1.

PENDAHULUAN
Carbopol adalah homopolimer ikatan silang dari asam akrilat
yang memiliki sifat bio-perekat yang baik. Pada pH fisiologis, karbopol dapat
berinteraksi dengan mukosa dan permukaan biologis (Rajput et al., 2010) melalui
ikatan hidrogen dari fungsi karbonil terionisasi (Tiwari et al., 2009a). Ini
menghasilkan pembentukan jaringan gel yang diperkuat yang memungkinkan
partikel-partikel tetap melekat untuk memperpanjang waktu kontak. Selain itu,
dilaporkan bahwa tetes mata yang mengandung 0,3% Carbopol mengurangi
keparahan gejala dan luasnya pewarnaan permukaan mata (mata beureum mun
kering panon) pada subjek dengan mata kering sedang (Johnson et al., 2008). Ada
sejumlah besar obat tetes mata komersial yang mengandung carbopol 940 untuk
meningkatkan retensi kornea dan meningkatkan ketersediaan hayati (Ikada dan
Kishida, 2001). Sejauh pengetahuan kami, tidak ada efek sitotoksik yang dilaporkan
dari carbopol pada jaringan okular (Ahuja dkk., 2008; Liu dkk., 2016; Dubald dkk.,
2018). Dilaporkan bahwa nanopartikel yang menggabungkan PLGA dengan
lapisan mukoadhesif karbopol tidak menunjukkan efek sitotoksik (Aksungur et al.,
2011). Namun, dalam aplikasi okular, efek kedipan dan lakrimasi masih
mengurangi jumlah polimer dan obat untuk bioadhesion dimana dapat mengurangi
kemanjuran klinis. Oleh karena itu, penggabungan bagian karbopol dalam inti
sistem vesikuler fosfolipid dapat mengurangi eliminasi polimer yang cepat dan
meningkatkan penetrasi kornea.
Gel-core liposom adalah sistem paling canggih liposomal
inti dari polimer biokompatibel di dalam vesikel lipid. Polimer dalam
inti melayani fungsi kerangka dan menyediakan mekanis
kekuatan untuk vesikel (Elnaggar et al., 2014). Selain itu, membran fosfolipid dapat
menjaga polimer di dalamnya dengan partisi yang lambat ke media eksternal.
Manfaat ini mungkin merupakan alat yang baik untuk meningkatkan waktu tinggal
di mata dan meningkatkan permeabilitas kornea untuk meningkatkan pengiriman
obat mata. Namun, potensi liposom gel-core dalam rute pengiriman okular belum
banyak diselidiki meskipun digunakan di rute lain (Tiwari et al., 2009b; Tiwari et
al., 2009a; El-Refaie et al., 2015a; El- Refaie et al., 2015b). Polimer yang
dieksploitasi untuk menyiapkan liposom gel-core termasuk asam hialuronat (HA)
(Moustafa et al., 2017), natrium alginat (Hong et al., 2008), asam poliakrilat (Tiwari
et al., 2009b) dan heparin-Pluronic (Nguyen) et al., 2015). Integrasi karbopol dalam
matriks inti dari sistem vesikuler fosfolipid sejauh ini belum diselidiki untuk
pengiriman mata.
Polimer dalam inti melayani fungsi kerangka dan memberikan kekuatan
mekanis pada vesikel (Elnaggar et al., 2014). Selain itu, membran fosfolipid dapat
menjaga polimer di dalamnya dengan partisi yang lambat ke media eksternal.
Manfaat ini mungkin menjadi alat yang baik untuk meningkatkan waktu tinggal di
mata dan meningkatkan permeabilitas kornea untuk meningkatkan pengiriman obat
mata. Namun, potensi liposom gel-core dalam rute pengiriman okular belum
banyak diselidiki meskipun digunakan di rute lain (Tiwari et al., 2009b; Tiwari et
al., 2009a; El-Refaie et al., 2015a; El- Refaie et al., 2015b). Polimer yang
dieksploitasi untuk menyiapkan liposom gel-core termasuk asam hialuronat (HA)
(Moustafa et al., 2017), natrium alginat (Hong et al., 2008), asam poliakrilat (Tiwari
et al., 2009b) dan heparin-Pluronic (Nguyen) et al., 2015). Integrasi karbopol dalam
matriks inti dari sistem vesikuler fosfolipid sejauh ini belum diselidiki untuk
pengiriman mata.
Flukonazol (FLZ) dipilih sebagai obat yang menantang dalam penelitian ini.
FLZ adalah agen antijamur yang efektif dengan berat molekul rendah 306,27 g /
mol, paruh pendek (15-30 menit) dan permeasi kornea terbatas (Corrêa dan
Salgado, 2011). Ini tersedia sebagai obat tetes mata untuk pengobatan mikosis mata.
Ditemukan bahwa setelah aplikasi tetes mata lokal, konsentrasi dalam aqueous
humor lebih rendah daripada konsentrasi penghambatan minimal (MIC) FLZ; 8 μg
/ ml (Pfaller et al., 2010; Liu et al., 2012). Di antara berbagai penelitian yang
dilakukan untuk meningkatkan ketersediaan hayati FLZ, hanya satu penelitian yang
menggabungkan (obat) kedalam matriks karbopol tetapi mencampurkannya dengan
banyak bahan yaitu; Tween80, poloxamer dan benzalkonium klorida dalam larutan
buffer borat, untuk membentuk FLZ ophthalmic thermoresponsive in situ gel
(Lihong et al., 2014). Namun, gel thermoresponsive ini gagal mempertahankan
konsentrasi FLZ di atas MIC.
