2.

IDENTIFIKASI BAKTERI PADA SPESIMEN SPUTUM

TUJUAN PRAKTIKUM
Mahasiswa mampu melakukan analisis dan serangkaian uji untuk mengidentifikasi kuman yang
diperoleh dari spesimen sputum

TINJAUAN PUSTAKA
Sputum merupakan mukus yang dihasilkan dari paru-paru dan dapat ditemukan berada
pada saluran pernafasan bawah. Sputum ini dapat mengakibatkan batuk, susah bernafas, dan
dapat pula menjadi tempat yang baik bagi bakteria. Jika pasien mengalami gejala ini maka dokter
akan merekomendasikan untuk dilakukan pemeriksaan kultur sputum. Kultur sputum digunakan
untuk mengidentifikasi bakteri yang menyebabkan infeksi paru-paru seperti pneumonia atau
tuberculosis, untuk mengidentifikasi antibiotik yang tepat untuk pengobatan serta untuk melihat
efektifitas pengobatan yang dilakukan.
Sampel sputum yang diperoleh dapat pula tidak steril yang berarti bahwa selain bakteri
patogen yang mengakibatkan infeksi saluran pernafasan juga terdapat pula bakteri non patogen
yang terdapat pada mulut atau tenggorokan. Identifikasi yang dilakukan untuk dapat
membedakan bakteri patogen dan non patogen (flora normal). Bakteri patogen yang dapat
terdeteksi dengan kultur sputum diantaranya Streptococcus pneumoniae, Haemnophilus
influenzae, Staphylococcus aureus, Klebsiella species, Mycobacterium tuberculosis. Sedangkan
flora normal yang dapat ditemukan pada kultur sputum adalah Neisseria catarrhalis, diphtheroid,
alpha-hemolytic streptococci serta staphylococci.
Infeksi yang didefinisikan sebagai keadaan masuk dan berkembangnya agen infeksi ke
dalam tubuh manusia (host) sehingga menimbulkan perubahan atau kerusakan pada tubuh host,
akan menimbulkan keluhan penderita yang disertai gejala klinik. Infeksi saluran nafas pada
manusia dapat dibagi menjadi infeksi saluran nafas atas dan saluran nafas bawah. Infeksi saluran
napas atas meliputi infeksi yang menyerang daerah hidung, faring, dan laring. Sedangkan infeksi
saluran napas bawah meliputi infeksi pada daerah trakea, bronkus, bronkiolus serta alveolus.
 Gambar 1. Organ-orang yang terlibat dalam infeksi saluran nafas atas dan bawah
Penyebab infeksi saluran nafas bawah bisa berasal dari berbagai macam mikroorganisme
seperti virus, bakteri atau jamur. Dalam ruang lingkup bakteriologi infeksi saluran nafas bagian
bawah disebabkan oleh :
1. Mikroorganisme Non spesifik
-Bakteri gram positif : Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus dan
Streptococcus pyogenes
- Bakteri gram negatif : Haemophilus influenzae, Klebsaiella pneumoniae, Pseudomonas
aeruginosa, Proteus species, Yersina pestis dan juga Moraxella catarrhalis
2. Mikroorganisme Spesifik: Mycobacterium tuberculosa.

SPESIMEN SPUTUM
Berdasarkan waktu pengumpulannya sputum dibedakan menjadi tiga macam, yaitu :
▫ Dahak semalam : dahak yang dikumpulkan selama 24 jam dirumah penderita
▫ Dahak pagi : dahak yang dikeluarkan penderita pada waktu bangun pagi
▫ Dahak sewaktu : dahak yang dihasilkan oleh penderita pada saat datang ke
laboratorium.
▫ Dahak SPS : Singkatan dari Sewaktu-Pagi-Sewaktu, yaitu dahak yang
dikumpulkan secara berturut-turut pada waktu datang ke
laboratorium, bangun pagi, dan datang ke laboratorium lagi
keesokan harinya.

