sebesar 58%, dari 42,7 mg / L menjadi 63,2 mg / L (Runguphan dan Keasling, 2014).

Selain itu,
ACC1 telah dilaporkan secara tertulis diatur dalam koordinasi dengan bio-sintesis fosfolipid oleh
faktor regulasi positif dan negatif dan fosforilasi oleh protein kinase Snf1 menonaktifkan ACC1
yang dimurnikan (Shi et al, 2014) Dengan menghapuskan peraturan posttranslasional ACC1
melalui mutagenesis terarah-situs, yang disarankan berfungsi sebagai situs fosforilasi yang
diakui oleh Snf1, aktivitas ACC1 meningkat secara signifikan dan tingkat produksi asam lemak
meningkat (Shi et al, 2014)

Pada bakteri dan sel tanaman, malonyl-CoA dapat dihasilkan melalui kondensasi asam malonat
dan CoA oleh malonyl-CoA synthetase (Chen dan Tan, 2013; Wang et al., 2014) Ekspresi
berlebihan dari tanaman malomyl-CoA synthetase (AAE 13) dalam Serevisiae menghasilkan
Peningkatan 1,6 kali lipat dalam kandungan lipid, yang menunjukkan bahwa memasok malonil-
CoA yang cukup adalah titik awal yang kritis untuk rekayasa jalur biosintesis asam lemak (Wang
et al, 2014).

Ketika kedua bahan awal asetil-KoA dan malonil-KoA hadir, kompleks asam lemak sintase
(FAS) bertanggung jawab untuk perpanjangan berikutnya dan pembentukan akhir asil-CoA
Dalam S. cerevisiae, FAS terdiri dari dua subunit -identik, yang dikodekan oleh gen FAS1 dan
FAS2, dan mereka menunjukkan beberapa fungsi. Ekspresi berlebih dari FAS1 dan FAS2 di S
cerevisiae berhasil mengarahkan pool asetil-KoA dan malonil-CoA menuju jalur biosintesis
asam lemak. Dibandingkan dengan strain tipe liar, strain dengan strain berlebih FAS berbasis
plasmid terbukti memiliki peningkatan 30% dalam konten lipid, dari 42,7 mg / L hingga 70 6
mg / L (Runguphan dan Keasting 2014)

Ketika kedua bahan awal sehingga facetyl-CoA dan malonyl-CoA hadir, kompleks fatty acid
synthase (FAS) bertanggung jawab atas longasi sub sekuens dan pembentukan akhir asil-CoA.
Dalam S. cerevisiae, FAS terdiri dari dua subunit yang tidak identik, yang dikodekan oleh gen
FAS1 dan FAS2, dan mereka menunjukkan beberapa fungsi. Ekspresi berlebihan FAS1 dan
FAS2 dalam S. cerevisiae berhasil mengarahkan kumpulan asetil-KoA dan malonil-CoA menuju
jalur biosintesis asam lemak. Dibandingkan dengan strain tipe liar, strain dengan ekspresi FAS
berbasis plasmid terbukti memiliki peningkatan 30% dalam konten lipid, dari 42,7 mg / L
menjadi 70,6 mg / L (Runguphan dan Keasling, 2014).

Ekspresi berlebih dari ACC1 bersama-sama dengan FAS1 dan FAS2 di S. cerevisiae ditunjukkan
untuk mengakumulasi konten lipid ke tingkat yang jauh lebih tinggi. Karena ACC1 dan FAS1 /
FAS2 memiliki gen yang relatif besar, ekspresi simultan gen-gen ini dengan metode berbasis
plasmid menjadi sulit. Dengan demikian, untuk menggantikan promotor gen asli dengan
promotor konstitutif yang lebih kuat bisa menjadi pilihan yang baik untuk mengatur kegiatan
mereka (Nevoigtetal., 2006). Promotor TEF1 (PTEF1) adalah promotor konstitutif yang kuat,
dan digunakan untuk menggantikan masing-masing promotor asli ACC1, FAS1 dan FAS2.
Dengan melakukan hal itu, strain ragi yang direkayasa meningkatkan biosintesis asam lemak
lebih lanjut, dan strain ini berhasil digunakan sebagai strain inang untuk peningkatan produksi
asam lemak dan turunan asam lemak.

