Modul Praktikum Bioteknologi Dasar

Isolasi dan Identifikasi Bakteri

Dalam teknik bioteknologi, mikroorganisme adalah sumber yang paling

potensial untuk memperoleh produk yang komersil. Beberapa disiplin ilmu
berkontribusi dalam bidang bioteknologi untuk menghasilkan sejumlah produk
yang komersil, antara lain biologi molecular, mikrobiologi, biokimia,
immunologi, genetika, teknik kimia, dan biologi sel. Tahap isolasi dan identifikasi
bakteri merupakan tahap awal dalam memilih bakteri potensial dalam
menghasilkan produk yang potensial dan mengetahui jenis bakteri melalui
identifikasi bakteri melalui pengamatan makroskopik maupun amplifikasi DNA.
Selain itu, identifikasi bakteri dapat dilakukan melalui pengujian secara biokimia.

1. Gambarkan tahap teknik isolasi bakteri (gambar sendiri atau menggunakan

software diperbolehkan).
Modul Praktikum Bioteknologi Dasar

2. Gambarkan cara mengisolasi mikroba dengan menggunakan metode sebar

(spread plate method) dan metode gores (streak plate method). Gambar
sendiri atau menggunakan software diperbolehkan.

3. Uraikan jenis-jenis media inokulasi bakteri yang digunakan disertai dengan

komposisinya.

 Jenis-jenis Media Berdasarkan Bentuknya

1) Media Padat, Media padat mengnandung bahan pemadat atau agar
sekitar 15% sehinga bentuknya padat. Pada umumnya media ini
dipergunakan untuk menumbuhkan bakteri maupun jamur.
2) Media Setengah Padat, media yang mengandung agar sekitar
0,3-0,4% agar sehingga konsistensinya menjadi kenyal atau tidak
padat dan tidak cair. Pada umumnya media ini digunakan untuk
melihat pergerakan atau motilitas bakteri.
3) Media Cair, media yang tidak ditambahai bahan pemadat atau agar
sehingga konsistensinya cair. Media cair pada umumnya
dipergunakan untuk melihat sifat pertumbuhan bakteri seperti keruh
Modul Praktikum Bioteknologi Dasar

uniform, membentuk endapan berpasir atau membentuk untaian

rambut atau caput medusae.
 Jenis-jenis Media Berdasarkan Komposisinya
1) Media alami merupakan media yang disusun dari bahan-bahan
alami yang komposisinya tidak dapat diketahui secara pasti. Pada
umumnya media ini dibuat ekstrak dari bahan dasar seperti
kentang, daging, telur, tomat dsb.
2) Media semi sintetis merupakan media merupakan media yang
disusun dari bahan-bahan alami dan sintetis. Media semi sintetis
contohnya kaldu nutrisi yang terdiri dari pepton, NaCl, ektrak
daging dan aquades.
3) Media sintetis merupaka media yang disusun dari senyawa kimia
dengan formulasi takaran dan jenisnya diketahui secara pasti.
Contohnya Salmonella-Shigella agar, Mac Conkey agar dsb.
 Jenis-jenis Media Berdasarkan Fungsinya
1) Media Umum
Media umum merupakan media yang digunakan untuk
menumbuhkan semua jenis bakteri baik Gram positif maupun
Gram negatif. Pada media padat dalam bentuk lempeng agar isolat
mikroorganisme yang tumbuh membentuk koloni-koloni tertentu
yang dapat kita bedakan berdasarkan bentuk, warna, diameter dan
tepi koloni. Sebagai contoh media umum adalah nutrien agar atau
nutrien cair
2) Media Diferensial
Media diferensial merupakan media basal yang digunakan untuk
menumbuhkan bakteri serta bertujuan melihat sifat
pertumbuhannya. Contohnya blood agar. Pada media blood agar
biasanya digunakan untuk menumbuhkan bakteri secara umum,
tetapi sangat ideal untuk menumbuhkan bakteri fastidious seperti
bakteri kokus, Haemophilus dsb. Disamping itu media blood agar
juga digunakan untuk melihat sifat hemolitik bakteri yang
dikelompokan menjadi tiga yaitu alfa hemolitik atau zona hemolitik
Modul Praktikum Bioteknologi Dasar