Secara makroskopis sputum dibedakan menjadi

▫ Purulen : kehijauan, sebagian besar adalah pus
▫ Muco-purulen : kehijauan, dengan pus dan mukus

Fakultas Vokasi - 1
 ▫ Mukoid : sebagian besar adalah mukus
▫ Hemoptisis : sputum dalam keadaan bercampur darah
▫ Muco-saliva : mukus dengan sedikit saliva
CARA PENGAMBILAN SPESIMEN
Kualitas spesimen yang diperoleh sangat bergantung dari ketepatan cara pengambilan
dan persiapan pasien sebelum pengambilan sputum. Ada beberapa prosedur yang harus
dilakukan agar sputum yang diperoleh adekuat dan benar-benar menggambarkan kondisi
saluran nafas bagian bawah penderita yaitu sebagai berikut :

▫ Sebelum menampung sputum, pasien berkumur dahulu untuk menghindari sputum

terkontaminasi dengan sisa-sisa makanan yang ada di mulut.
▫ Jika menggunakan gigi palsu sebaiknya dilepas dahulu
▫ Pasien berdiri tegak atau duduk tegak. Setelah itu tarik nafas dalam, 2-3 kali kemudian
keluarkan nafas bersamaan dengan batuk yang kuat dan berulang kali sampai sputum
keluar. Agar sputum yang didapatkan kental dan purulen.
▫ Sputum ditampung pada wadah steril, bertutup ulir dan bermulut lebar.
▫ Pada pasien anak-anak biasanya menggunakan :
 Nasofaring swab (usapan nasofaring / tenggorok) : Sputum tertinggal pada dinding
tenggorok anak, sehingga ulasan dinding nasofaring dapat diambil sebagai sampel
sputum.
 Caughplate : Batuk langsung pada cawan / plate
 Cough Swat Technique : Caranya mulut dibuka dengan bantuan spatel, lidah ditekan
maka epiglottis terlihat, epiglotis diusap dengan swab untuk merangsang batuk.
▫ Untuk pasien susah batuk bisa dilakukan dengan sputum induksi yaitu menaikkan sekresi
bronchus dan merangsang batuk, menggunakan 10% propyline glycol.

PEMROSESAN SPESIMEN
Secara garis besar pemrosesan sputum terbagi menjadi 2 kelompok. Kelompok
identifikasi penyakit infeksi tuberkulosis (mikroorganisme spesifik)dan kelompok
identifikasi penyakit infeksi non tuberkulosis(mikroorganisme non spesifik). Pemeriksaan
spesimen meliputi pemeriksaan makroskopis berupa warna, volume, bau dan konsistensi
serta pemeriksaan mikroskopis.

Fakultas Vokasi - 2
 Sputum
Ket.
Pemeriksaan mikroskopis
R : Resisten
S : Sensitif Slide

Pengecatan
Gram
Pengecatan ZN
Direct
Gram (+) Gram (-)
BTA (?/lp) MC
BAP
Konsentrasi Sputum
Tanam ke Lowenstein-Jensen
Nutrien broth atau Ogawa Uji oksidase
Inkubasi 6 – 8 Minggu
Uji + -
katalase Mycobacterium sp
Enterobacteriaceae
(+) (-)
staphylo strept pseud Uji Laktosa
coccus ococcu oomon
Uji s Uji hemolisis as + -
koagulase
Alpha Beta Gamma
+ - Prote
Urea (+) us
(S.aureus) Uji
novobiosin K.pneumoniae sp
Yersin
Uji optochin Uji cAMP a
R Moraxella
pestis
-
S(S.epider (S.Viridans)
(S.pyogenes) catarrhalis
midis)
S
R(S.sapropyticu
(S.pnemoniae)
+ (S.agalactie) Uji gula-gula
s)

Gambar 2. Skema alur pemrosesan sampel sputum

 Pembuatan sediaan sputum dapat dilakukan dengan membuat apusan pada slide seperti
gambar 5, penamaan slide harus sesuai dengan standar yang berlaku (gambar 3). Sputum yang dipilih
bukan merupakan air liur/saliva, namun bisa menggunakan bagian yang purulen (gambar 4).
Pembuatan apusan haruslah berada pada bagian tengah objek glas (gambar 5 ) dengan ukuran sekitar
2x3cm dan bisa menggunakan lidi ataupun oose. Apusan kemudian dikeringkan di rak dan difiksasi
dengan cara dilewatkan pada bara api (gambar 7).

