BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Kloramfenikol

2.1.2 Sifat Fisiko Kimia

Sinonim kloramfenikol adalah dichloroasetamide, amphicol, anacetin, fenicol,

cloramicol, cloromycetin, Kemicetine, (Winholdz, 1983). Merupakan hablur

halus berbentuk jarum atau lempeng memanjang; putih sampai putih kelabu

atau putih kekuningan; tidak berbau; rasa sangat pahit. Larut dalam lebih kurang

400 bagian air, dalam 2,5 bagian etanol (95%) P dan dalam 7 bagian

propilenglikol P; sukar larut dalam kloroformP dan dalam eter. Dapat menyerap

sinar Ultraviolet didalam air pada panjang gelombang 278 nm. Berkhasiat sebagai

antibiotikum (Ditjen POM, 1979). Memiliki rumus molekul C11H12Cl2N2O5 dan

rumus bangun, seperti yang ditunjukkan pada gambar 1.

Gambar 1. Rumus Bangun Kloramfenikol (sumber: USP, 2006)

2.1.3 Kegunaan Umum

Kloramfenikol digunakan sebagai antibiotik bersifat bakteriostatik dan

mempunyai spektrum luas. Merupakan obat pilihan untuk pengobatan demam

tifoid akut yang disebabkan oleh salmonella sp. Kloramfenikol pada awalnya

diisolasi dari Streptomyces venezuelae yang pertama kalinya diisolasi oleh

Universitas Sumatera Utara

Burkholder pada tahun 1947 dari contoh tanah yang diambil dari Venezuela,

sekarang telah dapat dibuat melalui sintesis total, yang metodenya relatif lebih

sederhana dan biayanya lebih murah. Kloramfenikol efektif terhadap riketsia dan

konjungtivitis akut yang disebabkan oleh mikoroorganisme, termasuk

Pseudomonas sp kecuali Pseudomonas aeruginosa. Senyawa ini juga efektif

untuk pengobatan infeksi berat yang disebabkan oleh bakteri gram positif dan

gram negative (Siswandono dan Soekardjo, 1995).

2.1.4 Farmakokinetika

Penyerapan obat melalui saluran cerna cukup baik (75-90%), kadar plasma

tertinggi dicapai dalam 2-3 jam. Waktu paruh kloramfenikol pada orang dewasa ±

3 jam, sedang pada bayi di bawah 1 bulan 12-24 jam (Siswandono dan Soekardjo,

1995).

2.1.5 Toksikologi

Efek samping yang ditimbulkan kloramfenikol antara lain adalah depresi

sumsum tulang belakang, yang menimbulkan kelainan darah yang serius, seperti

anemia aplastik, granulositopenia, trombositopenia. Selain itu, obat ini juga dapat

menyebabkan gangguan saluran cerna dan reaksi hipersensitivitas. Oleh karena itu

kloramfenikol tidak boleh digunakan untuk pengobatan infeksi yang bukan

indikasinya,seperti influenza, infeksi kerongkongan atau untuk pencegahan infeksi

(Siswandono dan Soekardjo, 1995 ; Watimena, dkk, 1999).

2.2 Ikan

Ikan merupakan salah satu bahan makanan yang mengandung berbagai macam

zat, selain harga yang umumnya lebih murah, absorpsi ikan lebih tinggi

dibandingkan dengan produk hewani lain seperti daging sapi dan ayam, karena

Universitas Sumatera Utara

daging ikan mempunyai serat-serat protein lebih pendek dari pada serat-serat

protein daging sapi atau ayam. Jenisnya pun sangat beragam dan mempunyai

beberapa kelebihan, diantaranya adalah mengandung omega 3 dan omega 6, dan

kelengkapan komposisi asam amino. Ikan juga dapat menurunkan kolesterol

darah, menurunkan kadar trigliserida darah, meningkatkan kecerdasan anak dan

meningkatkan kemampuan akademik, menurunkan resiko kematian karena

penyakit jantung, mengurangi gejala rematik, menurunkan aktivitas pertumbuhan

sel kanker dan juga mengandung omega 3 dan omega 6 (Anonim, 2008).