tidak sempurna, beta hemolitik atau zona hemolitik sempurna dan

gama hemolitik atau tidak terbentuk zona hemolitik.
3) Media Diperkaya
Media ini pada umumnya digunakan untuk menumbuhkan bakteri
Salmonella dari sampel feces penderita. Sebagai contohnya selenite
broth dan tetrathionate broth. Pada media ini pertumbuhan bakteri
Coliform yang terdapat dalam saluran pencernaan hewan maupun
manusia akan ditekan oleh selenite atau tetrationate sebaliknya
Salmonella bisa tumbuh. Masa inkubasi optimum biakan pada
media diperkaya adalah 18 jam pada suhu 37 C.
4) Media Selektif
Media selektif merupakan media yang digunakan untuk
menumbuhkan bakteri-bakteri tertentu saja oleh karena media ini
mengandung zat inhibitor untuk menghambat pertumbuhan bakteri
lain. Contohnya media Mac Conkey agar plate (MCA).Pada media
MCA mengandung zaaat inhibitor garam empedu (bile salt) yang
berfungsi untuk menekan pertumbuhan bakteri Gram positif tetapi
menumbuhkan Gram negatif kecuali Pasteurella dan Haemophilus.

4. Isolasi mikroorganisme khususnya bakteri dapat dilakukan dengan teknik

bertingkat yaitu pengenceran. Apa yang dimaksud dengan teknik
pengenceran? Uraikan dan berilah dalam bentuk gambar tahap pengenceran
tersebut.

 Teknik Pengenceran adalah melarutkan atau melepasan mikroba dari

substratnya ke dalam air sehingga lebih mudah penanganannya. Tujuan
pengenceran yaitu untuk mengurangi kepadatan bakteri yang ditanam.
Penentuan besarnya atau banyaknya tingkat pengenceran tergantung
kepada perkiraan jumlah mikroba dalam sampel. Digunakan perbandingan
1 : 9 untuk sampel dan pengenceran pertama dan selanjutnya, sehingga
pengenceran berikutnya mengandung 1/10 sel mikroorganisma dari
pengenceran sebelumnya.
Modul Praktikum Bioteknologi Dasar

 Dari larutan kultur diambil 1 ml dan dimasukkan ke dalam 9 ml aquades

atau larutan buffer pepton untuk memperoleh dilusi 1/10 bagian.
 Dari larutan dilusi 1/10 diambil 1 ml dan dimasukkan ke dalam 9 ml
aquades atau larutan buffer pepton untuk memperoleh dilusi 1/100
bagian.
 Dari larutan dilusi 1/100 diambil 1 ml dan dimasukkan ke dalam 9 ml
aquades atau larutan buffer pepton untuk memperoleh dilusi 1/1000
bagian.
 Dari larutan dilusi 1/1000 diambil 1 ml dan dimasukkan ke dalam 9 ml
aquades atau larutan buffer pepton untuk memperoleh dilusi 1/10.000
bagian.
 Dan seterusnya
Modul Praktikum Bioteknologi Dasar

5. Pada isolasi bakteri dilakukan pengujian biokimiawi dan setelah

teridentifikasi memiliki potensi maka dilanjutkan ke tahap identifikasi jenis
bakterinya. Untuk melakukan hal tersebut dilakukan isolasi kromosom.
Uraikan dalam bentuk gambar mulai dari tahap isolasi bakteri hingga tahap
isolasi DNA kromosom dari bakteri.

 Langkah pertama untuk mendapatkan DNA plasmid adalah dengan

menumbuhkan sel-sel bakteri yang mengandung plasmid rekombinan.

 Setelah itu sel dipanen, dinding serta membran sel dipecah sehingga isi
sel (ekstrak sel) keluar. Falam penghomogenan setelah pemberian
lisozim, harus sampai larut supaya enzim bekerja merata dan efektif.
Modul Praktikum Bioteknologi Dasar

Setelah diberi fenol dan dibolak-balik seharusnya terdapat lendir jika

tutup tube dibuka. (Lebih baik semua tahap diatas dilakukan di atas es
yang telah diserut, untuk menjaga suhu supaya dingin).

 Ekstrak sel ini kemudian dipurifikasi dengan serangkaian

perlakuan sehingga diperoleh DNA plasmid yang murni.
Penambahan kloroform setelah sentrifugasi memisahkan
larutan menjadi fase cair dan padat dimana fase cair
merupakan DNA dan fase padat adalah campuran protein
dan DNA.
6. Uraikan fungsi penambahan bahan-bahan kimia dalam teknik isolasi DNA
kromosom.
 Sodium Dodecyl Sulphate (SDS) sebagai tahap pelisisan membran sel
dan mengurangi aktivitas enzim nuklease yang merupakan enzim
pendegradasi DNA.
 Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide (CTAB) untuk melisiskan
membran sel pada isolasi DNA tumbuhan.
 NaCl untuk mencegah terbentuknya kompleks CTAB-DNA.
 Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (EDTA) berperan menginaktivasi
enzim DNA yang dapat mendenaturasi DNA yang diisolasi, EDTA
menginaktivasi enzim nuklease dengan cara mengikat ion magnesium
dan kalsium yang dibutuhkan sebagai kofaktor enzim DNA.
 Larutan buffer untuk menjaga struktur DNA selama proses
penghancuran dan purifikasi sehingga memudahkan dalam
menghilangkan protein dan RNA serta mencegah aktivitas enzim
pendegradasi DNA dan mencegah perubahan pada molekul DNA.
Modul Praktikum Bioteknologi Dasar