Gambar 3. Prosedur penulisan nomor identitas sediaan pada objek glas harus sesuai dengan BPN sebagai
contoh 02/15/237A. Setiap spesimen sputum diletakkan pada sediaan objek glas, tidak boleh digabungkan
lebih dari satu spesimen

Fakultas Vokasi - 1
Gambar 4. Prosedur mengambil spesimen sputum untuk digunakan sebagai sediaan, dipilih bagian yang
purulen (yang berdarah), tidak boleh dicampur dengan bagian air liur/lendir.

Gambar 5. Cara spesimen sputum diapuskan pada objek glas, jangan terlalu di tepi tetapi harus di tengah,
dengan ukuran 3X2 cm (bisa menggunakan lidi/tusuk gigi).

Fakultas Vokasi - 2
Gambar 6. Prosedur untuk sterilisasi Ose (jika pembuatan apusan spesimen sputum menggunakan ose).

Gambar 7. Apusan dikeringkan di atas sediaan rak, diperiksa apusan yang telah dibuat kemudian setelah
kering, difiksasi dengan pemanasan
PEWARNAAN ZIEHL NEELSEN
Identifikasi langsung (direct) untuk bakteri tahan asam adalah dengan menggunakan pewarnaan
ziehl neelsen (ZN). Pewarnaan Ziehl Neelsen ini ditemukan oleh Koch, Ehrlich, Ziehl, Rindfleisch serta
Neelsen. Prinsip dari pengecatan ini adalah untuk dapat melakukan pengecatan bakteri golongan
Mycobacterium dikarenakan kandungan lipid pada dinding sel nya yang tinggi. Komponen fenol dari
carbol fuchsin digunakan sebagai pengecatan awal dikarenakan komponen ini larut di dalam lipid (lipid
soluble) dan menetrasi dinding sel. Pengecatan dengan carbol fuchsin ini kemudian dibantu dengan
adanya pemanasan yang berfungsi untuk dapat melelehkan lapisan lilin dari dinding sel sehingga zat
warna dapat masuk ke dalam sel. Asam digunakan untuk menghilangkan pewarna pertama pada sel yang
nonacid-fast. Sedangkan pada sel yang acid-fast, pewarnaan pertama tidak hilang dengan adanya proses

Fakultas Vokasi - 3
penambahan asam. Proses selanjutnya adalah pewarnaan dengan malachite green atau methylene blue
yang mewarnai background sehingga dapat menghasilkan warna kontras. Proses pewarnaan Ziehl Neelsen
dapat dilakukan sebagaimana proses yang tergambar pada skema proses (gambar 8 dan 9).

Gambar 8. Langkah-langkah pewarnaan Ziehl Nielsen (Bakteri Tahan Asam)

Gambar 9. Pewarnaan Bakteri Tahan Asam

Setelah pewarnaan ZN dilakukan, untuk menghitung jumlah bakteri tahan asam dapat dilakukan
dengan pengamatan mikrsokopis. Jumlah lapang pandang yang digunakan dalam pengamatan adalah 100

Fakultas Vokasi - 4
lapang pandang. Arah pemeriksaan (pengamatan) lapang pandang dapat dilakukan sebagaimana yang
nampak pada gambar 10. Sediaan yang negatif harus diamati sekurang-kurangnya 5 menit.

Gambar 10. Proses pemeriksaan sediaan yang telah diwarnai ZN

Fakultas Vokasi - 5
Gambar 11. Bakteri tahan asam yang tampak berupa basil.