Pertimbangan penting selama jalur biosintesis asam lemak adalah efek umpan balik asetil-KoA.
Dalam S. cerevisiae, produk langsung yang dihasilkan oleh kompleks FAS, asil-CoA,
menghasilkan penghambatan umpan balik. Salah satu strategi yang efisien untuk mengatasi
masalah ini adalah mengarahkan asil lemak-CoA yang menghambat produksi asam lemak bebas,
baik dengan mengekspres berlebihan asil-asilcarrierprotein (ACP) endogen atau dengan
memperkenalkan tioesterase asil-CoA heterolog. Strategi lain adalah untuk memperkuat jalur
biosintesis TAG, untuk memungkinkan asil-CoA yang diprogram dalam bentuk TAG, oleh
karena itu, mengurangi konsentrasi seluler dari lemak asil-CoA. Ekspresi asil-CoA: diacyl
glycerol acyl transferase (DAGAT), bertanggung jawab untuk terminal dan langkah-langkah
pembatas laju TAGsintesis dengan kondensasi Asil-CoA dan diacylglycerol, menghasilkan
peningkatan kandungan lipid yang signifikan (Moraetal, 2012; Kamisaka et al ., 2013). Dengan
menggabungkan ekspresi berlebih DAGAT dengan jalur rekayasa yang dijelaskan di atas, di
mana promotor asli ACC1, FAS1 dan FAS2 masing-masing digantikan oleh promotor TEF1,
total produksi asam lemak meningkat dari 42,7mg / L menjadi 171,5mg / L, yang merupakan
302% meningkat dibandingkan dengan strain tipe liar (Runguphan dan Keasling, 2014).

3.3. Penataan jalur katabolik asam lemak

Strategi lain untuk meningkatkan kadar produksi asam lemak di S. cerevisiae adalah melalui
regulasi jalur kataboliknya; dengan kata lain, untuk memblokir terjadinya oksidasi β. POX1
berperan penting dalam oksidasi asam lemak β, dan penghapusannya menghambat pertumbuhan

S. cerevisiae dalam media kultur dengan asam oleat sebagai sumber karbon tunggal (Chen etal.,
2014a). Namun, penelitian menunjukkan bahwa

penghapusan POX1 tidak mengubah total isi lipid secara signifikan (Valle-Rodríguezetal., 2014).
Kandungan lipid dari strain yang direkayasa dengan ACC1, FAS1 dan FAS2 yang dimodifikasi
bersama dengan penghapusan POX1 atau PXA2 bahkan lebih rendah dari pada strain asli dengan
jalur oksidasi β normal (Runguphan dan Keasling, 2014). PXA1 dan PXA2 berfungsi sebagai
transporter untuk asam lemak rantai panjang (LCFA) dan gangguan keduanya mengakibatkan
ketidakmampuan LCFA terdegradasi melalui oksidasi β (Li dan Chen, 2014). Demikian pula,
penghapusan tunggal PXA1 atau PXA2 tidak meningkatkan prekursor asam lemak untuk
produksi biofuel, sedangkan penghapusan ganda PXA1 dan PXA2 menghasilkan peningkatan
ringan pada tingkat produk akhir (Li dan Chen, 2014).