2.2.1 Ikan Gurami (Osphronemus gouramy)

Gurami adalah ikan air tawar yang banyak menghuni rawa-rawa, danau, atau

daerah perairan tenang. Sebagai ikan hasil budi daya, gurami banyak dipilih petani

karena mampu berbiak secara alami dan mudah dalam pemberian pakan. Dari

aspek bisnis keuntungan yang bisa didapat adalah harga jual yang cukup tinggi

dan relatif stabil. Gurami sangat peka terhadap suhu dingin. Suhu air optimal

untuk pertumbuhaannya adalah 24-280C. Bentuk fisik gurami sangat khas.

Tubuhnya pipih dan agak panjang. Bagian dahi gurami dewasa terdapat tonjolan

mirip cula. Tonjolan ini tidak ditemukan pada gurami muda (anakan). Pada

gurami anakan terdapat ciri khas berupa garis-garis hitam yang melintang

ditubuhnya. Rata-rata ikan gurami memiliki mulut yang kecil dengan bibir bagian

bawah terlihat sedikit lebih panjang dibandingkan bibir atas. Panjang gurami

dewasa dapat mencapai 65 cm dan berat 10 kg,. Secara alami pertumbuhan paling

pesat terjadisaat mencapai 3-5 tahun. Gurami memiliki kemampuan mengambil

oksigen dari udara karena adanya labirin yang terletak diatas atau dibelakang

insang. Karena itu, gurami sering dijumpai mengeluarkan mulutnya diatas

Universitas Sumatera Utara

permukaan air. Dengan kemampuannya ini, gurami dapat hidup di perairan yang

kandungan oksigennya terbatas (Agus, dkk., 2002).

Klasifikasi ikan gurami berdasarkan ilmu taksonomi adalah sebagai berikut :

Kingdom : Animalia

Filum : Chordata

Kelas : Pisces

Ordo : Anabantoidei

Famili : Osphronemidae

Marga : Osphronemus

Jenis : Osphronemus goramy

2.2.2 Ikan Mas (Cyprinus carpio)

Ikan mas merupakan jenis ikan darat yang hidup di perairan dangkal yang

mengalir tenang dengan suhu sejuk. Jenis ikan konsumsi air tawar ini banyak

digemari masyarakat karena rasa dagingnya gurih dan memiliki kadar protein

tinggi. Ikan mas yang lazim disebut ikan karper terkenal cukup mudah

pemeliharaannya. Ini disebabkan pertumbuhannya yang relatif cepat, tahan

terhadap penyakit dan parasit, adaptif terhadap lingkungan yang terbatas, dan

kelambatan permulaan matang kelamin. Ikan mas tergolong jenis ikan yang sangat

toleran terhadap fluktuasi suhu air antara 14-230C. Namun, suhu air optimum

yang baik untuk pertumbuhan ikan mas berkisar 22-280C . Ikan mas mampu

beradaptasi terhadap perubahan kandungan oksigen terlarut dalam perairan. Ikan

mas juga tidak sensitif terhadap perlakuan fisik seperti seleksi, penampungan,

penimbangan, dan pengangkutan. Karena sifatnya yang sangat adaptif terhadap

lingkungan baru, ikan mas tersebar hampir diseluruh penjuru dunia. Masa panen

Universitas Sumatera Utara

ikan mas dapat dilakukan setelah ikan berumur 3-4 bulan terhitung sejak benih

mulai ditebar di kolam pembesaran. Ikan Mas memiliki bentuk tubuh yang agak

memanjang dan sedikit memipih ke samping. Sebagian besar tubuh ikan mas di

tutupi oleh sisik. Moncongnya terletak di ujung tengah dan dapat di sembulkan.

Pada bibirnya yang lunak terdapat dua pasang sungut dan tidak bergerigi. Pada

bagian dalam mulut terdapat gigi kerongkongan sebanyak tiga baris berbentuk

geraham (Bachtiar, 2003).

Klasifikasi ikan gurami berdasarkan ilmu taksonomi adalah sebagai berikut :

Kingdom : Animalia

Filum : Chordata

Kelas : Pisces

Ordo : Cypriniformes

Famili : Cyprinidae

Genus : Cyprinus

Species : Cyprinus carpio

2.2.3 Penyakit Ikan

Penyakit ikan dapat didefenisikan sebagai segala sesuatu yang dapat

menimbulkan gangguan suatu fungsi atau struktur dari alat tubuh atau sebagian

alat tubuh, baik secara langsung maupun tidak langsung. Penyakit yang

menyerang ikan tidak datang begitu saja, melainkan melalui proses hubungan

antara tiga faktor, yaitu kondisi lingkungan, kondisi inang, dan adanya jasad

patogen. Dengan demikian, timbulnya serangan penyakit merupakan hasil

interaksi yang tidak serasi antara lingkungan, ikan, dan jasad/organism penyakit.