Pembacaan BTA sputum menggunakan skala IUATLD (International Union Against Tuberculosis
and Lung Diseases)

Tidak ditemukan BTA dalam 100 lp, disebut negatif

Ditemukan 1-9 BTA dalam 100 lp, ditulis jumlah kuman yang ditemukan
Ditemukan 10-99 BTA dalam 100 lp, disebut + atau (1+)
Ditemukan 1-10 BTA dalam 1 lp, disebut ++ atau (2+)
Ditemukan >10 BTA dlam 1 lp, disebut +++ atau (3+)
KULTUR SPUTUM
Pembiakan bakteri yang diduga M. tuberculosis dapat digunakan dengan penanaman pada media
Lowenstein- Jenses (LJ) atau Ogawa. Medium LJ, awalnya dikembangkan oleh Lowenstein dengan
menggunakan pewarna congo red dan malchite green. Kemudian Jensen memodifikasi medium
Lowenstein ini dengan menggunakan citrate dan phosphate menghilangkan penggunaan pewarna congo
red dan meningkatkan konsentrasi malachite green. Kandungan kentang dan L-aspargine sebagai sumber
nitrogen dan vitamin pada medium LJ. Sedangkan bufer yang dapat meningkatkan pertumbuhan bakteri
adalah monopotassium fosfat dan magnesium sulfat. Gliserol serta suspensi telur merupakan sumber asam
lemak dan protein yang dibutuhkan untuk metabolisme mycobacteria. Pemanasan, albumin telur akan
berkoagulasi dan dapat menjadi permukaan yang pada untuk inokulasi. Gliserol sebagai sumber karbon
merupakan sumber yang dapat meningkatkan pertumbuhan bakteri batang tubercle (human type).

Fakultas Vokasi - 6
Sedangkan malachite green dapat menjadi menghambat pertumbuhan bakteri lain selain mycobacteria.
Pembiakan M. tuberculosis membutuhkan inkubasi 6-8 minggu.
Karena didalam sputum terdapat flora normal yang berasal dari saluran nafas bagan atas dan mulut
maka sebelum spesimen ini dikultur terlebih dahulu dilakukan prosedur pemekatan-digesti-
dekontaminasi. Tiga prosedur yang banyak digunakan adalah:
1. NaOH
Berfungsi untuk mengencerkan sputum serta menghancurkan organisme pencemar dengan
NaOH 4%. Endapannya dinetralkan dengan HCl, dan jika akan diinokulasi maka suspensikan
dengan PZ steril. Waktu maksimal untuk pemrosesan dengan teknik ini adalah 30 menit. Karena
NaOH bersifat toksik untuk M. Tuberculosis
2. N-acetyl-L-cysteine-Natrium hidroksida (NALC-NaOH)
Dengan NACL-NaOH, konsentrasi NaOH yang digunakan lebih rendah sehingga kurang agresif
terhadap bakteri tuberculosis, sehingga pada saat pemrosesan tidak perlu terburu-buru. Namun
teknik ini memiliki kelemahan, yaitu waktu simpan dari NACL-NaOH yang hanya 24 jam.
3. Zephiran-trisodium fosfat
Mycobacterium dapat bertahan lebih lama dengan prosedur ini. Oleh karena itu, waktu inkubasi
dan suhu tidak terlalu penting. Pada teknik ini reagen yang digunakan adalah campuran dari
trisodium fosfat dan benzalkonium klorida 17%(Zephiran).

Tingkat kontaminasi sebaiknya 3-5%. Kontaminasi berlebih (lebih dari 5%) pada biakan
Lowenstein-Jensen biasanya menunjukkan bahwa prosedur dekontaminasinya tidak cukup efektif.
Kontaminasi < 3% menunjukkan bahwa prosedur dekontaminasi terlalu berlebihan sehingga
kemungkinan besar M.tuberculosis pada sampel gagal tumbuh.
UJI BIOKIMIA
Uji biokimia yang dapat dilakukan untuk mengidentifikasi bakteri Mycobacterium antara lain: uji
niasin, uji nitrat, uji katalase, uji hidrolisa tween 80, uji reduksi tellurite, uji arylsulfatase. Dalam
praktikum ini yang akan dilakukan adalah uji niacin. Prinsip uji niasin didasarkan pada kemampuan
Mycobacterium tuberculosis untuk memproduksi niasin (asam nikotinik). Reaksi redoks yang terjadi pada
spesies Mycobacterium dapat menghasilkan niasin sebagai bagian dari metabolisme energi. Hampir
seluruh spesies Mycobacterium memproduksi niasin namun M. tuberculosis tidak dapat memproses niasin
sehingga kelebihan niasin ini akan dikeluarkan hingga ke dalam media, yang pada akhirnya dapat
dideteksi dengan uji niasin.
Uji niasin yang konvensional memerlukan penggunaan cyanogen bromida yang merupakan bahan
kimia yang berbahaya yang telah dilarang penggunaannya di berbagai negara. Namun uji niasin masih