Meskipun β-oksidasi bertanggung jawab atas penguraian asam lemak untuk menghasilkan asetil-
KoA untuk siklus TCA, disarankan bahwa modifikasi jalur ini mungkin tidak menghasilkan
strategi yang ideal untuk merekayasa sel ragi untuk meningkatkan produksi asam lemak. Namun,
beberapa makalah penelitian menemukan bahwa penghapusan β-oksidasi, bersama dengan
ekspresi berlebih dari "enzim konversi" seperti ester sintase lilin, mengakibatkan peningkatan
produksi turunan asam lemak (FAEE) (Valle-Rodríguezetal, 2014). ). Kombinasi jalur rekayasa
ini dengan blok usia jalur penyimpanan asam lemak lainnya, menyebabkan turunan asam lemak
semakin bertambah banyak.

3.4. Penataan jalur biosintesis NADPH

NADPH menyediakan pengurangan setara untuk jalur metabolisme dalam sel ragi, baik untuk
biosintesis asam lemak dan produksi turunan asam lemak. Dalam S. cerevisiae, NADPH
diproduksi terutama dari jalur pentosa fosfat (PP) dalam sitoplasma, bersama dengan keterlibatan
enzim glukosa-6-dehydrogenase, 6-phospho gluconate dehydrogenase dan NADPH iso-citrate
dehydrogenase. Produk ribulosa-5-fosfat (R-5-P) dihasilkan dari jalur PP, yang kemudian dapat
dikonversi menjadi toksilulosa-5-fosfat (X-5-P). X-5-P dilaporkan sebagai prekursor untuk jalur
fosfo ketolase (PHK), di mana dua molekul NADPH dihasilkan dari satu molekul glukosa.
Dengan demikian, jalur PHK dipilih untuk diperkenalkan di S. cerevisiae untuk meningkatkan
hasil NADPH intraseluler, untuk meningkatkan produksi lipid. Ekspresi berlebihan dari enzim
yang disebutkan di atas dalam S. cerevisiae berhasil mendorong aliran karbon menuju jalur PHK.
Kombinasi jalur PP dan jalur PHK memasok NADPH tambahan yang diperlukan untuk sintesis
asil-CoA, seperti yang ditunjukkan oleh peningkatan produksi turunan asam lemak seperti FAEE
(de Jongetal., 2014).

Pendekatan lain untuk membuat sumber tambahan NADPH dalam S. cerevisiae adalah
memperkenalkan enzim malat. Enzim malat mengkatalisasi reaksi malat dan NADPþ untuk
membentuk NADPH, yang merupakan aktivitas penting untuk pengaturan konten lipid dalam sel
ragi, terutama dalam ragi oleaginous (Zhang et al., 2007). Namun dalam ragi non-oleaginous
seperti S. cerevisiae, korelasi antara enzim malat dan akumulasi lipid lemah, karena afinitas
substrat yang rendah dari enzim (Volschenk et al., 1997). Laporan sebelumnya menunjukkan
bahwa ekspresi berlebih dari gen enzim malat dari Mucor circinelloides menghasilkan
peningkatan 2,5 kali lipat dalam konten lipid (Zhang etal., 2007) dan ekspresi berlebih dari gen
ini dalam Rhodotorulaglutinis menyebabkan peningkatan lebih dari 2 kali lipat dalam isi lipidnya
( Li etal., 2013). Namun, kecuali untuk beberapa laporan tentang efek enzim malat pada
akumulasi lipid, penelitian lain menemukan bahwa enzim ini tidak berfungsi sebagai penghasil
NADPH. Ketika enzim malat diekspresikan berlebih pada Y. lipolytica, tidak ada peningkatan
nyata dalam kandungan lipid yang diamati (Ratledge, 2014). Sampai saat ini, belum ada
penelitian yang menunjukkan hubungan antara pengaturan aktivitas enzim malat dan akumulasi
lipid pada S. cerevisiae. Oleh karena itu partisipasi enzim malat dalam jalur biosintesis asam
lemak dalam S. cerevisiae perlu diselidiki lebih lanjut.

