Keanekaragaman Genetika Klebsiella spp.

Terisolasi dari Tempe

berdasarkan Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus-Polymerase
Chain Reaction (ERIC-PCR)

TATI BARUS1∗, IVAN HANJAYA1, JOANITA SADELI1, BIBIANA WIDIYATI

LAY1,ANTONIUS SUWANTO1,2, ADI YULANDI1

1 Department of Biology, Faculty of Biotechnology, Atma Jaya Catholic University,

Jalan Jenderal Sudirman No. 51, Jakarta 12930, Indonesia2 Department of Biology, Faculty of
Mathematics and Natural Sciences, Bogor AgriculturalUniversity,Darmaga Campus, Bogor
16680, Indonesia

Diterima 16 Juli 2013 / Diterima 11 November 2013

Tempe adalah makanan fermentasi Indonesia yang disiapkan dengan memfermentasi

kedelai matang dehulled dengan Rhizopus oligosporus. Banyak jenis bakteri juga terlibat
selama fermentasi tempe, dan salah satunya adalah Klebsiella spp. Beberapa isolat dari K.
pneumoniae menghasilkan vitamin B12 dalam tempe tetapi juga diklasifikasikan sebagai
patogen oportunistik. Untuk ini alasan Klebsiella spp. dalam tempe penting untuk
dipelajari. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk menyelidiki keragaman genetik dari
Klebsiella spp. dari tempe menggunakan metode ERIC-PCR. Enam puluh satu isolat
Klebsiella telah diisolasi dari enam belas produsen tempe di Bogor, Jakarta, Malang,
Tengerang, Bandung dan Cianjur. 63F dan 1387R primer digunakan untuk memperkuat
urutan 16S rDNA, dan primer 1R dan 1F digunakan untuk analisis ERIC. Hasil dari
penelitian ini menunjukkan bahwa enam puluh satu strain Klebsiella dikelompokkan
menjadi 17 kelompok. Berdasarkan analisis ERIC-PCR, isolat Klebsiella dapat
dikelompokkan ke dalam profil yang berbeda yang beberapa dari kelompok-kelompok ini
terdiri dari isolat dengan identik Profil ERIC-PCR. Beberapa profil ERIC-PCR yang
identik ditemukan dalam tempe dari produsen yang sama. Disana ada tidak ada korelasi
yang diamati antara kemiripan genetik di antara isolat dengan asal tempe.