Fakultas Vokasi - 7
dapat dilakukan dengan menggunakan strip test. Uji niasin ini haruslah dilakukan pada kultur murni yang
telah berusia 21-28 hari dengan jumlah koloni lebih dari 50.
Uji niasin yang berupa strip test ini mengandung potassium thiosianat, chloramine T, asam sitrat,
serta 4-asam aminosalisilat. Dengan adanya asam sitrat, chloramine –T serta potassium thiosianat akan
bereaksi membentuk sianogen klorida. Sianogen klorida ini akan memecah cincin pyridin dari niacin
untuk memproduksi y-carboxy glutakonik aldehid dan bersama dengan amino aromatik akan membentuk
warna kuning. Sedangkan untuk melakukan uji niasin ini bisa dilakukan dengan prosedur yang detail
sebagai berikut:
1. Culture slant ditusuk dengan menggunakan pipet pasteur.
2. Ditambahkan 1 ml air steril
3. Tutup tabung dikencangkan kemudian letakkan secara horisontal sehingga air akan menutupi
keseluruhan permukaan media slant.
4. Inkubasi selama 30 menit
5. Kemudian slant dibalik selama 5 menit sehingga air akan mengalir ke bagian bawah tabung
6. Kemudian pindahkan 0.5 ml cairan ke dalam tabung baru yang bersih
7. Masukkan niasin strip
8. Tutup tabung
9. Inkubasi selama 15-20 menit, sembari digoyang-goyangkan
10. Perubahan warna diamati untuk melihat uji positif atau negatif.
11. Dalam melakukan uji niasin ini yang perlu diperhatikan haruslah digunakan kultur yang positif
Mycobacterium sebagai kontrol positif dan media yang tidak mengandung bakteri sebagai kontrol
negatif.
12. Perlu dipahami bahwa hasil positif tidak selalu menandakan adanya Mycobacterium tuberculosis
dikarenakan spesies Mycobacterium juga ada yang memiliki hasil positif untuk uji ini.

Sedangkan untuk uji bakteri non M. tuberculosis dapat dilakukan

dengan uji indol, motilitas, TSI, uji sitrat, uji MR-VP, uji oksidase. Uji
biokimia yang dilakukan ini untuk menentukan spesies non M. tuberculosis
yang terdapat pada spesimen sputum

Gambar 12. Uji niasin negatif (kiri), Uji niasin positif (kanan)

Fakultas Vokasi - 8
METODE KERJA
Alat dan Bahan
Hari Pertama
Pengecatan Ziehl Neelssen
Alat dan Bahan :

1. Mikroskop 7. Spesimen sputum

2. Objek Glass 8. Air

3. Ose 9. Carbol fuchsin 0.3%

4. Bunsen 10. Alkohol asam 3% (Alkohol +HCl 3%)

5. Rak Tabung 11. Methylen blue 0.3%

6. Lidi/Tusuk gigi

Cara Membuat Sediaan :