4. Mengkonversi enzim untuk produksi turunan asam lemak

Asam lemak adalah prekursor penting untuk produksi bahan bakar dan bahan kimia yang berasal
dari asam lemak. Produksi asam lemak spesifik dan turunannya memerlukan partisipasi berbagai
enzim pengonversi dalam jalur biosintesis (Gambar 4).
Biodiesel adalah bahan bakar turunan asam lemak paling umum yang terdiri dari mono alkyl
ester sehingga asam lemak rantai panjang. FAEE merupakan salah satu komponen penting jadi
biodiesel, yang dibentuk oleh reaksi transesterifikasi antara fatty acyl-CoA dan ethanol. Wax
ester synthase (WS) (asil-CoA: alkoholasil-transferase) terutama bertanggung jawab untuk reaksi
ini. WS ada dalam mikroorganisme seperti bakteri, tumbuhan dan hewan, dan ia menerima
berbagai alkohol sebagai substrat (Shi etal., 2012). Ekspresi WS heterolog di S. cerevisiae
berhasil memungkinkan strain untuk menghasilkan FAEE langsung dari gula dalam media kultur
(de Jongetal., 2014; Valle-Rodríguezetal., 2014; Shi etal., 2012).

Fatty acyl-CoA reductase (FAR) adalah salah satu enzim pengonversi yang paling banyak
dipelajari untuk produksi turunan asam lemak. Ini dapat dibagi menjadi dua kelas khusus,
tergantung pada pembentukan produk akhir (Hellenbrand etal., 2011). Satu kelas FAR terdiri
dari enzim pembentuk aldehida, yang mengkatalisis reduksi dua asil dari lemak asil-CoA dan
menghasilkan sebagai aldehida bebas lemak produk akhir. Kelas enzim ini telah dipelajari dalam
mikroorganisme seperti bakteri, ganggang hijau dan daun tanaman (Metz etal., 2000; Willis etal.,
2011). Aldehida lemak yang dihasilkan selanjutnya dapat diubah menjadi alkohol lemak atau
alkana / alkena, dengan reduktase aldehida spesifik atau dekarbonyase aldehida. Kelas lain dari
FAR terdiri dari enzim pembentuk alkohol, yang mengkatalisis pengurangan empat elektron dari
asil lemak-CoA, dan menghasilkan produk akhir dari alkohol lemak. Proses ini mencakup dua
langkah: langkah pertama mirip dengan enzim pembentuk aldehida, di mana aldehida terbentuk.
Pada langkah kedua, zat antara aldehida direduksi menjadi alkohol lemak (Willis etal., 2011).
Kelas enzim ini telah banyak diidentifikasi pada tanaman, burung, serangga dan protozoa
(Hellenbrand etal., 2011). Telah dilaporkan bahwa kloning dan ekspresi berlebih dari FAR
pembentuk alkohol di S. cerevisiae menghasilkan produksi alkohol lemak dengan hasil yang
cukup besar (Tang dan Chen, 2015; Runguphan dan Keasling, 2014).
Fig. 4. Schematic diagram of fatty acid derivatives production by converting enzymes. WS: wax
ester synthase; FAR:fatty acyl-CoA reductase; AD: aldehyde decarbonylase; CAR: carboxylic
acid reductase; LOX:lipoxygenase; HPL:hydro- peroxidelyase.

