Identifikasi moracin N dalam daun mulberry dan evaluasi antioksidan

aktivitas

Daun mulberry adalah sayuran yang baru diterima untuk diet sehari-hari. Rasanya enak
dan memiliki banyak manfaat kesehatan, termasuk aktivitas antioksidan dan anti-inflamasi.
Namun, bahan kimia yang bertanggung jawab atas manfaat kesehatan ini tetap belum
terselubung. Fenolik prenilasi adalah senyawa bioaktif khas dalam daun mulberry, yang dikenal
sebagai antioksidan yang baik. Dalam karya ini, moracin N dimurnikan dari daun mulberry. Ini
menunjukkan aktivitas antioksidan yang lebih baik dari pada resveratrol. Nilai EC50 dari
aktivitas antioksidan seluler adalah 24,92 μM, dan nilai IC50 terhadap radikal DPPH adalah
40,00 μM. Gugus prenil memberikan molekul lebih banyak afinitas membran yang
meningkatkan ketersediaan hayati. Cincin furan sangat penting untuk perilaku antioksidan. Uji
viabilitas sel mengungkapkan bahwa moracin N memiliki keamanan yang baik. Hasil ini
menunjukkan bahwa moracin N berkontribusi pada aktivitas antioksidan daun mulberry.

Stres oksidatif sangat terlibat dalam banyak penyakit, seperti gangguan neurodegeneratif,
aterosklerosis, katarak, peradangan kanker, penyakit jantung koroner dan penyakit Alzheimer
(Aruoma, 1998; Diaz et al., 1997). Ini dihasilkan selama metabolisme sel dan mengarah pada
oksidasi berbagai biomolekul, seperti DNA, lipid dan protein (Fredotović et al., 2017), yang
selanjutnya dapat menyebabkan proses patologis dan degeneratif dalam tubuh manusia.
Antioksidan, terutama antioksidan alami, semakin mendapat perhatian karena kemampuan
mereka untuk menjaga keseimbangan oksidasi-antioksidan (Fredotović et al., 2017). Dengan
mengganggu penyebaran reaksi beroksidasi rantai atau dengan menghambat pembentukan
radikal (van Acker et al., 1996), fenolik tanaman berperilaku sebagai antioksidan yang efektif
(Wright et al., 2001). Buah dan sayuran adalah sumber fenolik yang kaya. Daun muda dari
mulberry dikonsumsi sebagai sayuran di Asia. Ini sangat lezat rasa dan telah digunakan untuk
membuat banyak makanan diet. Ini juga merupakan makanan fungsional untuk membantu
mengobati diabetes mellitus (Jia et al., 1999). Bioactivities lain telah diilustrasikan, yang
termasuk mengobati demam, melindungi hati, menurunkan tekanan darah, anti-obesitas, anti-
inflamasi dan kegiatan antitumor (Chang et al., 2016; Katsube et al., 2006). Beberapa
phytochemical dalam daun mulberry telah diidentifikasi, termasuk stilbenoids, asam fenolik dan
flavonoid (Chang et al., 2016). Patut disebutkan bahwa fenolat terprenilasi adalah bahan kimia
karakteristik dalam sayuran ini, dan jenis bahan kimia ini diakui sebagai fitoestrogen (Yang et
al., 2019) dan menyajikan bioaktivitas luar biasa (El-Beshbishy et al., 2006; Yang et al. , 2015).

Dalam karya ini, melalui pemisahan dan pemurnian dengan kromatografi kolom, bahan
kimia utama dikumpulkan dan diidentifikasi sebagai moracin N oleh NMR. Untuk menyelidiki
potensi antioksidan dan hubungan struktur-aktivitas, serangkaian non-seluler dan seluler tes
untuk aktivitas antioksidan dilakukan, termasuk aktivitas antioksidan seluler, kapasitas serapan
radikal oksigen, 2,2-difenil-1- pikrillhidrazil (DPPH) aktivitas pemulungan radikal. Uji aktivitas
antioksidan seluler memberikan pemahaman yang komprehensif tentang bagaimana antioksidan
berperilaku di bawah kondisi fisiologis (Wen et al., 2017), dan memberikan bukti apakah
prenilasi memfasilitasi penyerapan sel (Chi et al., 2001). Selain itu, sitotoksisitas dari moracin N
juga diukur. Hasilnya akan sangat membantu untuk memahami manfaat kesehatan dari daun
mulberry.