Keywords: Tempe, Klebsiella, ERIC-PCR, vitamin B12

___________________________________________________________________________
 PENGANTAR

Tempe adalah makanan kedelai yang difermentasi secara tradisional dari Indonesia, dan itu
adalah protein penting sumber untuk bahasa Indonesia. Tempe bagus untuk kesehatan karena
mengandung senyawa penting seperti isoflavon (Ikehata et al. 1968) dan vitamin B12(Keuth &
Bisping 1993; Wiesel et al. 1997). Liem et Al. (1977) melaporkan bahwa tempe Indonesia,
sebuah protein - makanan vegetarian yang kaya, adalah salah satu daging pertama di dunia
analog. Karena itu, tempe telah populer di Indonesia Jepang, AS, Australia, dan Eropa
(Aderibigbe & Osegboun 2006).
Umumnya, vitamin B12 hanya dapat ditemukan di makanan yang berasal dari hewan, oleh
karena itu vitamin B12 dalam tempe sangat penting sebagai sumber vitamin B12 untuk orang-
orang tertentu seperti vegetarian. Satu jenis bakteri yang memiliki kemampuan mensintesis
vitamin B12 dalam tempe adalah K. pneumoniae (Keuth & Bisping 1993). Telah dilaporkan
bahwa Klebsiella sp. dalam tempe bisa mencapai sekitar 108 CFU / g (Mulyowidarso et al. 1989;
Mulyowidarso et al. 1990; Barus et al. 2008).
Kehadiran dari K. pneumoniae dalam tempe adalah menguntungkan karena menghasilkan
vitamin B12. Namun, telah dilaporkan itu K. pneumoniae diklasifikasikan sebagai patogen
oportunistik (Podshun & Ullmann 1998). Sejak penelitian tentang karakteristik dari Klebsiella
spp. dalam tempe terbatas, tambahan belajar perlu dilakukan.
Enterobacterial repetitive intergenic consensus - polymerase chain reaction (ERIC-PCR)
(Wilson & Sharp 2006) sering digunakan untuk menganalisis keragaman bakteri enterik, seperti
Klebsiella spp. Karakteristik urutan ERIC adalah 126 bp, non - coding, dan melestarikan
(Versalovic et al. 1991). Itu posisi dan jumlah urutan ERIC pada bakteri bervariasi sehingga
dapat digunakan sebagai penanda genetik untuk dipelajari keragaman isolat bakteri. Sementara
itu, Metode ERIC-PCR telah berhasil dianalisis keragaman berbagai jenis bakteri, seperti
Mycobacterium tuberculosis (Sechi et al. 1998) dan Vibrio parahaemolyticus (Khan et al. 2002)
karena metodenya cepat, sensitif, dan konsisten menganalisis keragaman bakteri (Sechi et al.
1998; Huiyong et al. 2008).
Karena itu, untuk menilai genetik keragaman Klebsiella spp. dari tempe dalam penelitian ini,
Metode ERIC-PCR digunakan. Diharapkan bahwa hasil akan digunakan sebagai dasar untuk
analisis lebih lanjut itu Klebsiella spp. dari tempe.
 MATERIAL DAN METODE

Pemutaran dari Klebsiella Isolat dari Tempe. Enam puluh satu isolat Klebsiella telah
diisolasi dari tempe yang diperoleh langsung dari enam belas produsen tempe di Bogor, Jakarta,
Malang, Tengerang, Bandung, dan Cianjur. Semua isolat diuji oleh morfologi (non-motil, rod-
berbentuk, dan Gram negatif) dan uji biokimia (positif pada Voges Proskauer, sitrat, urea, dan uji
lisin dekarboksilase; dan negatif pada indole dan tes metil merah). Selanjutnya identifikasi
dilakukan berdasarkan urutan gen 16S rRNA.

Genome Isolation. Klebsiella isolat adalah dibiakkan dalam medium Luria-Broth (Oxoid,
Hampshire, Inggris) semalam pada 37 ° C. Isolasi genom masing-masing isolat dilakukan
menggunakan Genomic Kit Pemurnian (Fermentas, Lithuania) berdasarkan pada protokol
produsen dengan sedikit modifikasi. Modifikasinya adalah pada kecepatan sentrifugasi (13.000 x
g), dan penambahan larutan lisis 500 mL. DNA genom yang didapat disimpan pada -20 Hai C
freezer untuk penggunaan lebih lanjut.

Amplifikasi Urutan Gen 16S rRNA. Dua primer spesifik digunakan untuk memperkuat
16S rDNA urutan, yaitu 63F (TACC GTA 5'-CAG CAC ATG CAA GTC-3 ‘) dan 1387R (5'-
GGG CGG WGT GTA CAA GGC-3 ’) (Marchesi et al. 1998). Amplifikasi urutan gen 16S rRNA
dari Klebsiella isolat dilakukan di GeneAmp® PCR System 2700 (Terapan Biosystems, Carlsbad,
CA, AS). PCR master mix (25 μL) yang ada 12,5 mL Go Taq (Promega, Madison, USA), 2 mL
primer (25 pmol mL-1), 8,5 mL nuklease gratis air (Promega, Madison, USA), dan 2 mL
Template DNA. Kondisi PCR adalah sebagai berikut: pra-denaturasi pada 94 Hai C selama 5
menit, denaturasi pada 93 Hai C selama 30 detik, anil pada 62 Hai C selama 30 detik, ekstensi
pada 72 Hai C selama 30 menit, dan pasca-ekstensi jam 72 Hai C selama 10 menit. Denaturasi,
annealing, dan ekstensi dilakukan dalam 35 siklus. PCR produk diamati menggunakan
elektroforesis 1,8% gel agarose (Promega, Madison, USA) kemudian ternoda dengan ethidium
bromide (Sigma-Aldrich, USA) untuk 15 menit dan ditakdirkan selama 5 menit sebelum
divisualisasikan Transilluminator UV menggunakan 1 kb ladder (Fermentas, Lituania) sebagai
penanda. Produk PCR kemudian sebagian diurutkan di Macrogen Inc., Republic of Korea.