1. Bersihkan objek glas, beri label
2. Dengan tusuk gigi ambil sediaan sputum
3. Oleskan sputum secara merata jangan terlalu tebal dan terlalu tipis pada permukaan objek glas
dengan ukuran 1-2 cm.
4. Bakar tusuk gigi sebelum dibuang
5. Sediaan dibiarkan kering pada suhu kamar
6. Setelah kering, difiksasi dengan melewatkan di atas nyala api sebanyak 3X, sediaan siap untuk
diwarnai
Cara Pewarnaan ZN:
1. Sediaan dituangi Carbol Fuchsin sampai penuh
2. Panaskan selama 3-5 menit, jangan sampai mendidih
3. Biarkan dingin selama 5 menit cuci dengan air
4. Dekolorisasi dengan alkohol asam selama 10-30 detik, cuci dengan air
5. Kemudian dituangkan methylen blue selama 20-30 detik, cuci dengan air
6. Amati pada mikroskop dengan perbesaran 1000X hitung jumlah bakteri tahan asam yang tampak.
Pengecatan Gram

Fakultas Vokasi - 9
Alat dan Bahan :
1. Mikroskop 7. Spesimen sputum

2. Objek Glass 8. Air

3. Ose 9. Cat Ammonium oxalate Crystal Violet (AOCV)

4. Bunsen 10. Lugol

5. Rak Tabung 11. Aseton alkohol

6. PZ 12. Cat Safranin

Cara Kerja :
1. Persiapakan semua alat dan bahan yang dibutuhkan
2. Panaskan ose sampai red heat kemudian ambil PZ steril pada objek glass sekitar 1-2 tetes
3. Panaskan kembali ose sampai red heat lalu dinginkan. Ambil satu tetes spesimen sputum lalu
diletakkan pada objek glass. Dengan cara mencampur dengan PZ secara melingkar (dari dalam
keluar) pada objek glass
4. Keringkan sediaan dengan mengangin-anginkan (hindari memanaskan sediaan di atas bunsen
sampai over heat)
5. Setelah benar-benar kering lakukan pengecatan pada sediaan dengan AOCV selama 2 menit
kemudian bilas dengan air mengalir
6. Lanjutkan pengecatan dengan menambahkan lugol selama 2 menit, bilas air mengalir, lalu dengan
aseton alkohol selama 1 detik, dan terakhir pewarna safranin selama 30-60 detik sebagai warna
pembanding. Bilas dengan air mengalir
7. Sediaan siap diamati di mikroskop

Jika bakteri yang ditemukan adalah bakteri gram positif, selanjutnya ditanam pada
Penanaman pada Media Differensial MC
media BAP
Alat dan Bahan :
Jika bakteri yang ditemukan adalah bakteri gram negatif, selanjutnya ditanam pada
media MC

Penanaman pada media McConkey

Alat dan Bahan :

Fakultas Vokasi - 10
 1. Media Mc Conkey 1. Ose
2. Spesimen sputum 2. Rak Tabung
3. Inkubator

4. Bunsen

Cara Kerja :
1. Menyiapkan alat dan bahan
2. Flamming ose hingga red heat kemudian dinginkan
3. Ambil spesimen yang telah homongen menggunakan ose lalu lakukan strik pada media MC
4. Sterilkan mulut plate media dan segera tutup kembali
5. Inkubasi pada suhu 370C selama 1 X 24 jam pada inkubator
6. Setelah 1x24 jam, amati hasilnya
Penanaman pada media BAP

Alat dan Bahan :

1. Media BAP 3. Ose

2. Spesimen sputum 4. Rak Tabung
5. Inkubator

6. Bunsen

Cara Kerja :
1. Menyiapkan alat dan bahan
2. Flamming ose hingga red heat kemudian dinginkan
3. Ambil spesimen yang telah homongen menggunakan ose lalu lakukan strik pada media BAP
4. Sterilkan mulut plate media dan segera tutup kembali
5. Inkubasi pada suhu 370C selama 1 X 24 jam pada inkubator
6. Setelah 1x24 jam, amati hasilnya

Hari Kedua
Praktikum I : Menumbuhkan kuman di Media NAS
Alat dan Bahan : 1. Ose
2. Bunsen

