Gambar. S. Properti dari mutan yang disaring. (A) Omset noscapine (bar gelap); efisiensi kopling (bilah lampu).

(B-F) Persentase distribusi produk

untuk metabolit 1, 2a. 2b, 3, dan S. (F) dihasilkan dari data untuk meconine (S) yang memiliki spektrum serapan UV yang serupa dengan metabolit
noscapine lainnya (Fig.SI) dan diproduksi secara stoikiometri dengan 4. Enzim WT dan F87A. R47 L / YS 1 F. R47 L / YS 1 F / F87 A. GVQ, GAQ dan
A3D tidak menunjukkan aktivitas yang terdeteksi dan tidak termasuk. Sejumlah kecil produk oksidasi ganda yang terdeteksi (Tabel 52; Gambar.
52) tidak ditampilkan. Tiga ulangan digunakan untuk setiap mutan enzim; error bar adalah ± I SE. Hasil numerik ditabulasikan dalam Bahan
Tambahan (Tabel Sl).

22% dan bervariasi kira-kira sebanding dengan metabolisme noscapine (Gbr. SA). Efisiensi kopling yang
tinggi akan diinginkan untuk produksi metabolit noscapine dalam skala preparatif dan harus
dipertimbangkan bersama dengan pergantian substrat (Gbr. SA) dan selektivitas untuk produk yang
diinginkan (Gbr. 58-F). Efisiensi kopling yang dilaporkan di sini diukur menggunakan lisat sel daripada
enzim yang dimurnikan, sehingga beberapa pergantian NADPH mungkin disebabkan oleh oksidasi non-
spesifik dari komponen lisat. Namun demikian, efisiensi kopling yang diamati berada dalam kisaran luas
yang dilaporkan dalam literatur untuk oksidasi obat yang dimediasi P450.

Kelarutan dalam air yang rendah dari noscapine diukur pada kondisi pengujian yang diterapkan di sini
(sekitar 100 μM dalam 50 mM buffer kalium fosfat, pH 7,4) menghalangi pengukuran data kinetik dan
pengikatan yang terperinci untuk enzim yang diperiksa. Secara khusus, konsentrasi substrat 100 μM
ditemukan dekat atau di bawah nilai km dari mutan paling aktif, mencegah penentuan angka turnover
(hasil tidak ditampilkan).

3.2.2. Efek mutasi tertentu

Beberapa wawasan dapat diperoleh dengan memeriksa efek dari 12 mutasi pada metabolisme noscapine
melintasi 18 mutan enzim. Mutasi L437S menghasilkan varian dengan omset noscapine tertinggi dalam
penelitian ini, A3S (Gbr. SA). Mutan ini menunjukkan salah satu regioselectivities terendah terhadap
demetilasi N di layar (59%; Gambar. SB) dan menghasilkan lebih banyak metabolit 2b terhidroksilasi secara
signifikan daripada mutan lainnya (12% dari distribusi produk; Gambar. SD), yang mungkin merupakan
properti yang menarik untuk pengembangan lebih lanjut. Mutan A3S juga memiliki efisiensi kopling
tertinggi 22%. Dalam penelitian sebelumnya yang menggunakan latar belakang mutasi yang serupa,
mutasi L437S meningkatkan aktivitas pada sebagian besar senyawa dalam panel 43 obat, secara signifikan
mengubah

distribusi produk dalam banyak kasus (32). Leu437 membentuk bagian dari loop ~ -4 yang berbatasan
dengan rongga situs aktif (Gbr. 5) dan rantai samping kutub yang diperkenalkan oleh mutasi L437S dapat
menstabilkan konformasi pengikatan noscapine melalui interaksi ikatan hidrogen.

Mutasi E267V ditemukan sangat penting dalam memberikan

aktivitas noscapine-metabolising ke P4508M3, mungkin karena perubahan konformasi yang disebabkan

