BAHAN DAN METODE

Waktu dan Tempat Praktikum

Adapun praktikum ini dilaksanakan pada hari Kamis, 27 Februari 2020

pada pukul 11.40 WIB sampai dengan selesai di Laboratorium Genetika

Molekuler Program Studi Agroteknologi Fakultas Pertanian Universitas Sumatera

Utara pada ketinggian ± 32 m dpl.

Alat dan Bahan

Adapun alat yang digunakan dalam praktikum ini adalah mikropipet untuk

memindahan cairan dalam jumlah kecil; kamera handphone untuk

mendokumentasikan alat dan bahan laboratorium; sentrifuge untuk

memisahkan substansi dari substratnya; mortal dan alu untuk

menghaluskan bahan atau sampel yang akan digunakan; waterbath untuk

memanaskan atau menginkubasi bahan- bahan kimia, sampel serta zat- zat

tertentu; vortex untuk mencampurkan suatu zat agar homogen; PCR Hood

untuk tempat kerja steril; ultra low freezer untuk menyimpan stok DNA

yang didapat; termometer untuk mengukur suhu pada waterbath; gunting

untuk memotong daun, dan baju laboratorium sebagai pelindung diri.

Adapun bahan yang digunakan dalam praktikum kali ini adalah daun

tanaman asam gelugur (Garcinia atroviridis) sebagai sampel percobaan, nitrogen

cair sebagai senyawa untuk menghancurkan dinding sel sampel, sarung tangan

untuk melindungi tangan dari bahan kimia, masker untuk melindungi hidung dan

mulut dari bahan kimia, tube 2 mL untuk meletakkan bahan yang sudah

dihaluskan dan untuk mereaksikan bahan, tips untuk mengambil supranatan dari

tube, larutan KIAA untuk menjaga bentuk DNA agar tidak rusak, CTAB untuk
melisis membran sel dan membran fosfolipid, β-mercaptoethanol untuk

mendegradasi protein, PVPP untuk mencegah browning pada sampel, isopropanol

dingin untuk membekukan DNA, alkohol untuk sterilisasi alat dan bahan, dan tisu

untuk membersihkan larutan atau sanitasi.

Prosedur Praktikum

- Daun ditimbang 0,3 g dan dipisahkan dari tulang daun dan dipotong secara

melintang
- Daun yang telah dipotong, dimasukkan ke dalam mortal dan digerus dengan

menggunakan nitrogen cair searah jarum jam hingga halus

- Ditambahkan 0,1 g PVPP lalu digerus kembali
- Disiapkan tube berukuran 2 mL yang berisikan 1 mL CTAB dan 10 μL β-

mercaptoethanol, kemudian dimasukkan ke dalam tube 2 mL dan divortex

hingga homogen
- Diinkubasi di waterbath dengan suhu 65oC selama 30 menit dimana setiap 10

menit tube diangkat lalu dispin manual.

- Ditambahkan 1 mL KIAA lalu di vortex hingga homogen
- Dimasukkan ke sentrifuse selama 10 menit dengan kecepatan 13000 rpm dan

pada suhu 4oC. Hasil sentrifuse tidak boleh diguncang.

- Diambil supernatan lalu dimasukkan ke tube 2 mL yang baru yang telah berisi

1 mL KIAA kemudian divortex hingga homogen

- Dimasukkan ke sentrifuse kembali selama 7 menit dengan kecepatan 13000

rpm dan pada suhu 4oC

- Diambil supernatan lalu dimasukkan ke tube 2 mL yang baru yang telah berisi

1 mL KIAA kemudian divortex hingga homogen

- Dimasukkan ke sentrifuse kembali selama 5 menit dengan kecepatan 13000

rpm dan pada suhu 4oC

- Diambil supernatan lalu dimasukkan ke tube 2 mL yang baru yang telah berisi

1 mL isopropanol dingin dan dispin manual secara perlahan

- Disimpan pada suhu 4oC selama 30 menit
 HASIL DAN PEMBAHASAN

Hasil

Gambar Keterangan
Disterilkan alat dan bahan yang akan
digunakan dengan menggunakan
alkohol

