F.

Persiapan sampel :

1. Ambil darah pasien dengan aseptis menggunakan spuit, tabung yang dipakai adalah
tabung vakum antikoagulan EDTA berwarna ungu, agar didaptkan sampel serum dan
darah yang terpisah.
2. Setelah di lakukan sampling pasien, maka diamkan terlebih dahulu selama 15 menit agar
sampel tidak lisis pada saat di sentrifus
3. Lakukan sentrifugasi pada sampel selama 3000 rpm selama 15 menit.
4. Lalu pipet serum yang telah terpisah dengan wholeblood pindahkan ke tabung serum
yang baru dan steril.
5. Serum siap di isolasi untuk mendapatkan DNA Candida albicans

G. Tahap Isolasi DNA :

A. Persiapan sampel

1. Sampel serum yang ada di tabung serum dipindahkan sebanyak 1000𝜇L ke collection
tube.
2. Karena kelompok tidak mempunyai sampel serum patologis penderita candidemia, maka
dilakukan perlakuan serum yang mengandung candida albicans dengan cara : Ambil 3 ose
koloni dari kultur Candida albicans pada Saboraud's Dextrose Agar (SDA), homogenkan
pada sampel serum yang telah di pindahkan ke collection tube.
3. Agar lebih homogen maka di lakukan vortex selama 10 detik
4. Lalu sentrifus 3000 rpm 5 menit sampai mendapat endapan.
5. Buang suspensi serum jernih langsung ke wastafel yang dialiri air
6. Add PBS 200 𝜇L, lalu sentrifus kembali dengan kecepatan 300 rpm selama 5 menit
7. Buang supernatant ke wastefel yang dialiri air
8. Lakukan langkah 6-7 sebanyak dua kali
9. Tersisa endapan Lalu add PBS 200𝜇L dan 20 𝜇LProteinase K, resuspensikan dengan pipet
agar homogen.
10. Inkubasi pada suhu 60°C selama lima menit

B. Lisis Sel

11. Tambahkan 200 𝜇L GSB Buffer, campur kuat- kuat

12. Lalu inkubasi kembali pada suhu 60°C selama lima menit, bolak balikan tiap dua menit

C. Pengikatan DNA

13. Tambahkan Etanol Absolut sebanyak 200𝜇L, lalu homogenkan selama 10 detik
14. Pindahkan ke spincoloumn yang ada membrane warna orange nya
15. sentrifus 14000-16000 G selama 30 detik
16. buang supernatant dan collection tube dan ambil membrann nya saja
17. pasangkan membrane ke collection tube baru
 D. Washing

18. add 400𝜇L W1, Sentrifus dengan kecepatan 14000-16000 G selama 30 detik
19. buang cairan dari collection tube dan pasangkan pada membrane kembali
20. add wash buffer 600𝜇L lalu sentrifus dengan kecepatan 14000-16000 G selama 30
Detik
21. buang supernatant, lalu lakukan sentrifus kering dengan kecepatan 14000-16000 G
selama 30 detik
22. Ganti collection tube baru, pasangkan pada membrane yang telah di sentrifus
Kering

E. Elution

23. tambahkan Elution buffer 100𝜇L yang sudah dipanaskan

24. sebelum sentrifus inkubasi 3 menit pada suhu ruang dengan posisi tegak lurus
25. sentrifugasi 14000-16000 G selama 30 detik
26. beri parafilm dan label pada collection tube dengan pulpen tinta permanen
27. masukan ke kulkas
28. lanjutkan ke tahap elektroforesis

G. Tahap Elektroforesis :

1. agarose yang digunakan adalah agarose yang sudah tersimpan di kulkas dan diencerkan
kembali, kelompok menggunakan agarose bekas praktikum tahun lalu untuk
elektroforesis hasil PCR DNA Candida albicans dan di cetak kembali dengan chamber
2. persiapkan alat Elektroforesis dengan mengatur stabilizer dan power supply yaitu 120V
dengan waktu 45 menit.
3. masukan agarose yang telah siap ke chamber elektroforesis, setelah itu tuangkan TE
sampai agorose terendam
4. siapkan object glas untuk menghomogenkan sampel hasil isolasi dengan Loading day
berwarna
5. pipet loading day sebanyak 1𝜇L lalu ditempatkan diatas object glas, pipet sampel hasil
isolasi sebanyak 4𝜇L lalu tempatkan diatas tetesan loadingday
6. pindahkan pipet ke 5𝜇L dan homogenkan dengan perlahan agar loading day dan sampel
hasil isolasi tercampur sempurna
7. masukan hasil campuran ke sumur agarose dengan teliti dan hati –hati, jangan sampai ada
yg keluar dari well
8. kita tekan start pada power supply untuk running elektroforesis hasil isolasi DNA Candida
albicans