oleh penghapusan jembatan garam Glu267-Lys440 antara I-helix dan ~ 4 lembar. Triple-mutants GVQ dan
GAQ (masing-masing mengandung A74G / F87V / L188Q dan A74G / F87A / L188Q) tidak menunjukkan
metabolisme noscapine dalam kondisi yang diteliti tetapi penambahan E267V pada templat ini
(menghasilkan Vl dan A1, Gambar. 2B) dihasilkan dalam metabolisme noscapine terdeteksi masing-masing
21% dan 37% (Gambar 4A). Mutasi terpilih diketahui menyebabkan P4508M3 bebas-substrat mengadopsi
struktur WTenzyme yang terikat substrat (40-45), perubahan hadir dalam dua struktur kristal bebas-
substrat yang mengandung mutasi E267V (PDB: 4RSN (43) dan SE9Z (441). Telah dikemukakan bahwa
mutasi seperti itu mengganggu kestabilan konformasi WT bebas-substrat, menurunkan penghalang energi
bebas dari transisi ke bentuk terikat substrat dan menyebabkan transisi terjadi tanpa adanya substrat. Ini
menghasilkan "secara katalitik siap "struktur dengan rentang substrat diperluas secara signifikan. Seperti
dua mutasi yang ditunjukkan secara independen menyebabkan penataan ulang ini,

0251 G [45] dan A264E (40), juga mengganggu interaksi I-helix, nampaknya kemungkinan fungsi yang
diberikan oleh E267V terjadi melalui mekanisme yang sama. Perubahan konformasi ini juga dianggap
bertanggung jawab untuk peningkatan 18 kali lipat dalam metabolisme diklofenak ketika E267V
ditambahkan ke template P R47L / Y51 F / F87V / I401 [43].

Mutasi F87V dan F87 A ditemukan penting untuk aktivitas, dengan F87A memungkinkan
pergantian substrat yang lebih besar, efisiensi penggandengan, selektivitas N-demethylation dan produksi
metabolit hidroksilasi tambahan (2b). Semua mutan aktif dalam penelitian ini memiliki mutasi F87V atau
F87A (masing-masing berasal dari template GVQ atau GAQ); dengan lima pasang mutan aktif yang hanya
berbeda dalam hal ini (F87V / F87A masing-masing: Vl / Al, V2 / A2, V3 / A3, V4 / A4. V4A / A4A). Mutasi
ini menggantikan situs aktif besar Phe87 dalam enzim WT (Gbr. 3) dan telah digunakan oleh banyak
kelompok untuk memperluas jangkauan substrat P4508M3 (20). Gambar. SA menunjukkan bahwa varian
F87A (A 1-A4 dan A4A) umumnya memiliki turnover noscapine dan efisiensi kopling yang lebih tinggi
daripada rekan-rekan yang mengandung F87V (V1-V4 dan V4A). Ada juga perubahan penting dalam
distribusi produk: mutasi F87A biasanya dikaitkan dengan peningkatan selektivitas N demethylation,
sebagian besar disebabkan oleh penurunan yang signifikan dalam pembelahan ikatan C-C (mis. Penurunan
26% antara Vl dan A1). terkecuali A4A. Mutasi F87A juga memungkinkan produksi metabolit
terhidroksilasi kedua (2b). yang tidak ada dalam profil produk dari semua varian F87V (V1-V4 dan V4A;
Gambar. SF). Residu alanin yang lebih kecil dalam mutan yang mengandung F87A memungkinkan
pendekatan yang lebih dekat dari gugus N-metil noscapin ke pusat hem di dalam situs aktif enzim,
meningkatkan selektivitas dan efisiensi kopling, sementara juga memungkinkan hidroksilasi dari karbon
isoquinoline yang tidak dapat diakses ketika valine hadir.

Penambahan R47L ke Vl dan A 1, menghasilkan V2 dan A2 (Gbr. 2B). meningkatkan pergantian

media dan efisiensi kopling (Gbr. SA). Mutasi R47 L terletak di permukaan saluran akses media (Gbr. 3).
Pada enzim tipe liar, residu Arg47 yang terisi berinteraksi dengan gugus karboksil dari substrat asam lemak
(46,47) dan penggantiannya dengan residu leusin netral telah terbukti meningkatkan aktivitas dengan
substrat hidrofobik, mungkin dengan memungkinkan tingkat yang lebih tinggi dari entri media ke saluran
akses (27). Peningkatan turnover noscapine terlihat pada Gambar. SA konsisten dengan mekanisme ini,
bagaimanapun, perubahan dalam entri substrat ini tidak menjelaskan perubahan dalam distribusi produk
terlihat untuk V2 (peningkatan 11% dalam noscapine N-demethylated dibandingkan dengan Vl; Gambar
SB) atau peningkatan efisiensi kopling terlihat untuk A2 dan V2.

