Pendahuluan

Penyakit Alzheimer (AD) adalah gangguan

neurodegenerative (saraf di daerah otak tertentu mengalami
kemunduran, menyebabkan hilangnya memori dan fungsi mental
secara progresif dan perubahan perilaku. Penumpukan jaringan
abnormal di daerah otak, sering disebut jaringan kusut dan plak–
diyakini berkontribusi terhadap penyakit tersebut) yang ditandai
dengan deposisi (pengendapan) amiloid beta (Aβ) peptida (senile
plaques) dan jaringan neurofibrillary kusut di korteks serebral dan
hippocampus. Dua bentuk peptida, Aβ1-40 danAβ1-42, adalah
komponen utama dari senile plaques dan berasal dari precursor
protein. Tikus transgenik yang mengekspresikan Aβ1-42 secara
berlebihan menunjukkan potensi gangguan jangka panjang. Aβ1-
40 dan Aβ1-42 membentuk struktur fibrilar reguler yang panjang,
setelah inkubasi berkepanjangan in vitro. Tes menggunakan
mikroinjeksi Aβ yang terbentuk secara in vitro ke dalam otak tikus
menunjukkan bahwa zat antara anoligomer yang terbentuk pada
tahap awal inkubasi lebih toksik pada neuron daripada bentuk
fibril (urat saraf) yang matang. Oligomer Aβ yang terlarut
ditemukan berikatan dengan sinapsis dan menurunkan tingkat
kepadatan tulang belakang dendritik dan sinapsis aktif secara
elektrofisiologi. Oleh karena itu, pengurangan atau penekanan
oligomer Aβ ini harus menjadi salah satu kunci untuk
mengendalikan timbulnya AD.

Studi epidemiologis sebelumnya telah menyarankan bahwa

tanaman tertentu yang mengandung senyawa polifenol turunan
mengurangi risiko AD. Polifenol telah terbukti mencegah
oligomerisasi Aβ dan menurunkan gangguan kognitif. Polifenol
yang terkandung dalam tanaman dibagi lagi menjadi flavonoid,
stilbena, dan lignan, dan flavonoid selanjutnya diklasifikasikan ke
dalam anthocyanidins, flavonol, dan flavones. Stilbenoid seperti
resveratrol dan piceid menghambat polimerisasi Aβ tetapi
stilbenoid lain seperti piceatannol menunjukkan potensi
penghambatan yang lebih kecil. Hasil ini menunjukkan bahwa
struktur kimia molekul polifenol tertentu yang umum untuk kelas
tertentu memberikan efek menguntungkan spesifik pada
berbagai penyakit neurologis. Penelitian menunjukkan bahwa
polifenol yang diperoleh dari bilberry (Vaccinium myrtillus
anthocyanoside (VMA)) menghambat fibrilasi dari co-chaperonin
GroES dan mengurangi toksisitas zat yang terbentuk selama
proses. VMA adalah campuran heterogen dari setidaknya 15
anthocyanosides yang berbeda (anthocyanin), yang terdiri dari
mayoritas (sekitar 70%) delphinidin 3-galactoside (Del) dan
cyanidin 3-galactoside (Cya). Penelitian sebelumnya telah
menunjukkan bahwa ekstrak bilberry kaya akan anthocyanin dan
anthocyanin dapat melindungi dari serangan toksisitas yang
diinduksi Aβ dalam sel Neuro 2a dengan menghalangi
pembentukan spesies oksigen reaktif dan juga menurunkan
gangguan kognitif dalam model tikus AD. Dalam sebuah
penelitian baru-baru ini yang melibatkan tikus, anthocyanin juga
melindungi terhadap kerusakan memori dan gangguan
kecemasan yang merupakan karakteristik dari demensia sporadis
tipe Alzheimer yang dipicu oleh pemberian streptozotocin secara
intracerebroventricular yang akan berinteraksi dengan γ