 Di bawah latar belakang tersebut dan didasarkan pada
bahwa carbopol 940 dapat menjadi menjanjikan dalam pengobatan infeksi jamur
okular (Sarkar et al., 2016; Tarff dan Behrens, 2017), penelitian ini bertujuan untuk
merancang dan mengevaluasi novel sistem liposomal gel-core (Carbosomes) yang
terintegrasi dengan FLZ. Metode hidrasi film tipis yang sederhana dan spontan
digunakan untuk preparasi dengan konsentrasi karbon yang berkurang dan tanpa
penambahan polimer penambah viskositas lainnya. Karbosom yang dimuat FLZ
dievaluasi menggunakan pemeriksaan mikroskopis optik dan pemeriksaan
mikroskopik (mikroskopik elektron). Optimalisasi dan karakterisasi in vitro penuh
dilakukan untuk karbosom baru dibandingkan dengan liposom konvensional dan
gel karbopol. Eksperimen permeasi ex-vivo dilakukan menggunakan kornea yang
dipotong dari kelinci putih Selandia Baru. Permeasi in-vivo dinilai juga pada kelinci
setelah aplikasi topikal yang mengandung FLZ carbosom inti gel. Tes Draize dan
pemeriksaan histologis kornea telah dipelajari untuk memastikan keamanan
formulasi inti gel baru pada jaringan mata. Stabilitas formulasi yang dipilih
dipelajari untuk setiap perubahan efisiensi penjeratan obat, ukuran partikel dan
potensi zeta pada suhu 4 ° C selama periode enam bulan.

2. Materials and Methods

2.1. Materials
Fluconazole diberikan sebagai sampel hadiah dari Chempifine chemicals
Ltd. (Mumbai, India). Carbopol 940 diperoleh dari BF Goodrich Company
(Saginaw, Michigan, USA). Lipoid S100 (Phosphatidylcholine dari kedelai)
adalah hadiah dari Lipoid GmbH (Ludwigshafen, Jerman). Triton-X 100
dibeli dari Sigma Chemicals Corporation, UK. Transcutol HP, dan Caproyl
90 dibeli dari Gattefosse Co. (Lyon, Prancis). Semua bahan kimia lain yang
digunakan memiliki tingkat analitis.
2.2. Preparation and optimization of gel-core carbosomes
2.2.1. Preparation of carbosomes
Karbosom inti gel novel (baru) disiapkan dengan teknik hidrasi film
lipid sederhana (El-Refaie et al., 2015a; El-Refaie et al., 2015b).
 Singkatnya, lipoid S100 (0,425 g), kolesterol (0,1 g) dan FLZ dilarutkan
dalam campuran pelarut (kloroform: metanol) dengan perbandingan (2:
1 v / v). Pelarut dihilangkan dengan tekanan rendah dalam rotary
evaporator untuk membentuk film kering yang tipis. Penguapan
dilanjutkan selama 1,5 jam setelah pembentukan film kering untuk
memastikan penghapusan pelarut secara sempurna. Kemudian, karbopol
940 dalam konsentrasi yang berbeda (0,3, 0,5, 0,7 g%) ditambahkan
sebagai media hidrasi dengan waktu hidrasi 1 jam. Karbosom yang
dibuat diekstrusi (diolah pada temperatur bertekanan tinggi) melalui
membran polikarbonat dengan ukuran pori 200 nm. Dispersi yang
terbentuk kemudian disegel dan disimpan pada suhu 4 °C. Selain itu,
karbosom inti-gel lainnya dibuat dengan metode yang sama
menggunakan Tween 80 (0,075 g) atau minyak yang disebutkan
sebelumnya (0,1 g) alih-alih kolesterol. Liposom konvensional
disiapkan dalam kondisi yang sama untuk perbandingan. Tabel 1
menunjukkan formulasi yang disiapkan dengan komposisi
terperincinya.
2.2.2. Preliminary screening of vesicles composition
Berbagai faktor telah diteliti untuk mengoptimalkan formulasi
karbosom gel-core baru; yaitu, konsentrasi karbopol, aditif dalam
struktur bilayer, dan konsentrasi FLZ awal. Carbopol 940 digunakan
dalam konsentrasi yang berbeda (0,3, 0,5, 0,7% g) masing-masing.
Kolesterol dan lipoid S100 digunakan dalam struktur bilayer dari gel-
core carbosom dalam rasio (1: 4 w / w) (El-Refaie et al., 2015a). Efek
penambahan Tween 80 (0,075 g) dan minyak lainnya yaitu; Transcutol
HP, dan Caproyl 90 (0,1 g) dalam struktur vesikel yang dipelajari.
Selanjutnya, FLZ digunakan dalam konsentrasi yang berbeda (0,3, 0,6,
0,9, dan 1,2 g%) untuk mendapatkan efisiensi penjeratan yang paling
tepat. Kriteria pemilihan formulasi optimal didasarkan pada struktur
inti-gel yang ideal, efisiensi penjeratan, ukuran partikel dan stabilitas
karbosom.
2.2.3. Characterization of gel-core liposomes
2.2.3.1. Gel-core structure elucidation
Struktur karbosom gel-core yang telah disiapkan kemudian
diilustrasikan menggunakan investigasi mikroskopis. Struktur liposom
gel-core dikonfirmasi dengan menggunakan kamera yang dilengkapi
mikroskop proyeksi. Secara singkat, Triton X-100 ditambahkan ke
formulasi dan perilaku fase mereka diperiksa sebelum dan setelah
penambahan Triton X-100 (Tiwari et al., 2009a). Lebih lanjut,
mikroskop cahaya yang terpolarisasi digunakan untuk menunjukkan
struktur lengkap dari gel-core karbosom tanpa pengenceran apa pun.
Kemudian sampel yang belum diencerkan diselidiki untuk keberadaan
kristal cair.
2.2.3.2. Morphological characterization
Morfologi dari karbosom gel-core yang disiapkan kemudian diperiksa
dengan mikroskop elektron transmisi (TEM) sebelum dan setelah
penambahan dengan Triton X-100. Sampel pertama diencerkan dengan
air suling dan kemudian jatuh ke jaringan tembaga berlapis karbon dan
dibiarkan selama 1 menit untuk memungkinkan adhesi dari vesikel pada
substrat karbon. Dispersi berlebih kemudian dikumpulkan dengan kertas
saring. Kemudian mereka diwarnai dengan pewarnaan negatif
menggunakan larutan asam fosfotungstat 2% (berat / berat) selama 45
detik. Sampel udara kering segera diperiksa di bawah TEM (Freag et al.,
2013).
2.2.3.3. Determination of apparent entrapment efficiency
Carbosom gel-core baru yang disiapkan kemudian diencerkan dengan
PBS dalam rasio yang sesuai dan langsung disentrifugasi dalam
pendingin sentrifuga pada 15.000 rpm selama 15 menit pada 4 °C (El-
Refaie et al., 2015b). Supernatan dihilangkan, diencerkan dan diukur
secara spektrofotometri pada 260 nm. Metanol digunakan sebagai
blanko untuk mengukur obat yang tidak terperangkap (Sandeep et al.,
 2014). Formulasi plasebo diperiksa untuk menghilangkan kontribusi
komponen vesikular ini terhadap penyerapan UV.
