan
autoradiografi dengan sinar X. Dengan membandingkan posisi DNA yang terhibridisasi oleh pelacak
dengan posisi koloni pada kultur replika akan diketahui koloni-koloni yang membawa DNA rekombinan
dengan fragmen sisipan yang diinginkan.

Gambar 10.3. Skema hibridisasi koloni / plak

Skrining ekspresi

Pada dasarnya skrining ekspresi sama dengan skrining perpustakaan gen melalui hibridisasi koloni/plak.
Hanya saja pada skrining ekspresi, bukannya DNA yang dideteksi pada membran, melainkan protein yang
merupakan produk suatu gen yang diinginkan. Sebagai pelacak digunakan antibodi, sedangkan untuk
mengetahui terjadinya hibridisasi digunakan antibodi lain atau bahan kimia yang dapat mengenalinya.
Dengan cara seperti ini dapat ditentukan koloni/plak yang mengekspresikan protein yang dikehendaki.

Penghambatan dan pelepasan translasi oleh hibrid

Klon-klon cDNA dapat digunakan untuk menghibridisasi mRNA yang diisolasi. Setelah dilakukan
hibridisasi, populasi mRNA langsung ditranslasi menjadi protein. Translasi tidak akan terjadi pada
segmen mRNA yang terhibridisasi oleh cDNA, atau dengan perkataan lain, translasi telah dihambat oleh
hibrid (hybrid-arrest translation). Dengan mendeteksi produk-produk protein yang tidak terbentuk dapat
diketahui cDNA yang menghambat translasi suatu protein. Artinya, cDNA ini dapat dipastikan membawa
sekuens yang menyandi protein yang tidak ditranslasi tersebut.

Cara kebalikannya juga dapat dilakukan. Hibrid-hibrid antara cDNA dan mRNA dimurnikan. Kemudian,
mRNA dilepaskan dari hibrid dengan pemanasan atau menggunakan agen denaturasi. Setelah itu, mRNA
ditranslasi (hybrid-release translation) untuk menghasilkan produk protein tertentu. Dengan mengetahui
protein yang terbentuk dapat diketahui klon cDNA yang membawa sekuens penyandi protein tersebut.
Secara skema perbandingan kedua prosedur skrining tersebut dapat dilihat pada Gambar 10.4.