Manfaat yang jelas dari mutasi A74G ke metabolis noscapine ditunjukkan oleh mutasi kembali
A74G ke tipe liar Ala74 dalam dua mutan (menghasilkan V4A dan A4A; Gambar. 2B) dan penurunan
kopling yang terkait 4-7%. efisiensi dan penurunan 10-13% dalam turnover noscapine (Gbr. SA). Mutasi
A74 G adalah pada ujung N dari heliks B'-pendek, yang menutupi situs aktif (Gbr. 3). Mutasi tidak termasuk
dalam struktur kristal yang tersedia dan tidak diketahui apakah ia menghasilkan perubahan struktural
yang signifikan. Penghapusan rantai samping Ala74 dapat memungkinkan peningkatan fleksibilitas
wilayah terminal N dari B'-helix melalui interaksi sterik yang berkurang (28), meningkatkan akomodasi
noscapine di dalam lokasi aktif.

Sementara mutasi F81 I telah digunakan untuk meningkatkan aktivitas P4508M3 pada beberapa
substrat obat (31,32), ini memiliki efek yang bervariasi tergantung pada latar belakang F87A / V yang
diterapkan di sini. Omset noscapine meningkat dalam kombinasi dengan F87V (mis. Antara mutan V2 dan
V3) tetapi menurun dengan F87A (antara A2 dan A3), namun efisiensi kopling meningkat dalam kedua
kasus (Gbr. SA). Seperti mutasi A74G, mutasi F81 I mengurangi interaksi hidrofobik dari B'-helix dan
kemungkinan memungkinkan fleksibilitas yang lebih besar dari daerah tutup P4508M3 (25).

Mutasi E64G juga menghasilkan efek campuran, memiliki sedikit pengaruh signifikan pada
pergantian noscapine dan efisiensi penggandengan bila dikombinasikan dengan mutasi F87V (mis. Antara
V3 dan V4) tetapi meningkatkan pergantian dan penggabungan dengan F87A (antara A3 dan A4). Mutasi
ini terletak jauh dari situs aktif (Gbr. 3) dan telah disarankan untuk mempengaruhi interaksi dinamis antara
haem dan domain reduktase dari P4508M3 (44).

Mutasi S72D menghapuskan semua metabolisme noscapine ketika dimasukkan ke dalam mutan
A3. menghasilkan A3D (Gbr. 2B; A3D dikeluarkan dari Gbr. 5 karena tidak menunjukkan pergantian
media). Ini berbeda dengan layar perpustakaan P4508M3 dengan 43 obat, di mana mutasi ini terbukti
secara umum meningkatkan metabolisme substrat yang tidak bermuatan [32). Ser72 terletak di
persimpangan saluran akses dan kantong situs aktif dan telah disarankan oleh studi komputasi untuk
memiliki efek penahan yang dimediasi ikatan hidrogen pada beberapa substrat obat selama katalisis
(48,49). Sementara noscapine memiliki delapan akseptor ikatan hidrogen dan karena itu mungkin
berpartisipasi dalam interaksi ikatan-H dengan Ser72, tampaknya tidak mungkin bahwa menghilangkan
interaksi ini saja akan bertanggung jawab untuk penghapusan metabolisme noscapine yang diamati di
sini. Pengenalan residu aspartat bermuatan negatif di pintu masuk ke situs aktif lebih mungkin
menghambat molekul noscapine yang besar dan hidrofobik, mencegah noscapine dari membuat
pendekatan dekat dengan hem.

Penambahan mutasi L86I ke R47 L / A74 G / F81 I / F87A / L 188Q / E267 V latar belakang A3,
menghasilkan A3l, memburuk baik pergantian noscapine dan efisiensi kopling (Gbr. SA). Ini berbeda
dengan peningkatan N-demethylation dari 3,4-methyl-enedioxymethamphetamine (MOMA) (31) yang
diamati ketika L86I ditambahkan ke latar belakang R47 L / F87 V / L188Q / E267 V. Ini menggambarkan
pentingnya konteks di mana mutasi diperkenalkan.
 3.3. Dalam docking silico