Persentase efisiensi penjebakan (% EE) dihitung berdasarkan
persamaan berikut (1):
TEMPO DI JURNAL
2.2.3.4. Particle size & zeta potential measurements
Ukuran partikel (PS), potensial Zeta (ZP), dan indeks polidispersitas
(PDI) dari karbosom gel-inti yang disiapkan kemudian diukur dengan
teknik hamburan cahaya dinamis (DLS) (zetasizer Malvern) pada 25 °C.
Semua sampel diencerkan dengan air yang baru disaring dan disonikasi
selama 5 menit. ZP karbosom yang dipilih secara otomatis dihitung oleh
penganalisa sesuai dengan persamaan Smoluchowski berikut
(Persamaan (2)):
m = ez/h
Di mana z adalah potensial zeta, m adalah mobilitas, e adalah konstanta
dielektrik dan h adalah viskositas absolut dari larutan elektrolit
(Bayindir dan Yuksel, 2010). Semua sampel diukur dalam rangkap tiga
dan hasilnya direpresentasikan sebagai nilai rata-rata ± SD.
2.2.3.5. In vitro drug release
Pelepasan FLZ dari karbosom gel-core baru dipelajari dengan
menggunakan prosedur difusi membran (Sandeep et al., 2014). Pertama,
jumlah yang telah ditentukan dari karbosom gel-core yang dimuat FLZ
terpilih dipindahkan ke kantong dengan berat molekul 12-14 KDa
terputus untuk memastikan dialisabilitas obat yang cepat. Kemudian,
kantong dialisis ditutup dengan air suling selama 24 jam sebelum
dialisis untuk memastikan pembasahan lengkap membran. Kantung
dialisis kemudian direndam dalam 10 ml media pelepas (PBS, pH 7.4)
dan secara konstan dikocok dalam penangas air yang dikontrol secara
termostatis pada 35 ° C; suhu permukaan okular. Volume total media
pelepasan dikumpulkan pada interval waktu yang ditentukan (0,5, 1, 2,
3, 4, 5, dan 6 jam); dan dikompensasi dengan jumlah media pelepasan
 segar yang sama. Profil pelepasan dibandingkan dengan suspensi FLZ,
FLZ dalam gel carbopol, dan liposom konvensional yang dimuat FLZ.
Persentase FLZ yang dilepaskan kemudian dihitung dari jumlah obat
kumulatif yang dilepas pada interval waktu ini. Konsentrasi obat
ditentukan dengan mengukur absorbansi UV pada 260 nm. Semua
pengukuran dilakukan dalam rangkap tiga dan formulasi kosong
(blanko, MEREUN) juga diperiksa dalam uji pelepasan untuk mengukur
kontribusi komponen vesikular terhadap penyerapan UV. Hasil
direpresentasikan sebagai nilai rata-rata dari tiga berjalan (rata-rata) ±
SD.
2.2.3.6. Stability studies
Sampel karbosom gel-core FLZ yang dipilih dan liposom konvensional
disegel dalam wadah yang tertutup rapat dan disimpan dalam lemari es
pada suhu 4 °C selama 6 bulan. Perubahan ukuran partikel, indeks
polidispersitas dan% EE terhadap waktu penyimpanan dipantau (El-
Refaie et al., 2015a). Selain itu, stabilitas fisik formulasi diperiksa
secara berkala untuk melihat adanya agregasi, perpaduan dan perubahan
lain dalam formulasi dengan pemeriksaan visual.
2.2.3.7. Statistical analysis
Analisis data dilakukan dengan menggunakan Microsoft Excel 2010.
Hasil diilustrasikan menggunakan mean (rata-rata) dan standar deviasi.
Perbedaan yang signifikan secara statistik dideteksi menggunakan uji-t
siswa dua sisi dan tidak berpasangan. Tingkat signifikansi dinyatakan
sebagai P <0,05.
2.3. Ex-vivo permeation study
Penentuan permeabilitas kornea dilakukan menggunakan kornea kelinci
segar yang dieksisi (diambil dgn pembedahan) dengan teknik sel difusi
Franz (Mohanty et al., 2015). Langsung setelah hewan dikorbankan, kedua
mata disimpan dalam PBS (pH 7,4), di atas es basah. Kornea dipisahkan dan
dicuci dengan PBS dingin, pH 7,4. Segera, mereka dipasang pada sel difusi
dengan sisi epitel menghadap kompartemen donor dan area difusi kornea
 adalah 0,57 cm2. Karbosom gel-inti yang dipilih (CBS5, carbopol (CB)
0,3% dan FLZ 0,9%) ditempatkan pada kornea di kompartemen donor
dengan dosis 100 μl. Kompartemen penerima diisi dengan 2 ml PBS yang
baru disiapkan, pH 7,4. Sel difusi dijaga pada suhu 35 ° ± 0,5 ° C dengan
getaran 50 rpm selama percobaan. Pada interval waktu yang ditentukan
sebelumnya (1, 2, 3, 4 dan 6 jam), volume total dikumpulkan dan diganti
dengan jumlah media segar yang sama (Abdelbary et al., 2017) untuk
mempertahankan volume yang konstan. Sink conditions dipertahankan
selama penelitian. Setiap percobaan dilakukan dalam rangkap tiga dan SD
dihitung. Sampel dianalisis menggunakan metode HPLC yang divalidasi
(Gratieri et al., 2011). Fase gerak terdiri dari campuran air, asetonitril dan
metanol dalam perbandingan 80: 15: 5 dengan laju aliran 1 ml / menit.
Penentuan dilakukan pada 210 nm menggunakan instrumen HPLC.
2.4. Corneal hydration level
Langsung setelah percobaan permeasi ex-vivo, kornea dikumpulkan dan
persen tingkat hidrasi kornea (HL) dihitung untuk carbosom gel-core yang
dipilih. HL kornea (%) dihitung menurut persamaan berikut (Persamaan (3))
(Liu et al., 2005):
Rumus!!