aminobutyric acid receptor. Dalam penelitian ini, menunjukkan

bahwa VMA menghambat pembentukan Aβ1–40 dan Aβ1–42
secara in vitro dengan mengalihkan peptida ini ke bentuk agregat
yang tidak beracun. Selain itu, pada penelitian ini menunjukkan
bahwa tikus model AD yang diberi makan VMA 1%
mempertahankan fungsi kognitif mereka pada tingkat yang sama
seperti tikus non transgenik (NTG) pada usia yang sama,
sedangkan tikus model AD yang diberi pakan kontrol kurang VMA
menunjukkan penurunan kognitif yang cukup signifikan. Jumlah
deposit agregat Aβ terdeteksi dan tingkat protein Aβ yang tidak
larut dalam otak tetap tinggi terlepas dari ada atau tidak adanya
VMA dalam makanan yang menyarankan bahwa formasi VMA
merupakan agregat alternatif yang non-toxic dari pengujian in
vivo. Efek in vitro dan in vivo VMA pada Aβ1-42 dan AD dapat
dijelaskan oleh pandangan mekanistik umum dengan
melemahkan tingkat toksisitas melalui pengalihan jalur
amiloidogenik molekuler.

Methods

 Pembentukan fibril amiloid dan uji ikatan thioflavin

Stok Aβ1-40 dan Aβ1-42 pada manusia yang diliofilisasi (Peptide

Institute, Inc., Osaka, Jepang) dilarutkan dalam amonia / air 0,02%
untuk menyiapkan larutan stok 500 μM Aβ. Sampel Aβ dari
masing-masing peptida diformulasikan dalam tabung reaksi
menggunakan 50 mM buffer natrium fosfat (pH 7,4) yang
mengandung 100 mM NaCl dan 133 μM Aβ dengan atau tanpa
berbagai konsentrasi VMA (Wakasa Seikatsu Co., Ltd, Kyoto,
Jepang) dan ditempatkan di 37 ° C. Pada waktu yang tepat,
alikuot diambil dan dicampur secara menyeluruh dengan buffer
tioflavin T (50 mM natrium fosfat (pH 7,4) yang mengandung 20
μM tioflavin T dan 100 mM NaCl). Konsentrasi Akhir Aβ selama
pengujian adalah 1 μM. Intensitas fluoresensi masing-masing
sampel pada 480 nm (dengan panjang gelombang eksitasi diatur
ke 440 nm) diukur menggunakan spektrometer fluoresensi FP-
6300 (Jasco, Jepang) pada 37 ° C. Untuk menguji efek tergantung
pada konsentrasi komponen antosianin murni (Del dan Cya
(Tokiwa Phytochemical, Jepang)), 10 sampel μM Aβ disiapkan
dalam pelat 96-sumur dengan 50 mM buffer natrium fosfat (pH
7,4) yang mengandung 100 mM NaCl, 20 μM thioflavin T, dan baik
Del atau Cya (pada konsentrasi molar 0-4 kali lipat relatif
terhadap peptida Aβ). Pembentukan fibril dipantau dengan
mengukur intensitas fluoresensi tioflavin T pada 480 nm dengan
eksitasi pada 440 nm menggunakan pembaca lempeng mikro
multi-mode (SpectraMax M2e; Molecular Devices, USA) pada 37 °
C dengan agitasi. Untuk mengukur efek dari konsentrasi yang
berbeda dari VMA (0 sampai 8 kali lipat molarequivalents),
sampel Aβ (10 μM untuk pengujian menggunakan agitasi sampel
dan 133 μM untuk pengujian tanpa agitasi) dikombinasikan
dengan konsentrasi VMA yang ditunjukkan. Sampel VMA yang
digunakan dalam penelitian ini biasanya mengandung 36% (b / b)
antosianin dengan berat molekul rata-rata 450, dan nilai-nilai ini
digunakan untuk memperkirakan konsentrasi molar VMA dalam
setiap percobaan.