2. Bahan-bahan dan metode-metode

2.1. Bahan kimia dan reagen

Trolox, 2,7-diasetat di-chlorofluorescin, 2,2ˊ-azobis-amidinopropane (ABAP), 1,1-

difenil-2-pikrillhidrazil, garam natrium fluorescein, 4-(2-hydroxyethyl) -1-
piperazineethanesulfonic acid (HEPES), dan serum janin sapi (FBS) dibeli dari Sigma-Aldrich
Co. (St. Louis, MO, USA). 3- (4,5-Dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide
(MTT), asam askorbat, kuersetin, kalium fosfat dibasat, kalium fosfat monobasa, Williams
'medium E, Dulbecco's modifikasi medium Eagle (DMEM), larutan garam seimbang Hank
(HBSS), dan reagen sel lainnya dibeli dari CASMART, Cina. Metanol dan asetonitril dari tingkat
kromatografi digunakan untuk HPLC, dan semua reagen lainnya digunakan untuk pengerjaan
dan pemurnian adalah kelas analitis.

2.2. Persiapan sampel

Morus alba (kultivar 'Yuesang 11') terpilih sebagai materi, yang banyak ditanam di Cina
selatan sebagai sayuran. Daun dikumpulkan dari pertanian mulberry dari Sericultural & Agri-
Food Research Institute provinsi Guangdong, Cina, pada September 2017. Daunnya dikeringkan
di udara dan kemudian ditumbuk sebelum diekstraksi.

2.3. Ekstraksi dan isolasi

Prosedur pemurnian dilakukan sesuai dengan literature (Ha et al., 2018). Serbuk daun
kering (8,9 kg) diekstraksi tiga kali dengan 95% EtOH (25 L) selama 5 hari pada suhu kamar.
Ekstrak terkonsentrasi di bawah tekanan tereduksi untuk menghasilkan padatan hijau gelap.
Ekstrak EtOH (1200 g) disuspensikan dalam air dan kemudian secara berurutan diekstraksi
dengan petroleum eter dan etil asetat (EtOAc), untuk menghasilkan fraksi petroleum eter (230 g)
dan fraksi EtOAc (72,4 g). Fraksi EtOAc dikenakan kolom silika gel (100-200 mesh, 2,0 kg) dan
dielusi dengan kloroform-MeOH (99: 1-80: 20) untuk menghasilkan 12 subfraksi (1–12).
Subfraksi 8 dipisahkan oleh kolom C18 dielusi dengan MeOH berair (35% -80%) untuk
menghasilkan 14 fraksi (8-1 hingga 8-14). Subfraksi 8-12 selanjutnya dipisahkan oleh HPLC
yang dilengkapi dengan kolom C18 (ukuran partikel 5-m) dielusi dengan 65% MeOH untuk
memperoleh 8-12-3.

2.4. Teknik analisis

Instrumen Bruker DRX-500 (1H NMR, 500 MHz; 13C NMR, 125 MHz, Bruker,
Rheinstetten, Jerman) digunakan untuk merekam spektrum. Aseton-d6 (δH 2.05 dan δC 29.92
ppm) digunakan sebagai kalibrasi pelarut dan pergeseran kimia. Data electrospray ionization-
mass spectrometry (ESIMS) diperoleh pada peralatan MDS SCIEX API 2000 LC / MS (MDS
Sciex, Ontario, Kanada). Kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC) dilakukan dengan cairan
Shimadzu LC-20AT chromatograph (Shimadzu Corp., Kyoto, Jepang) yang dilengkapi dengan a
Shimadzu UV detector, kolom Shimadzu-Pack PRC-ODS (20 × 250 mm, 5 μm) dan kolom
Silgreen C18 (10 × 250 mm, 5 μm). Ultra-performance liquid chromatography (UPLC)
dilakukan dengan Agilent 1260 infinity Quaternary liquid chromatograph (Agilent Technologies,
Inc., Santa Clara, AS) dengan detektor DAD, sebuah Kolom ZORBAX SB-C18 Agilent (3 × 100
mm, 1,8 μm).