Berat kornea basah, Ww, ditentukan dengan hati-hati mengeluarkan setiap
kornea dari sklera di sekitarnya dan kelebihan air (air mata) pada kornea
dihilangkan dengan kertas saring, kemudian kornea ditimbang. Kemudian
ditempatkan dalam inkubator selama 16 jam untuk menentukan berat kornea
kering yang sesuai, Wd (Liu et al., 2011).
2.5. In-vivo studies
Eksperimen hewan dilakukan sesuai dengan panduan National Institutes of
Health untuk perawatan dan penggunaan hewan Laboratorium (publikasi
NIH No. 8023, direvisi 1978).
Pekerjaan eksperimental dilakukan pada kelinci albino jantan dewasa
Selandia Baru, dengan berat 2 ± 0,5 kg. Kelinci diberi pakan pelet seimbang
dan dipelihara pada siklus terang / gelap 12 jam / 12 jam di ruang suhu
 terkendali, pada 20 ° C hingga 24 ° C sebelum percobaan. Semua hewan
sehat dan bebas dari kelainan okular yang dapat diamati secara klinis.
2.5.1. Determination of fluconazole levels in cornea and aqueous humor
2.5.1.1. Animals and experimental protocol
Dua belas kelinci albino jantan Selandia Baru dibagi menjadi dua
kelompok yang digunakan dalam percobaan ini. Setiap kelompok
menerima dosis 50 μl formulasi yang dipilih di satu mata dan larutan
salin fosfat sebagai kontrol di mata lainnya. Kelompok I menerima
karbosom gel-inti yang dipilih (CBS5), kelompok II menerima suspensi
FLZ 0,9% b / v untuk perbandingan. Pada interval waktu 1, 2, 3, 4, 6,
dan 12 jam, sampel aqueous humor dikumpulkan dari ruang anterior
masing-masing mata menggunakan jarum 26-gauge yang dilekatkan
pada 1 ml jarum suntik tuberculin langsung setelah kelinci dianestesi.
2.5.1.2. Sample preparation
Sampel diperlakukan (treated) sebelum disuntikkan ke HPLC.
Asetonitril ditambahkan ke sampel dan kemudian disentrifugasi selama
10 menit pada 15 rpm. Supernatan dikumpulkan, disaring dan dianalisis
menggunakan metode HPLC yang divalidasi (Gratieri et al., 2011).
Konsentrasi FLZ dalam cairan berair dihitung dari kurva kalibrasi yang
dibuat sebelumnya.
2.5.1.3. HPLC assay in aqueous humor
Sistem HPLC di atas dalam sesi ex-vivo (Gratieri et al., 2011) digunakan
dan divalidasi dalam aqueous humor. Area puncak pada kurva kalibrasi
terhadap konsentrasi FLZ adalah 776,0 (X) +275,6, di bawah
konsentrasi FLZ 0,5-10 mg%. Waktu retensi adalah 8,2 ± 0,2 menit (R2
= 0,996).
2.5.2. In-vivo ocular tolerance
Teknik Draize digunakan sebagai tes iritasi mata (Taniguchi
et al., 1988). Tes dilakukan pada tiga kelinci albino jantan dewasa.
Dosis berganda (50 μl) dari karbosom inti-gel yang dipilih FLZ
diaplikasikan selama 2 jam setiap 15 menit ke dalam kantung
 konjungtiva bawah dari satu mata setiap kelinci, sementara mata lainnya
berfungsi sebagai kontrol. Kedua mata dievaluasi pada 1, 6, dan 24, 48
jam dan hingga 6 hari setelah aplikasi. Perubahan okular diamati dengan
penilaian visual sesuai dengan sistem penilaian (Jain et al., 2010) untuk
tanda-tanda, iritasi, lakrimasi, eritema, edema dan / atau perubahan
lainnya oleh mata kelinci sampai akhir percobaan.
2.5.3. Ocular histology study
FLZ yang termuat dalam Carbosom gel-core yang dipilih kemudian
diaplikasikan selama 2 jam setiap 15 menit ke dalam kantung
konjungtiva bawah dari satu mata kelinci albino jantan. Mata
kontralateral digunakan sebagai kontrol. Setelah penanaman terakhir,
kelinci dikorbankan dan mata dipisahkan secara langsung. Sampel
dibedah dan difiksasi dalam 10% (v / v) formalin buffered netral selama
24 jam dan kemudian difiksasi dalam 70% (v / v) etanol selama 24 jam
tambahan. Sampel tetap dipindahkan ke dalam kaset berlabel dan
ditempatkan dalam 70% (v / v) etanol. Mereka dikenakan pemrosesan
jaringan (pembedahan), penanaman, pembelahan dan pewarnaan. Setiap
bagian tertanam parafin, dibagi dua menjadi dua bagian yang sama dan
akhirnya dipasang di blok parafin sehingga masing-masing setengah
bagian dipotong dan ditempatkan pada slide mikroskopis tunggal.
Setiap slide diwarnai dengan hematoksilin dan eosin (H&E).
3. Results and discussion
3.1. Preparation and optimization of novel gel-core carbosomes
Proposal/ pengajuan karbosom gel-core baru adalah untuk mengumpulkan
keuntungan dari fosfolipid liposom sebagai penambah penetrasi
biokompatibel dan Carbopol 940. Yang terakhir dipilih untuk diuji untuk
persiapan karbosom inti-gel kami dalam konsentrasi yang berbeda karena
sifat-sifatnya yang menguntungkan. Carbopol 940 memiliki sifat bioadhesif
yang baik dengan berinteraksi dengan lendir dan permukaan biologis
melalui ikatan hidrogen dari fungsi karbonil terionisasi (Tiwari et al.,
2009b). Selain itu, penggabungan karbopol di dalam inti vesikel mendukung
lapisan lipid ganda untuk mencegah degradasi yang cepat pada mata dan
kebocoran obat dini. Akibatnya, stabilitas vesikel dapat ditingkatkan
sehingga meningkatkan kemampuan mereka untuk menembus jaringan
kornea dan memberikan obat yang terperangkap. Selain itu, polimer dapat
dipertahankan dalam membran fosfolipid dengan partisi yang lambat ke
kornea sehingga memperpanjang waktu untuk mukoadhesi. Di sisi lain,
carbopol 940 digunakan untuk pengobatan sindrom mata kering (Debbasch
et al., 2002; Johnson et al., 2008; Yavuz et al., 2012) dan dapat menjanjikan
dalam pengobatan infeksi jamur okular karena gejala mereka dari debit
berlebihan dan kekeringan mata (Sarkar et al., 2016; Tarff dan Behrens,
2017).
