Kromatografi adalah teknik untuk memisahkan caampuran menjadi komponennya dengan bantuan

perbedaan sifat fisik masing-masing komponennya. Alat yang digunakan terdiri atas kolom yang
didalamnya diisikan fasa stasioner (padatan atau cairan). Campuran ditambahkan kedalam kolom dari
ujung satu dan campuran akan bergerak dengan bantuan pengemban yang cocok (fasa mobil).
Pemisahan dicapai oleh perbedaan laju turun masing-masing komponen dalam kolom, yang ditentukan
oleh kekuatan adsorpsi atau koefisien partisi antara fasa mobil dan fsa diam (stasioner) (Takeuchi, 2009).

Pemisahan secara kromatorafi dilakukan dengan cara mengotak-atik langsung beberapa sifat fisiknya
secara umum dari molekul-molekul. Sifat utama yang terlihat langsung ialah; (1) kecenderungan molekul
untuk melekat pada permukaan serbuk halus (adsorpsi penyerapan), (2) untuk menguap atau berubah
ke keadaan uap (keatsirian), (3) kecenderungan molekul untuk melarut dalam cairan (kelarutan). Pada
sistem kromatografi, campuran yang akan dipisahkan ditempatkan dalam keadaan sedemikian rupa
sehingga komponen-komponen harus menunjukkan dua dari ketiga sifat tersebut (Gritter, 1991).

Komponen-komponen utama kromatografi adalah fasa stasioner dan fasa mobil dan kromatografi dibagi
menjadimbeberapa jenis bergantung pada jenis fasa mobil daan mekanisme pemisahannya, seperti
ditunjukkan pada table di bawah ini:

Kriteria Nama

Fase Mobil Kromatografi cair, kromatografi gas, kromatografi adsorpsi, kromatografi partisi

Mekanisme Kromatografi pertukaran ion, kromatografi gel

Fase Stasioner Kromatografi kolom, kromatografi lapis tipis, kromatografi kertas

(Takeuchi, 2009).

Secara umum dapat dikatakan bahwa kromatografi adalah suatu proses migrasi diferensial dinamis
dalam sistem dimana komponen-komponen dalm cuplikan ditahan secara selektif oleh fase diam.

Kromatografi dapat digolongkan berdasarkan fase yang terlibat antara lain:

Kromatografi gas-cair, bila fase geraknya berupa gas dan fase diamnya berupa cairan yang dilapiskan
pada padatan pendukung yang inert.
Kromatografi gas-padat, bila fase geraknya berupa gas dan fase diamnya berupa padatan yang dapat
menyerap atau mengadsorpsi.

Kromatografi cair-cair, bila fase gerak dan diamnya berupa cairan, dimana fase diamnya dilapiskan pada
permukaan pendukung yang inert.

Kromatografi cair-padat, bila fase geraknya cairan sedangkan fase diamnya merupakan padatan yang
amorf yang dapat menyerap.

Kromatografi juga dapat didasarkan atas prinsipnya, misalnya kromatografi partisi dan kromatografi
serapan.

Fase Gerak Fase Diam Prinsip Teknik Kerja

Gas Padat Adsorpsi Kromatografi gas – padat

Cair Padat Adsorpsi – Partisi Kromatografi kolom, KLT, kromatografi kertas

Cair Cair Partisi Kromatografi kolom, KLT, kromatografi kertas

Gas Cair Partisi Kromatografi gas – cair

Sedangkan menurut teknik kerja yang digunakan, misalnya kromatografi kolom, kromatografi laps tipis
(KLT), kromatografi kertas dan kromatografi gas. Kromatografi kolom adalah kromatografi yang
menggunakan kolom sebagai alat untuk memisahkan komponen-komponen dalam campuran. Alat
tersebut berupa pipa gelas yang dilengkapi dengan satu kran dibagian bawah untuk mengendalikan
aliran zat cair. Ukuran kolom tergantung dari banyaknya zat yang dipindahkan. Secara umum
perbandingan panjang dan diameter kolom sekitar 8:1, sedangkan jumlah penyerapannya adalah 25-30
kali berat bahan yang akan dipisahkan. Meskipun tersedia berbagai macam kolom dari bahan gelas,
namun kadang-kadang buret juga data digunakan (Underwood, 2002).

Dalam semua teknik kromatografi, zat-zat terlarut yang dipisahkan bermigrasi sepanjang kolom (seperti
dalam kromatografi kertas atau lapis tipis, ekuivalen fisik kolom), dan tentu saja dasar pemisahan
terletak dalam laju perpindahan yang berbeda untuk larutan yang berbeda. Kita boleh menganggap laju
perpindahan sebuah zat terlarut sebagai hasil dari dua faktor yang satu cenderung menggerakkan zat
terlarut tersebut dan yang lain menahannya. Dalam proses asli Tswett, kecenderungan zat-zat terlarut
untuk menyerap pada fasa padat menahan pergerakkan mereka, sementara kelarutannya dalam fasa cair
bergerak cenderung menggerakkan mereka. Perbedaan yang kecil antara dua zat terlarut dalam
kekuatan adsorpsi dan dalam interaksinya dengan pelarut yang bergerak menjadi dasar pemisahan bila
molekul-molekul zat terlarut itu berulang kali menyebar diantara dua fasa itu keseluruhan panjang kolom
(Underwood 2002).
Kromatografi kolom klasik merupakan yang tertua dari cara kromatografi yang banyak itu dan seperti
yang dipraktekkan secara tradisional merupakan bentuk kromatografi cair pada penyangga (kcc),
ditempatkan dalam tabung kaca berbentuk silinder, pada bagian bawah tertutup dengan keran, dan fase
gerak dibiarkan mengalir kebawah melaluinya karena adanya gaya berat (Gritter, 1991).