Studi docking molekuler dengan mutan P4508M3 aktif terpilih dan noscapine dilakukan untuk
merasionalisasi aktivitas enzim yang diamati dalam percobaan penyaringan. Metode docking yang
diinduksi-cocok digunakan yang memungkinkan untuk pergerakan rantai samping di sekitar ligan yang
merapat. Struktur PDB 4ZF6 (43) (P4508M3 pentamutant R47L / F87V / L188Q / E267V / F81 I) digunakan
untuk memodelkan reseptor. karena struktur kristal ini mengandung mutasi serupa dengan varian
P4508M3 aktif diperiksa dalam karya ini, paling mirip V3 tetapi tanpa mutasi A74G. Kami mengulangi
docking setelah mutasi silika Val87 ke alanine untuk menguji apakah pose docking mendukung
pengamatan eksperimental kami, karena penggantian F87V dengan F87 A menyebabkan perubahan
signifikan dan konsisten dalam pergantian noscapine, regioselektivitas dan efisiensi penggandengan (yaitu
pengukuran ini adalah biasanya lebih tinggi untuk A 1-A4 dibandingkan dengan V1-V4).

Studi docking menghasilkan pose substrat dengan gugus N-metil noscapine proksimal terhadap
besi hem, konsisten dengan demetilasi N (Gambar 6A). Penggantian Val87 dengan alanin memungkinkan
pendekatan yang lebih dekat dari kelompok N-metil ke haem (3,1 A vs 3,4 A) dengan gugus metil yang
terletak lebih terpusat di atas atom besi (Gbr. 6A), konsisten dengan peningkatan aktivitas demetilasi N
yang biasanya terlihat pada mutan yang mengandung F87 A (yaitu A1-A4 versus V1-V4 ; Gbr. 58). Studi
docking juga meramalkan beberapa orientasi di mana karbon metilenoksi diposisikan dekat dengan besi
hem, contoh yang ditunjukkan pada Gambar. 68. Posisi ini konsisten dengan produksi metilenoksi
metabolit yang dibelah (3). Orientasi juga nampak independen dari asam amino yang ada pada posisi 87.
Kelimpahan metabolit yang sedikit lebih rendah ini dalam profil produk A 1-A4 dibandingkan dengan V1-
V4 (Gbr. SE) mungkin disebabkan oleh peningkatan efisiensi kopling N- demethylation, menggeser
distribusi produk ke N-demethylated noscapine (1).

Gambar. 6. Pose substrat dari studi docking yang diinduksi-fit dilakukan dengan mutan P450uMJ dan noscapine. Pentamutant
P450uMJ (R47L / F81 I / F87V / L188Q / E267V; POB: 4ZF6125 I) digunakan untuk memodelkan reseptor. Docking run dilakukan sebelum dan
sesudah dalam mutasi silico dari F87 V ke F87A; F87Avariant ditampilkan kecuali disebutkan sebaliknya. Permukaan biru mewakili rongga internal
situs aktif. Kelompok hem diwakili sebagai tongkat biru dengan atom besi ditampilkan sebagai bola coklat. (A} N-demethylation berpose untuk
varian F87 V (ungu) dan F87A (hijau). Sidechain Ala87 dan Val87 diperlihatkan dengan warna yang sesuai di dekat kelompok haem. (B) Salah satu
pose pembelahan jembatan methylenedioxy ditemukan. (C ) Pose konsisten dengan hidroksilasi karbon 7 '. (D) Pose konsisten dengan hidroksilasi
karbon 8'. (E) N demethylation pose menunjukkan detail yang lebih besar dari sidechains Ser72, Ala74 dan Leu75. Sidechains yang ditunjukkan
dengan warna ungu digeser oleh protokol yang diinduksi-fit dari posisi asli yang ditunjukkan dengan warna hijau. Semua pose docking memiliki
GlideScores antara -8,5 dan -6,5 kkal / bulan!

Dua metabolit terhidroksilasi (2a / 2b) yang diamati dalam percobaan penyaringan ditentukan
untuk dihidroksilasi pada gugus isoquinoline noscapine meskipun lokasi gugus hidroksi tidak dapat lebih
diselesaikan dengan LC-MS / MS. Dalam studi docking, dua pose diproduksi dengan gugus CH gugus
isoquinoline yang diarahkan ke hem: satu dengan alfa karbon ke nitrogen pada posisi 7 'yang paling dekat
dengan besi (2,9 A; Gambar. 6 () dan yang lainnya dengan ~-karbon pada posisi 8 'terdekat (3,3 A. Gambar.
60). Pose ini konsisten dengan perpindahan ligan air proksimal dan inisiasi siklus katalitik, namun lokasi
aktual oksidasi substrat tergantung pada interaksi dengan feri! oksigen dari senyawa antara haem antara
saya, yang tidak dimodelkan dalam penelitian ini. Oleh karena itu, studi dok yang dilakukan di sini mungkin
terbatas digunakan untuk prediksi situs oksidasi substrat. Produk hidroksilasi potensial lainnya termasuk
N-oksida yang dihasilkan dari orientasi yang mirip dengan N-demetilasi, karena N-oksigenasi telah diamati
bersama N-demetilasi dalam metabolisme beberapa obat amina tersier oleh P450s mikrosomal [50,51],
hidroksilasi aromatik pada posisi 9 ', atau pasangan stereoisomer pada posisi 7' atau Posisi 8 '.