Teknik preparasi dijelaskan dalam literatur untuk persiapan
liposom gel-core dijemukkan, multistep, dan rumit (Tiwari
et al., 2009a; An et al., 2012). Carbosom gel-core baru disiapkan dalam
penelitian ini dengan metode hidrasi film tipis satu langkah. Gel diinduksi
langsung dalam inti setelah penambahan media hidrasi yang mengandung
karbopol 940. Pendekatan ini terutama bergantung pada sifat viskoelastik
dari polimer dan kemampuannya untuk terperangkap di dalam liposom
selama langkah hidrasi. Metode sederhana ini telah diadopsi sebelumnya
untuk persiapan liposom gel-core menggunakan asam hialuronat sebagai
agen pembentuk gel (El-Refaie et al., 2015a). Namun, ini adalah studi
pertama yang memanfaatkan metode persiapan sederhana ini menggunakan
karbopol sebagai polimer pembentuk inti.
Berbagai faktor dipelajari untuk memilih carbosom inti gel yang optimal
termasuk; konsentrasi karbon yang digunakan, persen efisiensi penjerapan,
dan ukuran partikel formulasi. Untuk penyaringan konsentrasi karbopol
yang sesuai, karbosom gel-core baru dibuat menggunakan karbopol (0,3,
0,5, 0,7 g%) (Tabel 1). Pemilihan formulasi optimal didasarkan pada
kemampuan konsentrasi karbopol yang digunakan untuk membentuk
vesikel inti gel secara spontan menggunakan metode hidrasi film tipis.
Carbosom inti-gel yang mengandung FLZ dengan konsentrasi karbopol 0,3
 g% adalah kondisi optimum untuk pembentukan spontan mereka.
Konsentrasi karbopol yang lebih tinggi gagal mempersiapkan karbosom
baru ini. Ini mungkin karena viskositas tinggi dan ketidakmampuan polimer
untuk didistribusikan secara homogen selama persiapan vesikel.
Formulasi yang dipilih harus secara efisien mempertahankan FLZ dalam
struktur mereka untuk mencapai pelepasan obat berkelanjutan yang
diperlukan dan menjaga stabilitas obat. Dilaporkan bahwa sifat-sifat FLZ
memungkinkannya untuk dipartisi antara bilayer fosfolipid dan media
hidrasi berair (Corrêa dan Salgado, 2011). Oleh karena itu, bahan tambahan
yang berbeda (Tween 80, Transcutol HP, dan Caproyl 90) dimasukkan ke
dalam komposisi vesikel untuk meningkatkan kelarutan FLZ dalam bilayer
dan karenanya meningkatkan efisiensi penjebakan (Magdum Chandrakant
et al., 2009; Moustafa et al., 2017). Selain itu, konsentrasi FLZ yang
berbeda, 0,3%, 0,9%, dan 1,2% b / v, juga diperiksa pengaruhnya terhadap
efisiensi penjebakan.
3.2. Characterization of gel-core carbosomes
3.2.1. Confirmation of gel-core formation
Karbosom yang baru (CBS) diperiksa di bawah mikroskop cahaya
sebelum dan sesudah penambahan Triton X-100 untuk mengkonfirmasi
struktur inti gel. Struktur bola vesikel dipertahankan dalam gel inti
karbosom setelah distorsi bilayer lipid oleh Triton-X100 (Gbr. 1).
Sebaliknya, struktur bulat dari liposom konvensional menghilang
sepenuhnya setelah penambahan dengan Triton-X100. Ini menunjukkan
stabilitas tinggi karbosom gel-core baru.
3.2.2. Determination of entrapment efficiency
Ditemukan bahwa karbosom gel-core baru dan liposom konvensional
menunjukkan peningkatan% EE dengan peningkatan konsentrasi FLZ
awal dari 3 mg / ml menjadi 9 mg / ml (b / v) (Tabel 2). Jumlah FLZ
yang terperangkap meningkat dari 0,97 mg / ml ± 0,02 dalam CBS1
(0,3% b / v FLZ) menjadi 6,89 mg / ml ± 0,33 pada CBS5 (0,9% b / v
FLZ). Peningkatan signifikan dalam jumlah FLZ yang dienkapsulasi
 dengan peningkatan konsentrasi awalnya mungkin disebabkan oleh
peningkatan saturasi media dengan obat yang melayani lebih banyak
FLZ yang akan terperangkap ke dalam karbosom inti-gel. Hasil ini
sesuai dengan sifat obat yang dilaporkan (Corrêa dan Salgado, 2011).
FLZ memiliki afinitas yang lebih besar untuk bulk aqueous vehicle
(sarana air dalam jumlah besar?) daripada mempartisi ke dalam vesikel
fosfolipid tertutup (Corrêa dan Salgado, 2011). Selain itu, keberadaan
polimer hidrofilik dalam inti dapat mengganggu urutan membran
bilayer karena pelebaran ruang antara kelompok kepala kutub
(Andersen et al., 2013).
Di sisi lain, upaya untuk meningkatkan efisiensi penjebakan
menggunakan Tween 80 (CBS2) dan transcutol (CBS3) dalam
komposisi vesikel diilustrasikan menurunkan % EE. Ini mungkin karena
efeknya pada elastisitas vesikel (Huang et al., 2011; Manconi et al.,
2011) yang menyebabkan kebocoran FLZ dari vesikel. Selain itu,
transcutol memiliki log p dengan nilai negatif yang berarti bahwa
transcutol lebih suka tinggal di media hidrasi daripada fosfolipid.
Berdasarkan hasil % EE yang diperoleh CBS5 (0,3% b / v karbopol dan
0,9% b / v FLZ) dipilih untuk penyelidikan lebih lanjut dan LS2 liposom
konvensional (0,9% b / v FLZ) digunakan untuk perbandingan.