Fakultas Vokasi - 11
 3.Nutrient agar slant
4. Rak Tabung
5. Koloni bakteri dari media MC
Cara Kerja :
1. Siapkan alat dan bahan
2. Panaskan ujung ose hingga memijar dan dinginkan
3. Buka tutup tabung dekatkan dengan bunsen
4. Flamming mulut tabung
5. Ambil satu koloni bakteri yang nampak tumbuh pada media MC dan BAP dengan menggunakan
ose lalu dilakukan strik secara spiral
6. Panaskan lagi mulut tabung agar tak ada bakteri kontaminan
7. Tutup tabung
8. Bakar jarum ose untuk membunuh bakteri yang tersisa
9. Lalu inkubasi pada inkubator suhu 370 selama 24 jam
Hari Ketiga
Praktikum I : Uji indol pada media triptophan
Alat dan Bahan : 1. Ose
2.Koloni kuman dari media NAS
3.Bunsen
4. Media triptophan (pepton 1%)
5. Kovac
6. Inkubator
7. Rak tabung
Cara Kerja :
1. Buka kapas lemak tutup tabung media NAS di dekat panas api bunsen lalu panaskan mulut
tabung pada media NAS
2. Red heat ose bulat di atas nyala api spirtus lalu dinginkan
3. Ambil koloni bakteri dengan ose bulat yang sudah diinginkan
4. Dengan posisi tetap dekat dengan nyala api, panaskan mulut tabung media NAS kembali lalu
tutup tabung dengan kapas lemak
5. Lalu buka kapas lemak tutup tabung media dekat nyala api dan panaskan mulut tabung media
6. Ose bulat yang sudah terdapat koloni bakteri tadi masukkan ke dalam media dengan posisi media
dimiringkan dan campur di dinding tabung

Fakultas Vokasi - 12
 7. Lalu campurkan secara merata dengan memutar-mutar tabung dengan kedua tangan kemudian
inkubasi pada inkubator suhu 370C selama 24 jam
8. Setelah diinkubasi tambahkan 3 tetes reagen kovac lalu campurkan
9. Kemudian amati, apakah terbentuk cincin merah atau tidak
Praktikum II : Uji motilitas
Alat dan Bahan : 1. Media semi solid + indikator
2. Ose Jarum
3.Bunsen
4. Koloni kuman dari NAS
5. Inkubator
Cara Kerja :
1. Buka kapas lemak tutup tabung media NAS di dekat panas api bunsen lalu panaskan mulut
tabung pada media NAS
2. Red heat ose bulat di atas nyala api spirtus lalu dinginkan
3. Ambil koloni bakteri dengan ose bulat yang sudah diinginkan
4. Dengan posisi tetap dekat dengan nyala api, panaskan mulut tabung media NAS kembali lalu
tutup tabung dengan kapas lemak
5. Lalu buka kapas lemak tutup tabung media semi solid dekat nyala api dan panaskan mulut tabung
media
6. Ose jarum yang sudah terdapat koloni bakteri tadi masukkan ke dalam media sampai 2/3 bagian.
7. Panaskan kembali mulut tabung dan tutup dengan kapas.
8. Lalu inkubasi pada inkubator suhu 370C selama 24 jam
Praktikum III : Uji Gula-gula TSI (Triple Sugar Iron)
Alat dan Bahan : 1. Media TSI
2. Ose Jarum
3. Bunsen
4. Koloni kuman dari NAS
5. Inkubator
Cara Kerja :
1. Siapakan alat dan bahan
2. Panaskan ujung ose hingga memijar dan dinginkan
3. Buka tutup tabung dekatkan dengan bunsen
4. Flamming mulut tabung