ERIC Sequence Amplification. Amplifikasi urutan ERIC dari Klebsiella isolat adalah
dilakukan di GeneAmp PCR System 2700 (Terapan Biosystems, Carlsbad, CA, USA)
menggunakan primer universal yang terdiri dari Primer 1R 5'- ATGTAACGT CCTG G
GGATTCAC-3 ‘dan primer JIKA 5 'AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3' (van der Zee et al .
2003; Huiyong et al. 2008). Master PCR campuran (25 μL) mengandung 12,5 mL GoTaq
(Promega, USA), 9.5 mL Air Tanpa Nuclease (Promega, Madison, USA), 1 uL masing-masing
primer (25 pmol mL -1), dan 1 mL template DNA. Kondisi PCR adalah sebagai berikut: pra-
denaturasi 94 Hai C selama 2,5 menit, 94 Hai C denaturasi selama 30 detik, annealing 47 Hai C
selama 1 menit, ekstensi 72 Hai C selama 1 menit, pasca-ekstensi 72 Hai C untuk 4 menit, dan
tahan 4 Hai C. Denaturasi, annealing, dan ekstensi dilakukan dalam 35 siklus. PCR produk
diamati menggunakan elektroforesis 1,8% gel agarose (Promega, Madison, USA), diwarnai
dengan ethidium bromide (Sigma-Aldrich, USA) selama 15 menit, dan kemudian ditaklukan
selama 5 menit. Transilluminator UV digunakan untuk memvisualisasikan DNA dalam
elektroforesis gel menggunakan 1 kb ladder (Fermentas, Lithuania) sebagai spidol Berdasarkan
data biner dari profil ERIC, pohon filogenetik dibangun menggunakan MEGA 5 perangkat lunak
(Tamura et al. 2011).

HASIL

Enam puluh satu isolat Klebsiella spp. adalah dipilih secara acak dari tempe yang diambil
langsung dari banyak produsen tempe (Tabel 1). Itu isolat coloni dari Klebsiella mukoid merah
jambu media MCA, non-motil, berbentuk batang, dan Gram- negatif. Berdasarkan uji biokimia,
isolat Klebsiella positif pada Voges Proskauer, sitrat, urea, dan uji dekarboksilase lisin; dan
negatif tes indol dan metil merah.

Tabel 1. Enam puluh satu isolat Klebsiella dari tempe

JURNAL

Sebanyak 15 isolat dari Klebsiella spp. dari Tabel 2 telah dipilih secara acak untuk lebih
lanjut identifikasi berdasarkan urutan 16S rDNA. Sequencing 16S rDNA berhasil dilakukan.
Berdasarkan BLASTN, urutan parsial 16S rRNA gen (sekitar 800 hingga 940 nukleotida)
menunjukkan tinggi kesamaan dengan Klebsiella spp. dengan maksimal identitas untuk setiap
isolat mulai dari 97 hingga 100% dengan E-value 0 (Tabel 2). ERIC urutan 61 Klebsiella isolat
memiliki telah berhasil diperkuat menggunakan ERIC 1R dan ERIC 1F primer (Gambar 1
sebagai representatif dari ERIC-PCR). Visualisasi profil ERIC-PCR menunjukkan bahwa
beberapa dari mereka memiliki genetik yang beragam.

Tabel 2. Hasil BLASTN dari sekuens gen parsial 16S rRNA dari beberapa Klebsiella
diisolasi dari tempe.