Dipisahkan daun dan tulang daun

Dipotong daun secara melintang dan

dimasukkan pada mortal

Digerus sampel searah jarum jam

dengan menggunakan alu sambil
dituang nitrogen cair pada mortal
sampai sampel halus

Ditambahkan PVPP 0,1 gram sebagai

antioksidan

Dimasukkan 1 ml CTAB dan 10 µl β-

mercaptoethanol ke dalam tube 2 ml
dan diinkubasi pada waterbath yang
bersuhu 65oC selama 30 menit.
 Dimasukkan daun yang telah digerus
tadi kedalam tube yang berisi CTAB
dan β- mercaptoethanol yang telah
diinkubasi, dimana setiap 10 menit tube
diangkat dan dispin manual

Ditambahkan 1 ml KIAA

Dihomogenkan dengan menggunakan

vortex

Disentrifus selama 10 menit dengan

suhu 4oC dengan kecepatan 13.000 rpm

Dipindahkan fase atas (supernatan) ke

tube 2 ml yang baru dengan
menggunakan mikropipet

Ditambahkan 1 ml KIAA ke dalam tube

yang berisikan supernatant dan
dihomogenkan dengan menggunakan
vortex
 Disentrifus selama 7 menit dengan
suhu 4oC dengan kecepatan 13.000 rpm

Dipindahkan fase atas ke tube 2 ml

yang baru dengan menggunakan
mikropipet

Ditambahkan 1 ml KIAA ke dalam tube

yang berisikan supernatan dan
dihomogenkan dengan menggunakan
vortex

Disentrifus kembali selama 5 menit

dengan suhu 4oC dengan kecepatan
13.000 rpm

Dipindahkan fase atas ke tube 2 ml

yang baru dengan menggunakan
mikropipet
 Ditambahkan 1 ml isopropanol dingin
ke dalam tube yang berisikan
supernatan kemudian dispin manual
secara perlahan

Disimpan tube tersebut pada binder

dengan suhu 4oC

Pembahasan

Isolasi DNA ialah suatu teknik atau metode dalam memisahkan DNA dan

zat lainnya untuk mendapatkan DNA murni. Hal ini sesuai dengan literatur

Tahapan isolasi DNA yaitu isolasi jaringan, penglisisan dinding dan

membran sel, pengekstrasian dalam larutan, purifikasi, dan presipitasi. Hal ini

sesuai dengan literatur

Proses perusakan atau penghancuran membran dan dinding sel merupakan

tahap pertama dalam isolasi DNA. Dinding sel yang telah terdegradasi

menyebabkan DNA beserta isi sel keluar. Hal ini sesuai dengan literatur

Ekstraksi DNA dilakukan untuk memisahkan DNA dari kontaminan

lainnya (seperti lemak, polisakarida, fenolik, dan protein). Proses ekstraksi DNA

biasanya menggunakan pelarut organik seperti kloroform dan isoamil alkohol. Hal

ini sesuai dengan literatur

 Pemurnian DNA (purifikasi) merupakan proses pencucian DNA yang

kemungkinan masih terdapat sisa- sisa kontaminan. bertujuan untuk

membersihkan hasil ekstrak dari zat-zat lainnya. Hal ini sesuai dengan literatur

Salah satu faktor yang mempengaruhi keberhasilan isolasi adalah senyawa

metabolit sekunder. Senyawa metabolit sekunder akan mempengaruhi kualitas dan

kuantitas DNA berdasarkan metode yang sudah ada, tetapi membutuhkan

beberapa modifikasi. Untuk mendapatkan DNA yang berkualitas baik,

memerlukan metode isolasi yang tepat, tergantung dari jenis tanamannya. Hal ini

sesuai dengan literatur

Fungsi isopropanol ialah mempresipitasi DNA pada fase aquoeus sehingga

DNA menggumpal membentuk struktur fiber dan terbentuk pellet DNA. Hal ini

sesuai dengan literatur