 Fenol sebagai pendenaturasi protein, ekstraksi dengan menggunakan

fenol menyebabkan protein kehilangan kelarutannya dan mengalami
presipitasi yang selanjutnya dapat dipisahkan dari DNA melalui
sentrifugasi.

7. Keberhasilan isolasi DNA kromosom dapat dikonfirmasi dengan

menggunakan teknik elektroforesis. Uraikan teknik elektroforesis tersebut
disertai dengan gambar tahapannya hingga menunjukkan hasil isolasi DNA
kromosom.
Modul Praktikum Bioteknologi Dasar

 Pemasangan sisir pada cetakan gel agarosa

 Menuangkan larutan agarosa yang cair setelah pemanasan
 setelah permukaan gel padat, sisir diangkat
 setelah ditambahkan dengan larutan TBE, masukkan DNA
sampel pada setiap sumuran
 menghidupkan mesin elektroforesis dengan waktu, set voltase
dan arah migrasi yang telah ditetapkan
 hasil dari elektroforesis setelah diamati dengan UV illuminator

8. Uraikan komposisi dan cara pembuatan loading dye 6x dan larutan buffer
untuk elektroforesis agarose.

 Pembuatan loading dye 6x (0,25% bromophenol blue; 0,25% xylene cyalol;

15% ficoll tipe 4000; EDTA 120 mM)
1. Tambahkan 25 mg bromophenol blue ke dalam 6,7 mL ddH 2O dan
homogenkan
2. Tambahkan 25 mg xylenel cyanol FF dan homogenkan
3. Tambahkan 3,3 mL EDTA 120 mM dan homogenkan
4. Bekukan pada suhu -20 ⁰C untuk penyimpanan jangka panjang
 Pembuatan larutan buffer (242 g tris-base; 57,1 g asam asetat glacial; 100 mL
EDTA 0,5 M pH 8; dilarutkan dalam akuades hingga 1000 mL)
1. Timbang 242 g tris-base dan larutkan ke dalam 700 mLair deionisasi
2. Tambahkan 57,1 g asam asetat glasial dan 100 mL EDTA 0,5M (pH 8)
3. Dilarutkan dengan akuades hingga 1000 mL

9. DNA kromosom yang telah diperoleh dapat digunakan dalam tahap

amplifikasi melalui teknik PCR. Uraikan tahap preparasi DNA kromosom ke
tahap amplifikasi dan teknik PCR tersebut disertai dengan gambar tahapannya
disertai prinsipnya.
Modul Praktikum Bioteknologi Dasar

 Denaturasi, denaturasi awal dilakukan sebelum enzim taq polimerase

ditambahkan ke dalam tabung reaksi. Denaturasi DNA merupakan proses
pembukaan DNA untai ganda menjadi DNA untai tunggal. Ini biasanya
berlangsung sekitar 3 menit, untuk meyakinkan bahwa molekul DNA
terdenaturasi menjadi DNA untai tunggal. Denaturasi yang tidak lengkap
mengakibatkan DNA mengalami renaturasi (membentuk DNA untai ganda
lagi) secara cepat, dan ini mengakibatkan gagalnya proses PCR. Adapun
waktu denaturasi yang terlalu lama dapat mengurangi aktifitas enzim Taq
polymerase. Aktifitas enzim tersebut mempunyai waktu paruh lebih dari
2 jam, 40 menit, 5 menit masing-masing pada suhu 92,5; 95 dan 97,5 ⁰C.
 Annealling, Kriteria yang umum digunakan untuk merancang primer yang
baik adalah bahwa primer sebaiknya berukuran 18 – 25 basa, mengandung
50 – 60 % G+C dan untuk kedua primer tersebut sebaiknya sama. Sekuens
DNA dalam masing-masing primer itu sendiri juga sebaiknya tidak saling
berkomplemen, karena hal ini akan mengakibatkan terbentuknya struktur
sekunder pada primer tersebut dan mengurangi efisiensi PCR.
Waktu annealing yang biasa digunakan dalam PCR adalah 30 – 45 detik.
Semakin panjang ukuran primer, semakin tinggi temperaturnya. Kisaran
temperatur penempelan yang digunakan adalah antara 36 ⁰C sampai
dengan 72 ⁰C, namun suhu yang biasa dilakukan itu adalah antara
50 – 60 ⁰C.
 Extention, selama tahap ini Taq polymerase memulai aktivitasnya
memperpanjang DNA primer dari ujung 3’. Kecepatan penyusunan
nukleotida oleh enzim tersebut pada suhu 72oC diperkirakan 35 – 100
nukleotida/detik, bergantung pada buffer, pH, konsentrasi garam dan
molekul DNA target. Dengan demikian untuk produk PCR dengan panjang
2000 pasang basa, waktu 1 menit sudah lebih dari cukup untuk tahap
perpanjangan primer ini. Biasanya di akhir siklus PCR waktu yang
digunakan untuk tahap ini diperpanjang sampai 5 menit sehingga seluruh
produk PCR diharapkan terbentuk DNA untai ganda
Modul Praktikum Bioteknologi Dasar