2.5. Penentuan kapasitas penyerapan radikal oksigen (ORAC)

Nilai ORAC dari moracin N, resveratrol, dan quercetin adalah diukur dengan
menggunakan metode Huang et al. (2002) dan Wen et al. (2015) dengan beberapa modifikasi.
Secara singkat, pengujian dilakukan pada pembaca plat multimode (Tecan Spark ™, Swiss),
dengan menggunakan pelat 96-well berdinding hitam. Semua reagen dan sampel dibuat baru dan
diencerkan dengan 75mM dapar fosfat pada pH 7,4, dan larutan Trolox (6,25, 12,5, 25 dan 50
μM) digunakan sebagai kontrol positif. Pertama, 20 μL dari setiap sampel yang diencerkan,
standar Trolox, atau larutan buffer (kosong) ditambahkan di setiap sumur, diikuti oleh 200 μL
fluorescein 96nM garam natrium. Pelat diinkubasi selama 20 menit pada 37 ° C, sebelum
akhirnya 20 μL dari 119mM ABAP ditambahkan ke masing-masing dengan baik sebagai solusi
inisiator radikal bebas. Campuran reaksi dimasukkan ke dalam piring pembaca segera, dengan
panjang gelombang eksitasi 480 nm dan panjang gelombang emisi 520 nm. Absorbansi dicatat
setiap 90 detik selama 50 siklus setelah 5 detik bergetar. Nilai ORAC dihitung dari regresi linier
antara area di bawah kurva (AUC) dan Konsentrasi Trolox, dan akhirnya dinyatakan sebagai
Trolox setara.

2.6. Penentuan aktivitas pemulungan radikal DPPH

Kapasitas pemulungan terhadap 2,2-difenil-1-pikrililhidrazil (DPPH) dari moracin N,

resveratrol, dan quercetin dievaluasi oleh menggunakan metode yang dijelaskan sebelumnya
(Wen et al., 2017) dengan beberapa modifikasi. Singkatnya, 200 μM DPPH dalam metanol
disiapkan larutan aqeous asam segar dan asam askorbat (6,25, 12,5, 25 dan 50 μM) dipersiapkan
sebagai kontrol positif. Sampel dilarutkan dalam metanol dan diencerkan dengan tepat sesuai
dengan aktivitas mereka di awal percobaan, dan lima konsentrasi sampel yang berbeda akhirnya
diuji. Konsentrasi akhir moracin N adalah 10–60 μM, 10–400 μM untuk resveratrol, dan 2,5–50
μM untuk quercetin. 100 μL sampel yang diuji dicampur dengan 100 μL larutan DPPH dalam
96-well plate. Sampel dicampur dengan metanol ditetapkan sebagai kosong. Setelah inkubasi 30
menit pada suhu kamar dalam gelap, absorbansi diukur pada 510 nm. Nilai IC50 dihitung pada
aktivitas pembersihan melawan radikal DPPH.

2.7. Budidaya sel

 Sel karsinoma hepatoseluler manusia (HepG2) diperoleh dari laboratorium Animal
Center, universitas Sun Yat-Sen, Cina. HepG2 sel dikultur dalam medium William E (WME)
bersama dengan 5% FBS (Gibco Life Technologies, Grand Island, NY), 50 unit / mL penisilin,
2mM L-glutamin, 100 μg / mL gentamisin, 10mM Hepes, 50 μg / mL streptomisin, 5 μg / mL
insulin, dan 0,05 μg / mL hidrokortison, dipertahankan pada 37 ° C dalam inkubator CO2 5%.
Sel HepG2 antara baris 18 dan 22 digunakan untuk tes aktivitas. 10–400 μM untuk resveratrol,
dan 2,5–50 μM untuk quercetin. 100 μL dari sampel yang diuji dicampur dengan 100 μL larutan
DPPH dalam 96-well piring. Sampel dicampur dengan metanol ditetapkan sebagai kosong.
Setelah 30 menit inkubasi pada suhu kamar dalam gelap, absorbansi diukur pada 510 nm. Nilai
IC50 dihitung pada aktivitas pembersihan melawan radikal DPPH.

2.8. Uji aktivitas antioksidan sel (CAA)

Uji CAA dilakukan dengan menggunakan protokol di lab kami sendiri (Wen et al., 2017).
Secara singkat, sel-sel HepG2 diinokulasi pada 6 × 104 sel / sumur di piring 96 sumur. Kira-kira
setelah pembibitan di 37 ° C selama 24 jam, media pertumbuhan kemudian dihilangkan dan
masing-masing sumur dicuci dengan 100 μL buffer fosfat (PBS). Setelah itu, sumur diperlakukan
dengan 100 μL media WME yang mengandung sampel dan 50 μM 2,7-diacetate
dichlorofluorescin (DCFH-DA). Setelah inkubasi 1 jam, medium telah dihilangkan, dan pelat 96
sumur dirawat dengan mencuci PBS atau tanpa mencuci PBS. Setelah dirawat dengan oksidan-
suplemen sedang (HBSS dengan 10mM HEPES, 600 μM ABAP), 96- pelat sumur ditempatkan
ke pembaca plat multimode. Fluoresensi direkam setiap 5 menit selama 1 jam pada 37 ° C
dengan panjang gelombang emisi 538 nm dan panjang gelombang eksitasi 485 nm. Setelah
pengurangan nilai latar belakang dan fluoresensi awal, maka area di bawah kurva untuk
fluoresensi versus waktu terintegrasi untuk menghitung Nilai CAA sebagai berikut:

Dalam persamaan ini, ∫ SA adalah area terintegrasi di bawah fluorescencetime kurva

sampel, dan ∫ SA mewakili area terintegrasi di bawah kurva kontrol. Dengan mengacu pada
persamaan regresi dari konsentrasi dan nilai CAA, nilai EC50 dan setara kuersetin dihitung.

2.9. Uji sitotoksisitas dan aktivitas antiproliferatif

Uji sitotoksisitas dan aktivitas antiproliferatif dari moracin N, resveratrol, dan kuersetin
diukur terhadap sel HepG2. Itu uji sitotoksisitas dilakukan dengan menggunakan metode
pewarnaan MTT seperti yang dijelaskan sebelumnya (Wen et al., 2014). Secara singkat, media
pertumbuhan itu mengandung sel-sel yang diunggulkan di piring 96-well pada kepadatan 5 × 103
sel / baik. Setelah diinkubasi selama 24 jam pada 37 ° C, pertumbuhan medium dihilangkan, dan
sumur dicuci dengan 100 μL PBS. Setelah itu, media tumbuh mengandung senyawa pada
berbagai konsentrasi telah ditambahkan, dan sumur-sumur itu menambahkan media tanpa
senyawa yang diuji berfungsi sebagai kontrol. Setelah inkubasi selama 24 jam, 10 μL larutan
MTT (5 mg / mL) ditambahkan ke piring, dan piring kemudian diwarnai selama 4 jam pada 37 °
C. Solusi pewarnaan telah dihapus dari masing-masing sumur, dan formazan dilarutkan dalam
DMSO sebelumnya mengukur absorbansi pada 570 nm.

Nilai absorbansi sampel dibandingkan dengan kontrol, dan hasilnya dinyatakan sebagai
konsentrasi penghambatan 50% (IC50), yang didefinisikan sebagai konsentrasi sampel yang
menghambat 50% sel kelayakan kontrol. Sitotoksisitas masing-masing sampel terhadap kanker
sel dihitung sebagai berikut:

Dalam persamaan ini, As berarti absorbansi sumur yang mengandung sampel, dan Ac
berarti absorbansi sumur dalam kelompok kontrol. Untuk uji aktivitas antiproliferasi terhadap sel
kanker, percobaan dilakukan mengikuti protokol kami sebelumnya (Wen et al., 2014).
Singkatnya, sel-sel HepG2 diunggulkan dengan kepadatan 5 × 103 sel / sumur dalam lempeng
96-sumur. Media pertumbuhan dihapus setelah sel-sel melekat pada sumur, dan kemudian sumur
dicuci dengan PBS. Media pertumbuhan dengan konsentrasi analit yang berbeda ditambahkan.
Sumur-sumur tersebut ditambahkan dengan media yang tidak mengandung sampel sebagai
kontrol. Sel-sel diinkubasi selama 72 jam pada 37 ° C sebelum pewarnaan. Itu langkah-langkah
berikut adalah sama seperti yang dijelaskan dalam tes sitotoksisitas. Setiap sampel diukur
setidaknya tiga kali, dan antiproliferatif Kegiatan dihitung sebagai berikut:

2.10. Analisis kimia kuantum

Sifat kimia kuantum dari moracin N dan resveratrol adalah dianalisis. Energi ikatan-
disosiasi O – H, ΔE antara LUMO orbital dan HOMO orbital, dan logP (partisi oktanol / air
koefisien) ditentukan dengan menggunakan perangkat lunak Hyperchem 8.0.10. Untuk
mensimulasikan konformasi molekul senyawa yang diuji, Algoritma MM + (Molekul mekanika
+) dan AM1 semi-empiris algoritma digunakan.

2.11. Analisis statistik

Uji rangkap tiga dilakukan untuk pengukuran semua parameter. Hasilnya dinyatakan
sebagai mean ± standar deviasi dan menjadi sasaran analisis varians oleh perangkat lunak
analisis statistik SPSS, versi 22 (IBM, New York, AS). Perbedaan paling signifikan adalah
ditetapkan sebagai P <0,05.