Interaksi yang tidak serasi ini menyebabkan stress pada ikan, sehingga mekanisme

Universitas Sumatera Utara

pertahanan diri yang dimilikinya menjadi lemah dan akhirnya mudah diserang

oleh penyakit (Kordi, 2004).

Pada umumnya penyakit infeksi bersifat musiman, terutama pada daerah

tropis. Di daerah sub – tropis, seperti Amerika Serikat, wabah penyakit infeksi

umumnya terjadi pada bulan Maret – Juni dan September – Oktober, ketika suhu

air mencapai 20-28oC. Kisaran suhu tersebut merupakan suhu optimum bagi

sebagian besar pathogen ikan (Irianto, 2005).

Menurut Kordi, 2004, penyakit yang disebabkan oleh bakteri yang

menyerang ikan-ikan budidaya, baik dipelihara di kolam, tambak, keramba, dan

wadah-wadah dan cara penanggulangannya adalah sebagai berikut:

1. Bakteri perusak sirip

Bakteri perusak sirip adalah jenis bakteri Mycobacter sp, Vibrio sp, Pseudomonas

sp, dan bakteri coccus gram negatif. Ikan yang terserang bakteri ini mengalami

kerusakan sirip-sirip terutama pada ujung-ujungnya.

Cara penanggulangan :

Ikan yang terserang penyakit direndam dengan kloramfenikol 50 ppm

selama 2 jam.

2. Penyakit Bercak merah

Penyakit bercak merah disebabkan oleh Aeromonas hydrophila. Bakteri

Aeromonas hydrophila menyerang hampir semua jenis ikan air tawar yang

dipelihara di tambak bersalinitas rendah. Kerugian yang ditimbulkan sangat besar,

sebab dalam waktu relatif singkat puluhan ton ikan mati secara masal, baik ukuran

benih maupun induk. Serangan bakteri ini bersifat laten, jadi tidak

memperlihatkan gejala penyakit meskipun telah dijumpai pada tubuh ikan.

Universitas Sumatera Utara

Serangan bakteri ini baru terlihat apabila ketahanan tubuh ikan menurun akibat

stress yang disebabkan oleh penurunan kualitas air, kekurangan pakan atau

penanganan ikan yang kurang baik.

A B

Gambar 2. Ikan gurami yang tidak terserang penyakit (A) Ikan gurami yang

terserang penyakit bercak merah (B) (sumber: Irianto, 2005)

Cara penanggulangan :

Cara penanggulanagannya dapat dilakukan dengan penyuntikan menggunakan

kloramfenikol 20-60 mg/kg.

3. Columnaris

Penyakit columnaris disebabkan oleh bakteri Flexibacter columnaris.

Bakteri Columnaris menyerang hampir semua jenis ikan air tawar. Gejala yang

timbul ditandai dengan ikan kehilangan nafsu makan, terbentuknya luka terutama

di kepala, sirip, kulit badan bagian belakang, ekor dan insang. Pada mulanya luka

yang terbentuk cukup kecil, kemudian berwarna keputih-putihan, kemerah-

merahan dan akhirnya menjadi borok atau bisul besar. Insang dan sirip menjadi

Universitas Sumatera Utara

rontok. Jika organisme ini menyerang insang, sering menyebabkan kematian

massal.

Cara penanggulangan:

Penanggulangan dilakukan dengan cara merendam Kloramycetin 5-10 ppm

selama 1-2 menit

4. Vibrosis

Penyakit vibrosis disebabkan oleh bakteri Vibrio sp. Bakteri Vibrio sp

menyerang ikan air tawar dan ikan-ikan laut budidaya. Umumnya ikan yang

diserang vibrosis memperlihatkan gejala-gejala seperti, ikan kehilangan nafsu

makan, kulit ikan menjadi gelap, insang ikan pucat, sering terjadi pembengkakan

pada kulit yang lama kelamaan akan pecah menjadi bisul dan mengeluarkan

cairan nanah berwarna kuning kemerah-merahan, terjadi perdarahan pada dinding

perut dan permukaan jantung, dan jika dilakukan pembedahan akan terlihat

pembengkakan dan kerusakan pada jaringan hati, ginjal, limpa.