JURNAL

Gambar 1. Sidik jari DNA dari beberapa Klebsiella spp. diisolasi dari tempe yang dihasilkan
oleh ERIC- PCR. M, penanda 1 kb tangga (Fermentas).

JURNAL

seperti mengisolasi 1, 2, dan 5. Ini ditunjukkan oleh perbedaan jumlah dan ukuran ERIC
urutan ditemukan di masing-masing isolat. Jika tidak, beberapa mereka tidak beragam seperti
mengisolasi 21, 22, 24, dan 25. Hanya ada dua profil ERIC yang sering ditemukan di masing-
masing isolat (0,25 dan 0,75 kb). Pohon filogenetik sebagai representasi dari keragaman genetik
Klebsiella spp. berhasildibangun (Gambar 2). Enam puluh satu isolat Klebsiella sp. muncul untuk
membentuk 16 kelompok. Beberapa dari isolat ini memiliki beragam genetik dan beberapa dari
mereka tidak beragam. Posisi yang sama.

isolat telah ditunjukkan dalam kelompok yang sama(Gambar 2). Sepuluh isolat pada Tabel 2
serupa dengan K. pneumoniae berdasarkan urutan 16S rDNA. ERIC- Profil PCR sepuluh K.
pneumoniae juga beragam. Pada Gambar 2, isolat ini ditemukan tersebar pada enam kluster yang
berbeda, yaitu: kluster 4 (221 isolat), klaster 7 (135 isolat), klaster 9 (isolat 339, 219), klaster 10
(50 isolat), klaster 13 (isolat 59, 52, 51), dan klaster 14 (isolat 305, 157).

Tempe berhasil dibuat dalam kondisi steril menggunakan Klebsiella sp. dan Rhizopus sp.
Klebsiella sp. membuat pH perendaman air kedelai menurun dari tujuh menjadi sekitar empat jam
setelah 24 jam berendam. Pada kondisi ini Rhizopus sp. tumbuh dengan baik tempe yang
dihasilkan itu bagus. Namun demikian, pH air perendaman kedelai yang tidak melibatkan
Klebsiella sp. sekitar enam setelah 24 jam perendaman. Dalam kondisi ini, Rhizopus sp. tidak
tumbuh dan menyebabkan kerusakan kedelai (Gambar tidak ditampilkan).

DISKUSI
Genom dari masing-masing isolat Klebsiella diisolasi menggunakan Genomic DNA
Purification Kit (Fermentas, Lituania) sesuai prosedur tetapi dengan a sedikit modifikasi.
Modifikasi termasuk sebuah perubahan kecepatan sentrifugasi dari 10.000 × g hingga 13.000 × g
selama 10 menit dan penambahan lisis larutan dari 400 mL hingga 500 mL. Modifikasi ini dapat
meningkatkan kualitas lisis dan pemisahan isolat Exopolysaccharide (EPS) dari Klebsiella.
Klebsiella menghasilkan EPS yang mengandung asam kolanat, clavan, dan fukogel (Domenico et
al. 1994) demikian menghambat isolasi genomik. Namun, dengan ini modifikasi, Klebsiella
genom berhasil terpencil.

Penelitian sebelumnya telah melaporkan hal itu Klebsiella adalah salah satu jenis bakteri
yang terlibat dalam fermentasi (Keuth & Bisping 1993; Barus et al. 2008) dan produksi vitamin
B12 dan B6 (Keuth & Bisping 1993) dalam tempe. Hasil dari penelitian ini menunjukkan itu
Klebsiella juga memiliki peran dalam prosesnya keasaman selama perendaman kedelai dalam
tempe fermentasi. Klebsiella dapat menurunkan pH menjadi sekitar 4. Barus et al. (2008)
melaporkan bahwa selama perendaman, air rendaman kedelai akan sangat drastismenurunkan pH
dari 7 menjadi 4. Kondisi ini adalah sebuah faktor penting untuk mendukung pertumbuhan
Rhizopus. Pengasaman dalam pembuatan tempe Indonesia terjadi secara alami, yaitu. oleh
bakteri, sementara di produksi tempe di negara lain, seperti Belanda dan Amerika Serikat,
pengasamannya dilakukan dengan penambahan asam organik.