• Kultur sel dan uji MTS

Untuk menentukan toksisitas relatif spesies Aβ, kami mengekspos

sel neuroblastoma Neuro 2a sel tikus (ECACC, UK) pada sampel
Aβ yang diekstraksi pada berbagai titik reaksi fibrilasi. Untuk
mempersiapkan setiap sampel Aβ, larutan yang mengandung
Aβ1-40 diinkubasi pada suhu 37 ° C selama 48 atau 96 jam
dengan ada atau tidak adanya VMA. Sebaliknya, larutan Aβ1-42
diinkubasi dalam kondisi yang identik untuk interval yang lebih
pendek (baik 24 atau 48 jam). Sel-sel neuro2a dikultur dengan
minimum essential medium (MEM) yang ditambah dengan 10% (v
/ v) heat-inactivated fetal bovine serum, 1 mM natrium piruvat,
0,1 mM larutan asam amino tidak esensial, 100 U / ml penisilin,
dan 100 μg / ml streptomisin. Reagen ini dibeli dari GIBCO. Sel-sel
disepuh pada pelat sumur 96-lubang dan dikultur dalam ruang
yang dilembabkan yang mengandung 5% (v / v) CO2 pada suhu
37 ° C. Ketika sel berkumpul, media dihilangkan dan sel dicuci
dua kali dengan fosfat buffered saline (PBS). Setelah dicuci, sel
dikultur dalam medium bebas serum selama 24 jam. Selanjutnya,
beberapa sumur terpapar 10 μgA β dalam PBS dan biakan
dibiarkan berlanjut selama 24 jam. Akhirnya, 100 μl larutan 3-
(4,5-dimethylthiazol-2yl) -5- (3 carboxymethoxyphenyl) -2- (4-
sulfophenyl) -2Htetrazolium (MTS) / phenazine methosulfate dari
CellTiter 96 AQueous proliferation cell assay (Promega)
ditambahkan ke setiap sumur dan sel diinkubasi selama 2 jam.
Sepuluh persen natrium dodesil sulfat (SDS) ditambahkan
(konsentrasi akhir, 1,6%) ke masing-masing sumur untuk
menghentikan reaksi sesuai dengan instruksi. Absorbansi pada
490 nm di setiap sumur dicatat menggunakan pembaca plat
SpectraMax M2e untuk menilai viabilitas sel. Persentase viabilitas
sel dinormalisasi sebagai berikut: 0% sesuai dengan nilai
absorbansi yang diperoleh ketika sel diperlakukan dengan 10 μM
melittin (Sigma), dan 100% sesuai dengan nilai absorbansi yang
diperoleh ketika sel diperlakukan dengan 50 mM sodium fosfat
buffer.

 Atomic force microscopy

Setelah periode inkubasi yang cukup, sampel fibril Aβ dewasa

dikumpulkan dan konsentrasinya disesuaikan. Alikuot dua puluh
mikroliter kemudian diterapkan pada mika yang baru saja
dibelah. Setelah inkubasi selama 30 menit pada suhu kamar (RT),
permukaan mika dicuci dengan 100 μl double - distilled water dan
dikeringkan. Pengukuran kekuatan atom mikroskop (AFM) dari
persiapan ini dilakukan pada RT pada model mikroskop
pemindaian Nanoscope IV MMAFM-2 (Digital Instruments, USA)
yang dilengkapi dengan cantilever NCHV-10V (Veeco Instruments,
Inc., USA).