Studi docking tidak menemukan pose yang akan konsisten dengan pembelahan ikatan C-C (mis.
Oksidasi dari metabolit penghasil karbon 5 '2 dan 3). Ini mungkin karena orientasi substrat yang mengarah
ke pembelahan C-C sangat tidak cocok dalam situs aktif atau karena metabolit ini diproduksi melalui
peroksida uncoupling, seperti dibahas di atas.

Mutasi A74 G, yang tidak ada dalam struktur 4ZF6 yang digunakan untuk simulasi docking,
ditunjukkan oleh percobaan penyaringan enzim untuk secara signifikan meningkatkan efisiensi kopling
dan pergantian noscapine (mutan V4A vs V4 dan A4A vs A4; Gbr. SA). Algoritma docking induced-fit
menggeser beberapa rantai samping di wilayah Ala74 pada B'-helix. terutama Ser72 dan Leu75, untuk
mengakomodasi pose yang kompatibel dengan N-demethylation dari nosca-pinus (Gbr. 6E), menunjukkan
bahwa interaksi yang erat antara noscapine dan wilayah situs aktif ini terjadi selama pengikatan substrat.
Peningkatan fleksibilitas wilayah 'tutup' situs aktif ini kemungkinan menjelaskan peningkatan efisiensi
pergantian dan pemasangan yang diberikan oleh mutasi A74 G, serta peningkatan efisiensi kopling yang
dihasilkan oleh mutasi F81 I (mutan V3 vs V2 dan A3 vs A2; Gambar. SA). Kontak dekat antara noscapine
dan area B'-helix ini juga dapat menjelaskan pengamatan bahwa mengganti Ser72 dengan residu aspartat
yang lebih besar (5720) menghapuskan semua aktivitas noscapine dalam mutasi A3 ke A3D (karena itu
A3D dikecualikan dari Gambar. 5). karena interaksi ini kemungkinan tidak akan terjadi.

Studi docking yang diinduksi-fit menyoroti mutasi lebih lanjut yang mungkin terbukti bermanfaat
bagi aktivitas P4508M3. Orientasi Leu75 dalam pose N-demethylation pada Gambar. 6E menunjukkan
bahwa residu ini, diposisikan antara isoquinoline dan bagian phthalide noscapine. mungkin menjadi
hambatan selama pengikatan media. Mutasi Leu75 ke residu yang lebih kecil, seperti alanin, telah terbukti
meningkatkan aktivitas pada beberapa senyawa seperti obat [52,53); mutasi ini tidak diuji di sini dan dapat
meningkatkan aktivitas noscapine. Simulasi dinamika molekuler baru-baru ini menunjukkan,
bagaimanapun, bahwa interaksi hidrofobik antara Leu75 dan beberapa substrat obat adalah kontributor
penting untuk mengikat stabilitas [54), membuat interaksi antara residu ini dan noscapine sulit diprediksi.

- Metabolit dan mutan yang signifikan

Dalam konteks penelitian analog noscapine, metabolit yang paling menarik yang diproduksi di
layar mutan adalah N demethylated noscapine (1) dan dua metabolit terhidroksilasi (2a, 2b). Varian
P4508M3 dengan regioselectivity tertinggi untuk N-Demetilasi adalah A2 dan A3 yang keduanya
menghasilkan N demetilasi noscapine dengan selektivitas 88% (Gbr. 58). Sementara A3 menunjukkan
pergantian noscapine yang lebih rendah dari A2 (39% vs 50%), itu lebih efisien dalam hal penggunaan
kofaktor (16% vs 11%; Gambar. SA) dan karenanya merupakan kandidat terbaik untuk memproduksi
noscapine N-demethylated di sebuah skala preparatif setelah proses optimasi lebih lanjut.