Cara penanggulangan:

Penanggulangan dilakukan dengan cara memberikan kloramfenikol 0,2 g/kg

pakan selama 4 hari berturut-turut.

5. Furuncolosis

Penyakit furuncolosis disebabkan oleh bakteri Aeromonas salmonicia.

Ikan yang terserang penyakit ini menunjukkan gejala-gejala seperti, ikan

kehilangan nafsu makan, kulit ikan melepuh, insang terlihat pucat, mata menonjol,

dan terdapat perdarahan pada kulit dan insang. Bila dibedah, maka organ-organ

dalam seperti usus, ginjal, hati, dan limpa terlihat mengalami pendarahan.

Universitas Sumatera Utara

Cara penanggulangan:

Ikan yang telah terserang penyakit di obati dengan memberikan pakan

yang dicampurkan dengan kloramfenikol sebanyak 1 g /Kg pakan dan diberikan

selama 10 hari berturut-turut.

2.3 Kromatografi

Kromatografi merupakan suatu proses pemisahan yang mana analit-analit

dalam sampel terdistribusi antara dua fase, yaitu fase diam dan fase gerak. Fase

diam dapat berupa bahan padat atau porus dalam bentuk molekul kecil atau dalam

bentuk cairan yang dilapiskan pada pendukung padat atau dilapiskan pada dinding

kolom. Fase gerak dapat berupa gas atau cairan. Jika gas digunakan sebagai fase

gerak, maka prosesnya dikenal sebagai kromatografi gas. Dalam kromatografi cair

dan juga kromatografi lapis tipis, fase gerak yang di gunakan selalu cair (Rohman,

2009).

2.3.1 Pembagian Kromatografi

Menurut (Rohman, 2009), kromatografi dapat dibedakan atas berbagai

macam, tergantung pada pengelompokannya. Berdasarkan pada mekanisme

pemisahannya, kromatografi dibedakan menjadi :

a. Kromatografi adsorbsi

b. Kromatografi partisi

c. Kromatografi pasangan ion

d. Kromatografi penukar ion

e. Kromatografi ekslusi ukuran

f. Kromatografi afinitas

Universitas Sumatera Utara

 Berdasarkan alat yang digunakan, kromatografi dapat dibagi atas :

a. Kromatografi kertas

b. Kromatografi lapis tipis

c. Kromatografi cair kinerja tinggi

d. Kromatografi gas

2.3.2 Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi atau KCKT atau biasa juga disebut

dengan HPLC (High Performance Liquid Chromatography) dikembangkan pada

akhir tahun 1960-an dan awal tahun 1970-an. Saat ini, KCKT merupakan teknik

pemisahan yang diterima secara luas untuk analisis dan pemurnian senyawa

tertentu dalam suatu sampel pada sejumlah bidang, antara lain: farmasi,

lingkungan, bioteknologi, polimer, dan industri-industri makanan. Kegunaan

umum KCKT adalah untuk pemisahan sejumlah senyawa organik, anorganik,

maupun senyawa biologis; analisis ketidak murnian (impurities); analisis

senyawa-senyawa tidak mudah menguap (non-volatil); penentuan molekul-

molekul netral, ionic, maupun zwitter ion; isolasi dan pemurnian senyawa;

pemisahan senyawa-senyawa yang strukturnya hampir sama; pemisahan senyawa-

senyawa dalam jumlah sekelumit, dalam jumlah banyak, dan dalam skala proses

industri. KCKT merupakan metode yang tidak destruktif dan dapat digunakan

baik untuk analisis kualitatif maupun kuantitatif.

KCKT paling sering digunakan untuk menetapkan kadar senyawa-senyawa

tertentu seperti asam-asam amino, asam-asam nukleat, dan protein-protein dalam

cairan fisiologis; menentukan kadar senyawa-senyawa aktif obat, produk hasil

samping proses sintetis, atau produk-produk degradasi dalam sediaan farmasi;

Universitas Sumatera Utara

memonitor sampel-sampel yang berasal dari lingkungan, memurnikan senyawa

dalam suatu campuran; kontrol kualitas; dan mengikuti jalannya reaksi sintesis.