3.2.3. Particle size & zeta potential measurements
Carbosom inti gel seukuran nano (Tabel 2) akan cocok untuk
penggunaan okular di mana nanovesikel akan membantu dalam
melewati kendala anatomi di mata (Huang et al., 2011). Dilaporkan
bahwa ukuran partikel sediaan oftalmik harus kurang dari 10 μm untuk
menghindari peradangan mata (Kakkar dan Kaur, 2011). Selain itu,
partikel berukuran nano mewakili keadaan materi yang ditandai oleh
bioadhesi yang lebih tinggi dan luas permukaan yang lebih besar yang
tersedia untuk hubungan antara kornea dan konjungtiva (Yoncheva et
al., 2005). Peningkatan signifikan dalam ukuran vesikel diamati untuk
karbosom gelcore yang disiapkan (CBS5, 339,00 ± 5,50) dibandingkan
 dengan liposom konvensional (LS2, 140,00 ± 17,60) tetapi keduanya
berada dalam kisaran nanosize. Peningkatan ini mungkin disebabkan
oleh adanya karbopol di inti vesikel; meningkatkan ukuran mereka. Ini
lebih lanjut mengkonfirmasi penggabungan karbopol di dalam inti
liposom; meningkatkan stabilitas formulasi.
Selain itu, zeta potensial (ZP) dari karbosom inti-gel yang mengandung
FLZ terpilih (CBS5, CB 0,3% dan FLZ 0,9%) diketahui −41,70 mV
(Tabel 2); dibandingkan dengan liposom konvensional (LS2) yang
diketahui − 25,00 mV. Muatan negatif yang lebih tinggi yang diperoleh
dari karbosom inti-gel yang dipilih dibandingkan dengan liposom
konvensional mungkin disebabkan oleh muatan negatif karbopol.
Ketika muatan negatif meningkat, partikel-partikel saling menolak satu
sama lain dan mereka menjadi lebih stabil terhadap agregasi. Ini
menunjukkan ruang lingkup koalesensi yang rendah dan stabilitas
sistem vesikular yang tinggi (Günther dan Peukert, 2003).
3.3. Morphological characteristics and structure elucidation
3.3.1. Morphological characteristics
Transmission electron microscope (TEM) digunakan untuk
mengkonfirmasi gel dalam struktur inti dari karbosom inti gel baru
(CBS5, CB 0,3% dan FLZ 0,9%) (Gbr. 2). Mereka diperiksa sebelum
dan sesudah eliminasi bilayer menggunakan Triton-X100.
Photomicrographs dari CBS5 menunjukkan vesikel bulat non agregat
dengan distribusi ukuran homogen. Ini mungkin karena struktur gel dan
ZP negatif yang tinggi yang meminimalkan agregasi dan fusi vesikel.
Gel inti dalam CBS5 dikonfirmasi oleh struktur bola vesikula sempurna
yang diamati dengan distribusi ukuran sempit setelah penambahan
Triton-X100. Di sisi lain, penambahan liposom konvensional (LS2)
dengan Triton-X100 menunjukkan kehancuran total pada vesikel bentuk
bola.
3.3.2. Structure elucidation using polarizing microscopy
 Mikrograf polarisasi yang diperoleh untuk karbosom gelcore yang
mengandung FLZ (CBS5, CB 0,3% dan FLZ 0,9%) tanpa pengenceran
menunjukkan bahwa sistem khusus ini tidak hanya gel tetapi juga
termasuk sistem kristal cair yang benar (Seperti yang ditunjukkan dalam
bahan Pelengkap S1). Struktur-struktur lamelar yang biasanya terbentuk
di sekitar inti bagian dalam vesikel merupakan karakteristik untuk
membuat sistem yang terbentuk stabil dengan baik dengan mengurangi
kemungkinan agregasi dan fusi vesikel. Setelah penambahan Triton X-
100 struktur seperti kristal cair tetap ada yang mana mengkonfirmasi
pembentukan inti-gel (bahan Pelengkap S1). Struktur seperti kristal cair
ini mengkonfirmasi stabilitas tinggi karbosom inti gel yang disiapkan
saat muncul dalam struktur padat (Elnaggar et al., 2015; Freag et al.,
2016). Struktur ini dianggap sebagai keadaan mesofasa (Müller-
Goymann, 2004). Liposom konvensional (LS2) setelah penambahan
Triton X-100 menunjukkan fragmen kecil dari bilayer. Fragmen-
fragmen ini mungkin disebabkan oleh adanya kolesterol yang tidak
dapat dilarutkan oleh Triton X-100 (Mattei et al., 2014).
3.4. In vitro drug release
Studi pelepasan in vitro dianggap sebagai langkah penting dalam
pengembangan obat dan kontrol kualitas untuk memastikan bahwa bentuk
sediaan akan melepaskan bahan farmasi aktif pada tingkat yang tepat. Tes
rilis in vitro berbasis dialisis biasanya digunakan dalam hal itu. Namun,
hasil ini tidak menunjukkan perilaku in vivo formulasi yang sebenarnya
(Shabbits et al., 2002). Kondisi fisiologis seperti suhu, pH fluida reseptor,
komposisi ionik, kapasitas buffer, tegangan permukaan dan laju
pengadukan hidrodinamik harus dipertimbangkan, agar dapat mewakili
kinerja in vivo. Dalam penelitian ini, banyak faktor fisiologis
dipertimbangkan, seperti suhu mata (35 ° C) dan pH (7,4) untuk
mensimulasikan kondisi permukaan mata dan untuk memastikan kondisi
sink. Gambar. 3 menunjukkan profil pelepasan obat dari gel-core
carbosomes CBS5 (CB 0,3% dan FLZ 0,9%) menggunakan teknik tas
 dialisis. Profil rilis suspensi FLZ, FLZ dalam gel CB (0,3% b / v) dan
liposom konvensional (LS2) diilustrasikan untuk perbandingan. Seperti
yang ditunjukkan dari Gambar. 3, semua formulasi yang diuji mampu
melepaskan muatan obat mereka by time. FLZ dalam gel dan formulasi gel-
core menunjukkan retardasi (p <0,05) signifikan dalam pelepasan obat awal
dibandingkan dengan suspensi FLZ dan liposom konvensional. Suspensi
FLZ dan liposom konvensional menunjukkan 80,00% ± 1,52 dan 87,90% ±
1,02 persen kumulatif dari pelepasan obat; masing-masing setelah 1 jam. Di
sisi lain, obat dalam gel carbopol menunjukkan pelepasan lambat yang
berkurang setelah 2 jam. Ini mungkin dikaitkan dengan pembentukan
agregat obat yang tidak larut. Carbosom gel-core (CBS5) setelah 1 jam
dirilis hanya 45,00% ± 0,52 dari FLZ yang dimuat. Pelepasan obat yang
tinggi yang diamati dari liposom konvensional mungkin karena EE% nya
yang rendah dan sifat cair tidak stabil yang mengarah ke kebocoran obat
yang cepat. Di sisi lain, pelepasan FLZ berkelanjutan/ berkala dari gel-core
carbosom (CBS5) yang telah dipersiapkan mungkin dikaitkan dengan
keberadaan struktur gel yang stabil dalam inti yang membuat vesikel lebih
stabil mencegah degradasi dan kaburnya obat dengan cepat. Pelepasan
bertahap ini dapat menyebabkan penurunan frekuensi dosis.