 Photo-induced cross-linking of unmodified proteins and

western blotting
 Alikuot sebanyak sembilan mikroliter sampel Aβ yang diperoleh
pada berbagai waktu reaksi dicampur dengan 0,5 μl Tris (2,2
′bipyridyl) dichlororuthenium (II) (Ru (Bpy)) larutan stok (2 mM Ru
(Bpy) dan 40 mM ammonium persulfate) untuk cross-linking.
Sampel dicampur dan diekspos selama 5 menit hingga 365 nm
cahaya yang disediakan oleh UVGL-25 Compact UV Lamp (UVP,
USA). Setelah paparan, sampel dicampur dengan 3,3 μl buffer
sampel yang mengandung 150 mM Tris-HCl (pH 7,0), 12% SDS,
dan 6% mercaptoethanol untuk menghentikan reaksi dan
diinkubasi selama 15 menit pada suhu 37 ° C. Sampel-sampel ini
diaplikasikan pada gel elektroforesis (PAGE) Tris / Tricine
polyacrylamide20 dan dikenakan elektroforesis. Gel kemudian
diteteskan ke membran polivinilidena difluorida dan kemudian
diblokir dengan 10% susu kering tanpa lemak dan 0,1% Tween 20
dalam TBS (TBST) semalam pada suhu 4 ° C. Setelah inkubasi
dengan antibodi anti-Aβ (4G8, 1 / 1000; Covance, Zurich, Swiss)
dan 5% susu kering non-lemak di TBST selama 1 jam di RT,
membran dicuci tiga kali dengan TBST masing-masing selama 5
menit dan diinkubasi dengan konjugat horseradish peroxidase
(HRP) anti-tikus (HRP) konjugat (1/10000 ; GE Healthcare) dan 5%
susu kering tanpa lemak di TBST selama 1 jam di RT. Setelah
dicuci tiga kali dengan TBST masing-masing selama 5 menit,
sinyal terdeteksi dengan ECL Plus Western Blotting Detection
System (GE Healthcare).

I. Analisis plak Aβ
Tiga bagian yang tidak berdekatan dari setiap otak tikus yang
diuji diwarnai dengan antibodi anti-Aβ seperti yang dijelaskan di
atas. Luas hippocampus dari setiap bagian diukur dengan
menggunakan ImageJ (NIH) dan plak Aβ di daerah tersebut
dihitung secara manual. Jumlah rata-rata plak Aβ per milimeter
persegi masing-masing tikus dihitung.

Result

 VMA menekan tingkat sitotoksisitas Aβ1-42

Kami selanjutnya mempelajari sitotoksisitas fibril amiloid dan

oligomer Aβ peptida yang terbentuk sesuai denga ada atau tidak
adanya VMA. Percobaan penelitian diawali dengan pembentukan
fibril skala besar di tabung reaksi. Aβ1-42 dan Aβ1-40 peptida
dengan atau tanpa VMA (rasio molar 2,5 kali terhadap peptida Aβ;
volume total 2 ml) diinkubasi dalam tabung reaksi tanpa agitasi
pada suhu 37 ° C dan, pada interval waktu yang tepat, alikuot
ditarik dan dikenai ke uji thioflavin untuk menilai pembentukan
fibril. Gambar 2A menunjukkan hasil pemantauan. Karena kondisi
untuk pembentukan fibril berbeda dari yang ada pada Gambar.
1A dan D, pembentukan fibril berlangsung lebih lambat. Dengan
tidak adanya VMA, kedua peptida membentuk fibril amiloid,
dengan Aβ1-42 membentuk fibril lebih cepat daripada Aβ1-40.
Sebaliknya, peptida Aβ yang diinkubasi dengan VMA menunjukkan
hampir tidak ada peningkatan intensitas fluoresensi T tioflavin,
menunjukkan bahwa VMA menekan pembentukan fibril amiloid
baik Aβ1-42 dan Aβ1-40. Karakteristik struktural agregat yang
terbentuk pada kondisi ini mirip dengan yang diamati pada setiap
kondisi yang digunakan pada Gambar. 1. Untuk menyelidiki
toksisitas sampel Aβ yang diinkubasi yang dibentuk pada Gambar.
2A, sel Neuro 2a terpapar pada sampel Aβ untuk waktu yang
tepat dan viabilitas sel dinilai dengan uji MTS (Gambar 2B).
Viabilitas sel Neuro 2a yang terpapar pada sampel Aβ1-40 yang
terbentuk tanpa VMA sama dengan sel kontrol dan sel yang
diinkubasi dengan sampel Aβ1-40 yang terbentuk di hadapan
VMA. Hasil ini menunjukkan bahwa berbagai agregat yang
terbentuk oleh Aβ1–40 ditampilkan untuk menunjukkan toksisitas
intrinsik. Sebaliknya, viabilitas sel yang terpapar pada sampel
Aβ1−42 yang terbentuk tanpa VMA secara signifikan lebih rendah
daripada kontrol negatif (sekitar 30%), yang menunjukkan bahwa
sampel Aβ1-42 ini sangat beracun. Namun, toksisitas ini hampir
sepenuhnya dinetralkan dalam sampel Aβ1-42 yang diinkubasi
dengan adanya VMA. Viabilitas sel yang dikultur dalam media
yang mengandung VMA cenderung meningkat menjadi sekitar
115%, menunjukkan efek menguntungkan ringan dari VMA itu
sendiri ketika ditambahkan ke kultur sel. Namun, peningkatan
viabilitas sel terlihat ketika sampel Aβ1-42 toksik dipreinkubasi
dengan VMA secara signifikan lebih besar dari efek sederhana ini
(Gambar 2B, kanan). Hasil ini menunjukkan bahwa VMA secara
khusus menetralkan toksisitas Aβ1-42.