Hidroksilasi pada posisi 7 'atau 8' noscapine, seperti yang disarankan oleh simulasi docking,
menambahkan pusat kiral baru ke perancah noscapine yang mungkin berguna dalam mengembangkan
analog yang lebih kompleks yang tidak dapat dengan mudah dicapai oleh sintesis kimia. Sementara
selektivitas terbesar untuk metabolit terhidroksilasi hanya 12%, diamati untuk metabolit 2b oleh A3S
mutan (Gambar. SD), mutan ini memiliki omset noscapine tertinggi dan salah satu efisiensi kopling
tertinggi diamati (masing-masing 59% dan 19%; Fig. SA). Sementara perpustakaan yang disaring di sini
relatif kecil, berisi delapan belas mutan P4508M3, itu menggambarkan efisiensi penerapan mutasi yang
dijelaskan sebelumnya untuk target obat baru. Pengenalan mutasi rasional lebih lanjut, diinformasikan
oleh hasil yang disajikan di sini, dapat digunakan untuk lebih lanjut menggeser selektivitas enzim menuju
2a / 2b atau potensi metabolit lain yang menarik.

Pengembangan dan peningkatan biotransformasi yang disajikan di sini untuk produksi 1 atau 2a /
2b dapat menggunakan sejumlah strategi untuk lebih mengoptimalkan hasil dan mengurangi biaya
operasi, yang akan diperlukan untuk aplikasi masa depan dari mutan-mutan ini pada skala persiapan. N-
demetilasi. Daur ulang kofaktor atau pendekatan biotransformasi sel utuh dapat digunakan untuk
mengurangi atau menghilangkan kebutuhan untuk penambahan NADPH, yang mahal di atas skala
laboratorium kecil yang diterapkan di sini. Strategi pasokan substrat [55), seperti sistem dua fase cair, juga
dapat digunakan untuk mengatasi kelarutan noscapine yang buruk dan meningkatkan titer produk.

Kesimpulan

Regioselektivitas tinggi untuk demetilasi N yang diperlihatkan oleh A3 mutan P4508M3 yang
dikembangkan di sini memberikan bukti konsep untuk pendekatan biokatalitik alternatif potensial untuk sintesis kimia
N-demethylated noscapine (1). prekursor untuk memproduksi analog noscapine dengan peningkatan aktivitas
antikanker. Dua metabolit terhidroksilasi diamati (2a / 2b). dengan produksi tertinggi untuk mutan V4A (2a) dan
A3S (2b). Metabolit ini mungkin memiliki gugus hidroksil kiral pada posisi yang sebelumnya tidak ditandai pada
perancah noscapine dan mungkin berguna untuk produksi kelas baru dari analog noscapine. Studi ini menggunakan
perpustakaan mutan kecil yang dibangun dengan menggabungkan mutasi yang dikenal untuk meningkatkan aktivitas
P4508M3 pada substrat besar yang menyerupai obat, suatu pendekatan yang menerapkan informasi berharga yang
ada dalam literatur untuk secara efisien menghasilkan modifikasi struktural dari target obat yang diinginkan. Efek
dari mutasi pada aktivitas P4508M3, bersama dengan simulasi docking, memberikan wawasan fungsional ke dalam
metabolisme obat yang dimediasi P4508M3. Transisi konformasi dari P4508M3 bebas-substrat ke tipe liar,
struktur terikat-substrat, yang diinduksi oleh gangguan jembatan garam, nampak penting bagi metabolisme dari
substrat noscapine non-alami, seperti yang telah diamati untuk mutan lainnya. / kombinasi obat. Efisiensi pergantian
dan kopling noscapine juga tergantung pada: (1) ukuran residu pada posisi 87, dan (2) fleksibilitas wilayah tutup
situs aktif. Itu profil metabolit yang paling mirip dengan mikrosomal P450 CYP3A4 manusia dan mutan ini dapat
digunakan sebagai alternatif praktis untuk menghasilkan metabolit noscapine untuk studi metabolisme obat. Enzim
mutan yang disajikan di sini juga menjanjikan untuk digunakan dalam proses biotransformasi seluruh sel. yang setelah
dioptimalkan lebih lanjut d apat memungkinkan peningkatan produksi metabolit secara efisien.