Meskipun sudah diketahui itu Klebsiella memiliki peran dalam memproduksi vitamin B12
dan pengasaman, ini masih membutuhkan karakterisasi lebih lanjut. Sebagai contoh, ada
kebutuhan untuk menilai perbedaan antara tidak patogen Klebsiell dan Klebsiella bahwa bersifat
patogen bagi manusia. Harus ada juga penilaian potensi intra-spesies Klebsiella untuk
memproduksi vitamin B12 dalam tempe. Ini informasi sangat penting tidak hanya untuk
keamanan pangan tetapi juga untuk peningkatan kualitas tempe.

Penelitiannya telah diidentifikasi Klebsiella berdasarkan sifat morfologis, biokimia, dan

molekuler. Identifikasi morfologis dan biokimia menunjukkan hasil yang sama dengan
identifikasi molekuler berdasarkan urutan gen 16S rRNA. Selanjutnya, keragaman genetik
Klebsiella telah berhasil dianalisis oleh ERIC-PCR.

Isualisasi ERIC-PCR (Gambar 1) memiliki menunjukkan adanya perbedaan dalam jumlah

dan ukuran profil ERIC-PCR. Meacham(2003) melaporkan bahwa perbedaan dalam angka dan
ukuran profil ERIC-PCR menggambarkan keragaman genetik di antara isolat bakteri. Berbasis
pada profil ERIC-PCR, pohon filogenetik itu menggambarkan keragaman genetik Klebsiella
punya telah berhasil dibangun. Gambar 2 menunjukkan itu 61 isolat dari Klebsiella spp.
membentuk 16 klaster. Setiap cluster memiliki profil ERIC yang berbeda yang menggambarkan
keragaman genetik Klebsiella spp. Hasil dari penelitian ini juga menunjukkan adanya genetik
keragaman dalam intraspesies K. pneumoniae. Ini ditunjukkan oleh isolat 50, 52, 135, 59, 157,
51, 305, 339, 219, 221 yang mirip dengan K. pneumoniae (Meja 2). Namun, pada Gambar 2 ini
isolat ditemukan tersebar pada enam berbeda kelompok.

Tidak ada korelasi positif antara asal isolat dengan keragaman genetik. Sebagai contoh,
cluster 1 terdiri dari Klebsiella isolat yang berasal dari Jakarta (8, 12, 14, 15 isolat), Bogor (133,
210, 211, 215, 225, 233 isolat), Bandung (16, 17 isolat), dan Cianjur (20 isolat). Hasil dari studi
ini menunjukkan itu Klebsiella strain dari satu lokasi menyebar ke beberapa kluster (Gambar 2).
Untuk contoh Klebsiella isolat dari Jakarta bisa ditemukan di klaster 2, 4, 6, 9, 10, 11, dan 15.
Dengan demikian, itu dapat disimpulkan bahwa strain Klebsiella dalam tempe secara genetik
beragam. Kami sedang mengidentifikasi isolat tertentu yang akan memainkan peran penting
dalam produksi vitamin B12.

Gen 16S rRNA dari sepuluh isolat telah diurutkan (Gambar 1). Keragaman genetik 10 isolat
dari Klebsiella telah dibandingkan berdasarkan Urutan 16S rRNA dengan ERIC sequences (data
tidak ditunjukan). Hasilnya menunjukkan bahwa ERIC-PCR urutan lebih diskriminatif dari 16S
rRNA urutan. Oleh karena itu, profil ERIC-PCR telah digunakan untuk mempelajari
heterogenitas genetik dari banyak tipe bakteri (Dalla-Costa et al. 1998; Waturangi et al. 2012).

PENGAKUAN

Penelitian ini didukung oleh Competitive Program Hibah dari Direktorat Jenderal Tinggi
Pendidikan-Indonesia.