DISCUSSION

 Agregat Aβ pada tikus AD yang diobati dengan polifenol

Banyak penelitian menunjukkan bahwa polifenol seperti
resveratrol, oleuropein aglikon, dan ekstrak biji anggur
mengurangi jumlah plak Aβ, plak amiloid thioflavin S-positif, atau
kadar peptida Aβ dalam otak tikus AD. Di sisi lain, kelompok lain
telah menunjukkan bahwa ekstrak bilberry yang diperkaya
antosianin mengurangi gangguan kognitif tetapi tidak mengubah
kadar Aβ1-40 dan Aβ1-42 yang larut dan tidak larut dalam korteks
posterior (parietal-oksipital) punggung yang diukur dengan ELISA.
Dalam penelitian ini, kami menunjukkan bahwa peningkatan
jumlah agregat Aβ dalam hippocampus (Gbr. 4) dan kadar Aβ
yang tidak dapat larut terdeteksi pada otak tikus-tikus DT yang
diperlakukan VMA (Gbr. 5). Hasil ini sesuai dengan hasil dari
percobaan in vitro yang menunjukkan bahwa VMA menginduksi
pembentukan agregat non-fibrilar (Gambar 1B, C, E, dan 2A).
Meskipun hasil patologis kami berbeda dari temuan patologis
khas tikus model AD yang diobati dengan polifenol yang
dilaporkan oleh orang lain, ini mungkin karena mekanisme yang
menghambat pembentukan fibril amiloid berbeda sesuai dengan
jenis polifenol. Penelitian terperinci lebih lanjut diperlukan untuk
menentukan apakah agregat Aβ yang diamati pada tikus AD yang
diberi VMA menunjukkan perbedaan struktur dan neurotoksisitas
dari plak yang diperoleh dari tikus kontrol AD.

SUMMARY

VMA yang diperkaya antosianin secara langsung menghambat

pembentukan fibril amiloid Aβ1-42 dan mengurangi agregat toksik
secara in vitro. Tikus DT yang diberi makan VMA 1%
mempertahankan fungsi kognitif sambil menampilkan
peningkatan agregat Aβ yang tidak larut di otak. Temuan ini
menunjukkan bahwa anthocyanin mengalihkan Kami
mengusulkan bahwa VMA atau antosianin bertindak sebagai
profilaksis terhadap AD dengan menginduksi agregat Aβ1-42 yang
tidak beracun jika jumlah dan waktu pemberiannya sesuai.
agregasi Aβ ke bentuk tidak beracun daripada menekan agregasi.