3.5. Stability studies
Carbosom gel-core yang dipilih (CBS5) dievaluasi untuk stabilitasnya
selama 6 bulan pada 4 ° C (Tabel 3). Studi stabilitas dilakukan sesuai dengan
parameter yang berbeda termasuk; penampilan fisik,% EE, ukuran partikel
(PS), dan zeta potensial (ZP). Parameter-parameter tersebut diamati bahwa
tidak ada perubahan dalam penampilan fisik dalam hal konsistensi formulasi
dan agregasi vesikel. Selain itu, tidak ada perubahan signifikan dalam %EE,
PS, dan ZP dari CBS5 setelah penyimpanan selama 6 bulan (Tabel 3). Di
sisi lain, PS liposom konvensional (LS2) meningkat secara signifikan
dengan kebocoran komplit obat setelah 2 bulan. Stabilitas yang diamati dari
formulasi CBS5 yang dipilih dibandingkan dengan LS2 mungkin
disebabkan oleh penggabungan karbopol dalam inti dan sekitar vesikel yang
 mencegah kebocoran obat dan agregasi vesikel. Hasil ini menunjukkan
stabilitas tinggi dan kesesuaian karbosom inti gel baru dalam pengiriman
obat mata.
3.6. Ex-vivo permeation study through excised rabbit cornea
Jalur utama untuk penetrasi intraokular obat yang dioleskan (secara topical)
adalah kornea (Adelli et al., 2015). Karbosom inti gel yang dipilih (CBS5,
CB 0,3% dan FLZ 0,9%) menunjukkan total penyerapan FLZ yang lebih
tinggi melalui kornea dibandingkan dengan liposom konvensional (LS2,
FLZ 0,9%) dan suspensi FLZ (Tabel 4).
Seperti yang ditunjukkan dari Tabel 4, liposom konvensional dan suspensi
FLZ menunjukkan permeasi FLZ yang rendah terhadap cairan reseptor
tanpa obat yang tertahan di jaringan kornea. Ini mungkin disebabkan oleh
ketidakstabilan dan kebocoran obat yang cepat pada liposom konvensional
yang membuat kinerjanya mirip dengan suspensi FLZ (Agarwal et al.,
2016). CBS5 meningkatkan uptake FLZ dari kornea sebesar 3 dan 4,1 kali
lipat dibandingkan dengan liposom konvensional dan suspensi FLZ,
masing-masing. Uptake FLZ kornea yang lebih tinggi mungkin disebabkan
oleh struktur gel yang stabil pada inti yang tahan terhadap lingkungan
sekitarnya mencegah kerusakan vesikel dan kebocoran obat dini (Tiwari et
al., 2009b; El-Refaie et al., 2015a).
Mengenai jumlah FLZ yang tertahan pada kornea, CBS5 menunjukkan
konsentrasi FLZ yang sama dengan 121,52 ± 14,51 μg / cm2 dalam jaringan
kornea. Ini mungkin karena besarnya berat molekul karbopol dan
konsistensi kental dari karbosom inti gel yang disiapkan. Selain itu, sifat
mukoadhesif karbopol meningkatkan waktu retensi pada permukaan okular.
Profil carbosom inti gel yang mengandung FLZ meresap ke seluruh
kornea kelinci yang dipotong sebagai fungsi waktu diilustrasikan pada
Gambar. 4a. Telah diperhatikan bahwa jumlah FLZ kumulatif meresap dari
CBS5 (CB 0,3% dan FLZ 0,9%) setelah 6 jam, adalah 2,43 dan 3,43 kali
lipat lebih tinggi daripada liposom konvensional (LS2) dan suspensi FLZ,
masing-masing. Hasil serupa diamati oleh Hosny (2010) di mana liposomal
 hidrogel disiapkan menggunakan carbopol dan menunjukkan permeasi yang
lebih tinggi dibandingkan dengan larutan air.
Dari hasil ini, formulasi baru CBS5 ditemukan untuk dikarakterisasi oleh
profil permeasi yang lebih tinggi dan adhesi kornea yang dapat
memperpanjang kemanjuran FLZ secara in vivo.
3.7. Corneal hydration level
Persen kornea HL umumnya digunakan sebagai pengukuran untuk
keamanan formulasi okular in vitro. Dilaporkan dalam literatur bahwa,
kornea sehat normal memiliki HL 76-80% (Dai et al., 2013). HL yang lebih
tinggi dari 83-92% menunjukkan tingkat cedera tertentu dalam kornea baik
kerusakan epitel atau endotelium (Schoenwald and Huang, 1983). HL
kornea dari karbosom inti gel baru berkisaran normal 79,76 ± 0,4% yang
menunjukkan bahwa CBS5 dapat dianggap aman dan tidak merusak mata.
3.8. In-vivo studies
3.8.1. Determination of FLZ levels in aqueous humor
Percobaan ini bertujuan untuk mempelajari kinerja/performa penetrasi
kornea in vivo gel core carbosomes (CBS5) yang dipilih dibandingkan
dengan suspensi FLZ dari waktu ke waktu. Ini dilakukan dengan
aplikasi 50 μl CBS5 dan 0,9% b / v suspensi FLZ pada mata kelinci.
Sampel aqueous humor diambil pada interval waktu yang berbeda.