Fakultas Vokasi - 13
 5. Ambil satu ulasan bakteri dengan menggunakan ose lalu tusukkan ose ke media kemudian
lakukan strik secara spiral
6. Panaskan lagi mulut tabung agar tak ada bakteri kontaminan
7. Tutup tabung
8. Bakar jarum ose untuk membunuh bakteri yang tersisa
9. Lalu inkubasi pada inkubator suhu 370C selama 24 jam
Praktikum IV: Uji Sitrat
Alat dan Bahan : 1. Ose bulat
2. Tabung reaksi
3. Bunsen
4. Koloni kuman dari NAS
5. Agar slant yang mengandung sitrat (berwarna hijau)
6. Inkubator
Cara Kerja :
1. Siapakan alat dan bahan
2. Panaskan ujung ose hingga memijar dan dinginkan
3. Buka tutup tabung dekatkan dengan bunsen
4. Flamming mulut tabung
5. Ambil satu ulasan bakteri dengan menggunakan ose lalu tusukkan ose ke media kemudian
lakukan strik secara spiral
6. Panaskan lagi mulut tabung agar tak ada bakteri kontaminan
7. Tutup tabung
8. Bakar jarum ose untuk membunuh bakteri yang tersisa
9. Lalu inkubasi pada inkubator suhu 370C selama 24 jam
Praktikum V: Uji Urease
Alat dan Bahan : 1. Ose bulat
2. Bunsen
3. Koloni kuman dari NAS
4. Media urea berisi indikator phenol red
5. Inkubator
Cara Kerja :
1. Siapakan alat dan bahan
2. Panaskan ujung ose hingga memijar dan dinginkan
3. Buka tutup tabung dekatkan dengan bunsen

Fakultas Vokasi - 14
 4. Flamming mulut tabung
5. Ambil satu ulasan bakteri dengan menggunakan ose lalu tusukkan ose ke media kemudian
lakukan strik secara spiral
6. Panaskan lagi mulut tabung agar tak ada bakteri kontaminan
7. Tutup tabung
8. Bakar jarum ose untuk membunuh bakteri yang tersisa
9. Lalu inkubasi pada inkubator suhu 370C selama 24 jam
Praktikum VI: Penanaman pada media Glukosa Phospate untuk Uji VP (Voges Proskauer)
Alat dan Bahan : 1. Media pepton glukosa phosphate.
2. Ose
3. Bunsen
4. α nafthol 5%
5. KOH 40%
6. Koloni kuman dari NAS
7. Rak Tabung
Cara Kerja :
1. Red heat ose bulat di atas nyala api lalu dinginkan pada media agar NAS lalu ambil koloni bakteri
dengan ose bulat yang sudah didinginkan
2. Dengan posisi tetap dekat dengan nyala api, panaskan mulut tabung media NAS kembali lalu
tutup tabung dengan kapas lemak
3. Lalu buka kapas lemak tutup tabung media dekat nyala api dan panaskan mulut tabung media
4. Ose yang sudah terdapat koloni bakteri tadi masukkan ke dalam media dengan posisi media
dimiringkan dan campur di dindin tabung
5. Campur secara merata dengan memutar-mutar tabung dengan kedua tangan kemudian inkubasi
pada inkubator suhu 370C selama 24 jam
6. Kemudian ditambahkan α nafthol 5% dan KOH 40% dengan perbandingan 3:1
7. Lalu campurkan, tunggu selama 15 menit kemudian amati apakah terdapat perubahan warna atau
tidak
Praktikum VII: Penanaman pada media Glukosa Phospate untuk Uji MR (Methylene Red)
Alat dan Bahan : 1. Media pepton glukosa phosphate.
2. Ose
3. Bunsen
4. Methyle Red
5. Koloni kuman dari NAS

Fakultas Vokasi - 15
 6. Rak Tabung
Cara Kerja :
1. Red heat ose bulat di atas nyala api lalu dinginkan pada media agar NAS lalu ambil koloni bakteri
dengan ose bulat yang sudah didinginkan
2. Dengan posisi tetap dekat dengan nyala api, panaskan mulut tabung media NAS kembali lalu
tutup tabung dengan kapas lemak
3. Lalu buka kapas lemak tutup tabung media dekat nyala api dan panaskan mulut tabung media
4. Ose yang sudah terdapat koloni bakteri tadi masukkan ke dalam media dengan posisi media
dimiringkan dan campur di dindin tabung
5. Campur secara merata dengan memutar-mutar tabung dengan kedua tangan kemudian inkubasi
pada inkubator suhu 370C selama 24 jam
6. Kemudian ditambahkan Methyle Red 2-3 tetes, kemudian amati apakah terdapat perubahan warna
atau tidak

Fakultas Vokasi - 16
Fakultas Vokasi - 17