Berbagai ukurn kolom dapat digunakan, dimana hal utamanya yang dipertimbangkan adalah kapasitas
yan memadaai untuk menerima sampel-sampel tanpa melampaui fase diamnya. Merupakan aturan
praktis yang umum bahwa panjang kolom harus sekurang-kurangnya adalah sepuluh kali ukuran
diameternya. Bahan pengemasnya, suatu adsorben seperti alumunia atau mungkin suatu resin
pertukaran ion, dimasukkan dalam bentuk suspensi kedalam porsi fasa bergerak dan dibiarkan diam
didalam hamparan basah dengan sedikit cairan tetap berada diatas permukaannya. Keran dibuka, dan
permukaan cairan dibiarkan turun sampai mencapai puncak permukaan hamparn kemudian porsi kecil
dari larutan sampel dipipet dengan hati-hati keatas puncak permukaan hamparan. Larutan eluen
dikeluarkan dikumpulkan dalam sederetan fraksi volume yang tidak merepotkan. Larutan tersebut dapat
menetes jatuh kedalam sebuah gelas beker atau tabung uji tiap kali telah terkumpul sejumlah volume
tertentu (Underwood, 2002).

Pada fenol, gugus OH mengaktifkan cincin benzene. Oleh karena itu, pada nitrasi fenol dengan asam
nitrat pekat, dihasilkan campuran yang terdiri dari 0-nitrofenol sebagai hasil utama, P-nitrofenol dalam
jumlah yang lebih sedikit dan sedikit 2,4-dinitrofenol serta 2,4,6-trinitrofenol. Bila campuran hasil nitrasi
yang masih kotor ini dimasukkan kedalam kolom yang berisi alumina (Al2O3) dan dielusi dengan metilen
klorid, maka fraksi-fraksi eluen dapat dikumpulkan, dimana masing-masing fraksi mengandung satu
komponen yang identitasnya ditentukan dengan kromatografi lapis tipis (Tim Dosen, 2011).

Jika kita tidak menangani seyawa tidak berwarna, eluen yang keluar dari dasar kolom harus dipantau
untuk mengetahui dimana larutan itu berada. Ini dapat dilakukan terus menerus dengan memakai
detector yang cocok atau menganalisanya, biasanya dengan KLT atau dengan menimbang masing-masing
fraksi-fraksi setelah pelarutnya diuapkan (Gritter, 1991).

Dalam kromatografi lapis tipis maupun kertas, sedikit bahan ditaruh pada daerah terbatas didekat ujung
selembar kertas saring atau lapis tipis, dan suatu pelarut atau lapis tipis oleh kerja kapiler, pada kondisi
yang sesuai setelah beberapa waktu, campuran akan dijumpai telah berpindah dari penotolan tadi dan
telah berpisah seluruhnya atau sebagian menjadi komponen-komponennya sebagai zona yang jelas.
Zona-zona dalam bentuk noda-noda atau pita-pita dapat ditentukan letaknya dengan penggunaan
reagensia kimia yang sesuai dengan kertas itu atau oleh pendarah flour-nitra-violet. Difusi pelarut dan
pemisahan yang dihasilkan menjadi noda-noda atau pita-pita kadang-kadang diberi istilah
pengembangan kromatografi; istilah tersebut sedikit menyesatkan dan tidak boleh dikelirukan bila
digunakan dalam arti tersebut diatas dengan proes identifikasi berikutnya dengan zona-zona itu dibuat
nampak jelas oleh pengolahan kertas atau lapis tipis itu dengan berbagai reagensia (Svehla, 1979).

Harga Rf cukup konstan agar semua variabel dikendalikan baik-baik. Namun dijumpai bahwa laju-laju
relatif gerakan itu konstan meskipun kendali kurang ketat, sehingga memungkinkan identifikasi suatu pita
pada sepotong kertas berdasarkan posisi relative pita itu terhadap pita-pita yang diketahui. Lagipula
dengan besarnya jumlah uji ”bercak” yang tersedia untuk mendeteksi ion-ion anorganik secara terpisah,
keharusan mengenai harga Rf secara cermat, telah berkurang. Jika kemurnian pelarut, temperature dan
penjenuhan atmosfernya benar-benar dijaga, maka harga Rf dipengaruhi antara lain oleh faktor-faktor
berikut:

Kehadiran ion lain, misalnya adanya klorida dalam pemisahan yang dilakukan dengan larutan-larutan
nitrat.

Keasaman larutan aslinya; ini dapat disebabkan oleh kebutuhan akan asam dalam pembentukkan
ompleks yang dapat larut dalam pelarut organic, untuk mencegah hidrolisis garam.

Waktu melakukan percobaan untuk sepotong kertas; kadang-kadang harga-harga Rf meningkat dengan
bertambahnya waktu dan ini mungkin berpadanan dengan berkurangnya laju gerak garis depan pelarut.

Adanya kation-kation lain dan konsentrasi mereka.

Adapun teknik kromatografi kertas yang diperkenalkan oleh Consden, Gordon dan Martin (1994), yang
menggunakan kertas saring sebagai penunjang fase diam. Kertas merupakan selulosa murni yang
memiliki afinitas terhadap air atau pelarut polar lainnya. Bila air di adsorpsikan pada kertas, maka akan
membentuk lapisan tipis yang dapat dianggap analog dengan kolom lembaran kertas yang berperan
sebagai penyangga dan air bertindak sebagai fase diam yang terserap diantara struktur pori-pori kertas
(Svehla, 1979).