Kromatografi merupakan teknik yang mana solut atau zat-zat terlarut terpisah oleh

perbedaan kecepatan elusi, dikarenakan solute-solut ini melewati suatu kolom

kromatografi. Pemisahan solut-solut ini diatur oleh distribusi solut dalam fase

gerak dan fase diam. Penggunaan kromatografi cair secara sukses terhadap suatu

masalah yang dihadapi membutuhkan penggabungan secara tepat dari berbagai

macam kondisi operasional seperti jenis kolom., fase gerak, suhu kolom, dan

ukuran sampel (Rohman, 2007).

Maksud dan tujuan analisis dengan KCKT hanya ada dua hal yaitu didapatnya

pemisahan yang baik dalam waktu proses yang relatif singkat.

Menurut, Mulja dan Suharman, 1995, untuk tercapainya maksud dan tujuan

analisis dengan KCKT diatas maka diperlukan penatalaksanaan yang betul-betul

sudah dipersiapkan dan diperhitungkan, antara lain :

- Diplih pelarut pengembang atau pelarut pengembang campur yang sesuai

untuk komponen yang dipisahkan

- Berkaitan dengan pemilihan pelarut pengembang (solvent) maka kolom

yang dipakai juga harus diperhatikan.

- Detektor yang memadai

- Pengetahuan dasar KCKT yang baik serta pengalaman dam keterampilan

kerja yang baik

- Keuntungan metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi antara lain :

- dapat dilaksanakan pada suhu kamar

- detektror KCKT dapat divariasi

Universitas Sumatera Utara

 - pelarut pengembang yang dapat dipakai berulangkali, demikian juga

dengan kolomnya.

- ketepatan dan ketelitiannya relative tinggi dijajaran teknik analisis fisiko-

kimia.

2.3.3 Jenis Kolom

Dilihat dari jenis fase diam dan fase gerak, maka kromatografi cair kinerja

tinggi (kolomnya) dibedakan atas :

a. Kromatografi Fase Normal

Kromatografi dengan kolom konvensional dimana fase diamnya “normal”

bersifat polar, misalnya silika gel, sedangkan fase geraknya bersifat non

polar.

b. Kolom fase terbalik (Reversed Phase Colomn)

Kromatografi dengan kolom yang fase diamnya bersifat non polar,

sedangkan fase geraknya bersifat polar, kabalikan dari fase normal.

Kromatografi fase terbalik sebenarnya sudah lama dipikirkan oleh Boscott

(1947), tetapi baru sekitar tahun 1948 Boldingh berhasil memisahkan

asam-asam lemak dengan rantai panjang melalui suatu kolom yang berisi

bahan karet (non polar) dan dielusi dengan larutan pengembang campur

yang polar yaitu campuran air-metanol-aseton (Mulja dan Suharman,

1995).

2.3.4. Jenis Pompa

Sistem pompa kromatografi cair kinerja tinggi sudah diprogram untuk

dapat melakukan elusi dengan satu atau lebih macam pelarut. Dikenal dua sistem

pompa pada kromatografi cair kinerja tinggi yaitu :

Universitas Sumatera Utara

 1. Sistem Elusi Isokratik

Pada sistem ini elusi dilakukan dengan satu macam larutan pengembang

atau lebih dari satu macam larutan pengembang (pelarut pengembang campur)

dengan perbandingan yang tetap.

2. Sistem Elusi Gradien

Pada system ini elusi dilakukan dengan pelarut pengembang campur yang

perbandingannya berubah dalam waktu tertentu (Suharman dan Mulja, 1995).

2.3.5 Faktor-Faktor Yang Digunakan Untuk Evaluasi kinerja kolom

Kualitas pemisahan dengan kromatografi kolom dapat dikontrol dengan

melakukan serangkaian uji kesesuaian sistem yang meliputi:

1. Efisiensi kolom

2. Resolusi atau daya pisah

3. Simetrisitas puncak

4. Faktor retensi atau kapasitas kolom

1. Efisiensi Kolom

Salah satu karakteistik system kromatografi yang paling penting adalah

efisiensi atau jumlah lempeng teoritis (N). Ukuran efisiensi kolom adalah jumlah

lempeng (plate number, N) yang didasarkan pada konsep lempeng teoritis pada

distilasi. Bilangan lempeng (N) yang tinggi disyaratkan untuk pemisahan yang

baik yang nilainya sebanding dengan semakin panjangnya kolom (L) dan semakin

kecilnya nilai H. Istilah nilai H merupakan tinggi ekivalen lempeng teoritis atau