Gambar 4b menunjukkan profil permeasi kornea FLZ dari CBS5 dan
0,9% b / v suspensi FLZ. CBS5 menunjukkan perilaku rilis berkala
dibandingkan dengan suspensi FLZ. Selain itu, perilaku pelepasan yang
berkala ini ditemukan untuk menjaga konsentrasi obat di atas MIC (8μg
/ ml) FLZ (Pfaller et al., 2010) selama lebih dari 18 jam dalam CBS5
dibandingkan dengan hanya 6 jam dalam suspensi FLZ. Kinerja yang
luar biasa ini mungkin dikaitkan dengan sifat kental, stabilitas tinggi
sistem liposom gel-core dan penggabungan polimer mukoadhesif dalam
karbosom inti gel yang disiapkan (Tiwari et al., 2009a; El-Refaie et al.,
2015b). Dalam sebuah studi oleh Gratieri et al. (2011) pembentukan
sistem pembentukan gel in situ menggunakan poloxamer / kitosan
 sebagai penghantar untuk peningkatan permeasi kornea dan pelepasan
FLZ yang berkala yang telah dibahas. Dalam penelitian ini konsentrasi
FLZ maksimum (7,24 μg / ml) tercapai yang masih di bawah MIC FLZ
(Gratieri et al., 2011).
Perlu dicatat bahwa penelitian ini menjanjikan karena CBS5 novel
(baru) ditemukan mampu mempertahankan efek FLZ di mata di atas
MIC untuk waktu yang lama ini. Selain itu, parameter aktivitas yang
berbeda dihitung untuk carbosom gel-core yang dipilih. AUC0-24h
diperkirakan dengan metode trapesium linier dengan ekstrapolasi
hingga waktu tak terbatas. Formulasi inti gel CBS menunjukkan nilai
AUC0-24h yang lebih tinggi, (P≤0,05) (487,12 ± 74,80), 2,38 kali lipat
dibandingkan dengan suspensi FLZ (204,34 ± 7,46).
3.8.2. In-vivo ocular tolerance
Skor total pada akhir periode studi uji Draize adalah nol, tidak ada
respon inflamasi atau tanda-tanda klinis toksisitas pada kelopak mata,
iris, konjungtiva atau kornea diamati (Gambar 5). Ini menunjukkan
bahwa karbosom inti-gel yang mengandung FLZ tidak iritasi pada
mukosa okular yang mengindikasikan keamanan relatif. Ini mungkin
karena sifat biokompatibel dari bahan fosfolipid liposom. Selain itu,
dilaporkan sebelumnya bahwa, faktor penting yang berkontribusi
terhadap iritasi mata adalah ukuran partikel yang tinggi dari dispersi
koloid (Schoenwald dan Stewart, 1980). Karbosom inti gel yang
mengandung FLZ yang dipilih menunjukkan nilai ukuran partikel
rendah 339,00 ± 5,50 nm. Selain itu, carbopol 940 meningkatkan
keamanan dan tolerabilitas mata. Carbopol dianggap sebagai bahan
yang tidak beracun dan non-iritan tanpa bukti adanya hipersensitif
ketika digunakan secara topikal (Carnali dan Naser, 1992). Oleh karena
itu, kepentingan klinis potensial dari CBS5 didukung karena tidak
adanya efek iritasi in vivo.
3.8.3. Ocular histology study
 Penampakan histologis gatau pemotongan jaringan (TEUING),
pemasangan dan pewarnaan H&E pada kornea kelinci yang terpapar
karbosom inti-gel yang dimuat FLZ dilakukan untuk membantu
memahami dan mengevaluasi tingkat cedera kornea yang disebabkan
oleh sistem yang kami siapkan. Formulasi yang diuji dioleskan ke
permukaan kornea; evaluasi dilakukan dari atas ke bawah, dimulai
dengan epitel atas dan dilanjutkan ke bawah melalui lapisan epitel,
melalui stroma dan turun ke endotelium. Kedalaman cedera kornea pada
dasarnya tergantung pada penetrasi zat uji melalui tiga lapisan kornea
(Pastor-Clerigues et al., 2016). Masalah epitel dan edema stroma
dianggap sebagai faktor serius untuk iritasi mata setelah aplikasi topikal
formulasi yang diuji. Kehilangan sel, vakuolisasi, koagulasi nukleus
adalah faktor-faktor kerusakan khas yang mungkin diperhatikan dalam
epitel. Lesi-lesi stroma diamati dalam bentuk edema stroma, keratosit
piknosis, dan vakuolisasi. Selain itu, tidak ada kerusakan endotel yang
diharapkan, karena kerusakan endotelium akan dihasilkan dari
kerusakan mekanis daripada aplikasi topikal dari bahan uji (Gaafar et
al., 2014). Berdasarkan data sebelumnya, penilaian kami dalam studi
histologis ini akan didasarkan pada epitel dan stroma.
Pemeriksaan histologis mata menunjukkan tidak ada perubahan dalam
struktur mereka, di mana bagian histologis dari kedua kontrol dan mata
yang diperiksa serupa tanpa efek karena penerapan formulasi yang diuji
(Seperti yang ditunjukkan dalam bahan Tambahan S2). Ini
menunjukkan bahwa formulasi yang diterapkan aman untuk diterapkan
tanpa rasa takut menyebabkan kerusakan yang dapat dibalik pada
struktur mata. Oleh karena itu, karbosom gel-core yang dimuat FLZ
dianggap aman untuk terapi jangka pendek dan panjang.

4. Conclusion
Bergantung pada mukoadhesif karbopol dan sifat menguntungkan di mata,
SI SAMPLE HASIL digunakan untuk pertama kalinya dalam penelitian ini
untuk persiapan penghantaran/ sediaan gel-core yang distabilkan untuk
pengiriman okular. Fitur struktural yang stabil dan mukoadhesif sistem ini
meningkatkan waktu tinggal okular dan permeasi kornea. Selain itu, potensi
karbosom gel-core baru sebagai pembawa FLZ yang berguna dan terbukti
dalam studi permeasi kornea ex-vivo dan in vivo. HASIL SAMPLE mampu
meningkatkan penetrasi kornea dan pengendapan FLZ; melindunginya
terhadap degradasi dan metabolisme sehingga meningkatkan aktivitas
okular dan hasil terapeutiknya.