Biosintesis alkana / alkena dapat dihasilkan dari dekarbilasi aldehida berlemak dengan panjang
rantai karbon “n-1”. Aldehyde decarbonylase (AD) terutama berpartisipasi dalam konversi
aldehida berlemak menjadi alkana / alkena dan telah diidentifikasi tanaman seperti Arabidops
adalah thaliana (Bernard etal., 2012) dan mikroba seperti Synechococcus elongatus (Schirmer et
al., 2010). Selain itu, enzim lain yang dimodifikasi juga ditemukan terlibat dalam biosintesis
alkane / alkena. Enzim sitokrom P450 pembentuk olefin baru diidentifikasi untuk dapat
mendekarboksilat asam lemak menjadi olefin akhir (alkena) (Rude et al., 2011), dan jenis I
sintetik polketida sejenis enzim yang ditemukan terlibat dalam produksi olefin alfa rantai
menengah, dalam strain Synechococcus dengan mekanisme elongasi-dekarboksilasi (Mendez-
Perez etal., 2011). Sebagian besar enzim ini telah dipelajari untuk karakteristik dan fungsinya
ketika diperkenalkan dalam Escherichia coli dan ekspresi mereka berhasil menyebabkan
produksi alkana / alkena (Choi dan Lee, 2013; Wang dan Lu, 2013; Liu etal., 2014) . Namun,
sampai sekarang, publikasi yang sangat terbatas ditemukan untuk melaporkan produksi rekayasa
alkana / alkena di S. cerevisiae. Kurangnya penyelidikan mengenai pembangunan jalur
biosintesis alkana di S. cerevisiae dapat dikaitkan dengan tantangan dari metabolisme ragi yang
kompleks, toksisitas alkana, dan efisiensi rendah produksi lemak aldehida dan / atau reaksi yang
bersaing (Zhou et al., 2014 ; Buijsetal., 2015). Penghapusan hexadecen aldehydrogenase Hfd1
bersama dengan ekspresi jalur biosintesis alkana menghasilkan biosintesis alkana rantai panjang,
yang merupakan laporan pertama untuk memblokir konversi aldehida lemak menjadi asam
lemak dan meningkatkan hasil alkana rantai panjang dalam S. cerevisiae ( Buijsetal., 2015).

Konversi asam lemak menjadi turunan asam lemak yang sesuai dengan enzim konversi yang
diuraikan di atas selalu dimulai dari bentuk yang diaktifkan sehingga asam lemak, seperti lemak
asil-CoA. Jadi aktivasi asam lemak diperlukan untuk meningkatkan produksi bahan kimia yang
diinginkan. Enzim carboxylicacid reductase (CAR) diidentifikasi dan dikarakterisasi dari
Mycobacterium marinum, untuk dapat mengubah asam lemak secara langsung menjadi aldehida
berlemak (Akhtar etal., 2013). CAR dapat menerima berbagai substrat asam lemak dan bersama-
sama dengan aktivitas reduktase aldehida lemak dan karbonil lemak aldehida, aldehida lemak
yang dihasilkan selanjutnya dapat diubah menjadi alkohol lemak dan alkana / alkena, dengan
menempuh rute yang sama seperti di atas.

Mulai dari asam lemak itu sendiri, kelompok enzim lain diidentifikasi dalam jalur hidroperoksida
penghasil aldehida, yang mengkatalisis hidroperoksidasi asam lemak tak jenuh untuk
menghasilkan aldehida lemak rantai menengah atau rantai pendek (Santino etal., 2005; Mita
etal., 2005) . Enzim yang terlibat dalam jalur ini diklasifikasikan sebagai lipoxygenase (LOX)
dan hydroperoxidelyase (HPL), dan mereka ada secara luas pada tanaman. Secara umum,
substratnya adalah asam lemak tak jenuh poli (PUFA). LOX bertanggung jawab untuk
memasukkan satu kelompok peroksi ke dalam tulang punggung PUFA, menghasilkan satu asam
hidroperoksida tak jenuh. Hidroperoksida asam tak jenuh kemudian dibelah oleh HPL, untuk
membentuk satu molekul aldehida dan satu molekul asam-okso (Feussner dan Waspreack, 2002).
Enzim dapat bertindak pada posisi atom karbon yang berbeda dari tulang punggung PUFA,
seperti asam linoleat. Aksi pada posisi atom karbon 9 (9-LOX, 9-HPL) menghasilkan
pembentukan C9-aldehida dan asam lemak C9-hidroperoksi, dan aksi mereka pada posisi atom
karbon 13 (13-LOX, 13 HPL) menghasilkan pembentukan asam lemak C6-aldehida dan C13-
hidroperoksi.