HETP (High Eqivalent Theoritical Plate), yang mana merupakan panjang kolom

yang dibutuhkan untuk menghasilkan satu lempeng teoritis. Kolom yang baik

akan mempunyai bilangan lempeng yang tinggi, dan karenanya kolom yang baik

Universitas Sumatera Utara

mempunyai nilai H yang rendah. Semakin kecil ukuran partikel, maka semakin

tinggi bilangan lempeng teoritis. Kondisi optimum diperoleh dengan melihat

hubungan antara tinggi lempeng teoritis dan kecepatan alir.

2. Resolusi (daya pisah)

Kolom yang lebih efisien akan mempunyai resolusi yang baik. Tingkat

pemisahan komponen dalam suatu campuran dengan metode kromatografi

direfleksikan dalam kromatogram yang dihasilkan. Untuk hasil pemisahan yang

baik, puncak-puncak dalam kromatogram harus terpisah secara sempurna dari

puncak lainnya dengan sedikit tumpang tindih atau tidak tumpang tindih.

3. Faktor Asimetri

Suatu situasi yang menunjukkan kinerja kromatografi yang kurang baik

adalah ketika ditemukan suatu puncak yang mengalami pengekoran (tailing)

sehingga menyebabkan puncak tidak setangkup atau tidak simetri. Kromatogram

yang memberikan harga TF=1 menunjukkan bahwa kromatogram tersebut bersifat

setangkup atau simetris. Harga TF>1 menunjukkan bahwa kromatogram

mengalami pengekoran (tailing). Semakin besar harga TF maka kolom yang

dipakai semakin kurang efisien. Dengan demikian harga TF dapat digunakan

untuk melihat efisiensi kolom kromatografi (Rohman, 2009).

Ada dua cara yang digunakan untuk pengukuran derajat asimetri puncak,

yakni factor ikutan dan factor asimetris. Faktor ikutan/tailing factor (Tf) seperti

yang diterangkan dalam Farmakope Amerika Serikat (USP) Edisi Ketigapuluh

dihitung dengan menggunakan lebar puncak pada ketinggian 5% (W0,05),

rumusnya dituliskan sebagai berikut:

a+b
Tf =
2a

Universitas Sumatera Utara

Dengan nilai a dan b merupakan setengah lebar puncak pada ketinggian 5%

seperti yang ditunjukkan pada gambar 5

Gambar 3. Pengukuran derajat asimetri puncak (sumber Dolan, 2003).

Sementara itu, factor asimetri/asymmetry factor (As) dihitung dengan

rumus berikut:

b
As =
a

Namun, nilai a dan b dalam perhitungan faktor asimetri merupakan setengah lebar

puncak pada ketinggian 10% seperti yang ditunjukkan di Gambar 5. Jika nilai a

sama dengan b, maka faktor ikutan dan asimetri bernilai 1. Kondisi ini

menunjukkan bentuk puncak yang simetris sempurna (Dolan, 2003).

2.3.6 Proses Pemisahan dalam Kolom Kromotografi Cair

Pemisahan dalam kromatografi cair disebabkan oleh distribusi kesetimbangan dari

senyawa-senyawa yang berbeda antara partikel fase diam dan larutan fase gerak

(Synder dan Kirkland, 1979). Contohnya, campuran dua komponen dimasukkan

kedalam sistem kromatografi (partikel dan ) (Gambar 4a). Di mana

komponen cenderung menetap di fase diam dan komponen lebih

cenderung didalam fase gerak (Gambar 4b). Masuknya eluen (fase gerak) yang

baru ke dalam kolom akan menimbulkan kesetimbangan baru: molekul sampel

Universitas Sumatera Utara

dalam fase gerak diadsorpsi sebagian oleh permukaan fase diam berdasarkan pada

koefisien distribusinya, sedangkan molekul yang sebelumnya diadsorpsi akan

mumcul kembali di fase gerak (Gambar 4c). Setelah proses ini terjadi berulang

kali, kedua komponen akan terpisah. Komponen yang lebih suka dengan fase

gerak akan berpindah lebih cepat daripada komponen yang cenderung

menetap di fase diam, sehingga komponen akan muncul terlebih dahulu dalam

kromatogram, kemudian baru diikuti oleh komponen akan muncul terlebih

dahulu dalam kromatogram, kemudian baru diikuti oleh komponen (Gambar

4c) (Meyer, 2004).