10. Uraikan apa yang dimaksud dengan identifikasi 16S rDNA dan sekuensing
gen 16S rDNA.

 Identifikasi 16S rDNA, adalah analisis sekuensing gen 16S rRNA (16S
ribosomal Ribonucleic acid/Asam ribonukleat pengkode ribosom 16S, S
menyatakan Svedberg, yaitu satuan ukuran ribosom).
 Sekeunsing gen 16S rDNA, adalah gen bakteri 16S yang mengandung
Sembilan daerah hypervariable (V1-V9), mulai dari sekitar 30 hingga 100
pasangan basa panjang, yang terlibat dalam struktur sekunder dari subunit
ribosom kecil yang dapat memberikan tanda sekuens spesifik spesies yang
berguna untuk identifikasi bakteri.

11. Apakah fungsi dari penambahan komponen-komponen berikut dalam teknik

PCR:
a. dNTP 20-200 μM
b. Taq polymerase
c. Tris-HCl 10-50 mM
d. KCl atau MgCl2

a. dNTP 20-200 μM, berfungsi untuk mengikat ion Mg2+ sehingga dapat
mengubah konsentrasi efektif ion.
b. Taq polymerase, berfungsi sebagai enzim yang nantinya akan menambahkan
satu nukleotida A pada ujung 3' dari potongan DNA yang dihasilkan.
c. Tris-HCl 10-50 mM, berfungsi sebagai larutan buffer.
d. KCl atau MgCl2, berfungsi sebagai buffer standar untuk DNA template dan
primer dengan kondisi tertentu.
Modul Praktikum Bioteknologi Dasar

12. Uraikan tahap teknik sekuensing dengan menggunakan metode Sanger dan
metode BLAST
 Metode Sanger
1) penyiapan DNA
2) proses amplifikasi melalui PCR dengan menggunakan primer universal
3) pemurnian DNA
4) elektroforesis
5) pembacaan elektroforegam hasil sekuensing
 Metode BLAST
Hasil sekuensing yang telah dianalisis ditentukan indentifikasi spesiesnya
menggunakan proses BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) yaitu
membandingkan dengan database sekuen DNA pada genbank.
Software yang dapat digunakan untuk menentukan homologi suatu urutan
DNA atau asam amino dengan data yang ada di NCBI. BLAST memiliki
beberapa pilihan menu sesuai dengan analisis yang akan dikerjakan seperti pada
tabel di bawah ini:

1) Buka halaman awal NCBI dan pilih BLAST

2) Pada tampilan tersebut, terdapat beberapa pilihan penyejajaran, antara lain
program BLAST untuk nukleotida dan untuk protein. Pada modul ini
deberikan contoh BLAST untuk nukleotida dari INS Homo sapiens dan
Mus musculus. (Pencarian sekuen mengikuti langkah-langkah
sebelumnya)
3) Klik kolom Allign two or more sequences untuk membandingkan 2
sekuen nukleotida. Kemudian dimasukkan sekuen yang ingin
dibandingkan pada kolom yang telah tersedia.
4) Sekuen yang dimasukkan harus dalam format FASTA
5) Setelah sekuen dimasukkan diklik tanda BLAST pada bagian bawah,
Pada tampilan tersebut terdapat suatu skala yang menunjukkan tingkat
kesamaan sekuen yang dibandingkan. Berdasarkan hasil tampilan tersebut
terdapat suatu garis berwarna merah, hal ini menunjukkan bahwa kedua
sekuen tersebut memiliki urutan yang sangat mirip yaitu lebih dari 200
nukleotida.