Gambar 4. Ilustrasi proses pemisahan yang terjadi di dalam kolom KCKT.

(sumber: Mayer, 2004)

Universitas Sumatera Utara

2.4 Validasi Metode

Validasi metode analisis adalah suatu tindakan penilaian terhadap parameter

tertentu, berdasarkan percobaan laboratorium, untuk membuktikan bahwa

parameter tersebut memenuhi persyaratan untuk penggunaannya (Harmita, 2004).

Menurut Farmakope Amerika Serikat (USP/United State Pharmacopeia) Edisi

Ketigapuluh, ada 8 karakteristik utama yang digunakan dalam validasi metode,

yakni akurasi, presisi, spesivisitas, batas deteksi, batas kuantitasi, linearitas,

rentang dan kekuatan.

2.4.1 Akurasi (Kecermatan)

Akurasi adalah ukuran yang menunjukkan derajat kedekatan hasil analisis

dengan kadar analit yang sebenarnya, kecermatan dinyatakan sebagai persen

perolehan kembali (recovery) analit yang ditambahkan. Kecermatan ditentukan

dengan dua cara yaitu metode simulasi (spike placebo recovery) dan metode

penambahan baku (standard addition method).

2.4.2 Presisi (Keseksamaan)

Presisi biasanya dinyatakan sebagai simpangan baku relatif dari jumlah

sampel yang berbeda signifikan secara statistic (Rohman, 2007). Berdasarkan

rekomendasi ICH (The International Conference on the Harmonisation),

karakteristik presisi dilakukan pada 3 tingkatan, yakni keterulangan

(repeatability), presisi antara (intermediate precision), dan reprodusibilitas

(reproducibility). Keterulangan dilakukan dengan cara menganalisis sampel yang

sama oleh analisis yang sama menggunakan instrumen yang sama dalam periode

waktu yang singkat. Presisi antara dikerjakan oleh analis yang berbeda.

Universitas Sumatera Utara

Sedangkan reprodusibilitas dikerjakan oleh analis yang berbeda dan

dilaboratorium yang berbeda (Epshtein, 2004).

2.4.3 Spesifisitas (Selektivitas)

Spesifisitas suatu metode adalah kemampuannya yang hanya mengukur at

tertentu saja secara cermat dan seksama dengan adanya komponen lain yang

mungkin ada dalam matriks sampel (Harmita, 2004).

2.4.4 Batas Deteksi (Limit of Detection/LOD)

Batas deteksi didefenisikan sebagai konsentrasi analit terendah dalam

sampel yang masih dapat dideteksi, meskipun tidak selalu dapat dikuantitasi.

Batas deteksi merupakan batas uji yang secara spesifik menyatakan apakah analit

diatas atau dibawah nilai tertentu (Rohman, 2009).

2.4.5 Batas Kuantitasi (Limit of Quantitation/ LOQ)

Batas kuantitasi didefenisikan sebagai konsentrasi analit terendah dalam

sampel yang dapat ditentukan dengan presisi dan akurasi yang dapat diterima pada

kondisi operasional metode yang digunkan (Rohman, 2009).

2.4.6 Linearitas

Linearitas dapat ditentukan secara langsung dengan pengukuran analit atau

sampel yang di-spiked pada konsentrasi sekurang-kurangnya lima titik konsentrasi

yang mencakup seluruh rentang seluruh konsentrasi kerja (Ermer, 2005).

2.4.7 Rentang

Rentang metode adalah pernyataan batas terendah dan tertinggi analit yang

sudah ditunjukkan dapat ditetapkan dengan kecermatan, keseksamaan, dan

linearitas yang dapat diterima (Harmita, 2004).

Universitas Sumatera Utara

2.4.8 Kekuatan (Robustness)

Kekuatan dievaluasi dengan melakukan perubahan parameter dalam

melakukan metode analitik seperti pH larutan dapar, suhu kolom KCKT, waktu

pengekstraksian analit, komposisi pengekstaksi, perbandingan konsentrasi fase

gerak, laju alir fase gerak dan tipe kolom serta pabrik pembuat kolom (Epshtein,

2004)

Universitas Sumatera Utara