3.

4 Effects of pH value on the adsorption (efek nilai pH pada adsorpsi)

Adsorpsi protein biasanya dipengaruhu oleh nilai pH. Untuk meningkatkan spesifisitas terhadap igG
serangkaian larutan adsorpsi dengan nilai pH yang berbeda berhasil mengoptimalkan kondisi adsorpsi. Hasil
ditunjukkan di gambar 5. Kapasitas adsorpsi untuk albumin menurun hingga nol sebagai nilai pH yang
meningkat dari 3 menjadi 4. Sementara itu adsorpsi kapasitas untuk igG tidak berubah. Karena titik isielektrik
albumin mendekati 4,6, albumin selalu menjaga netralitas elektrik disekitar nilai pH ini. Hal ini menyebabkan
interaksi elektrostatik antara albumin dan thiophillic magnetic beads ini sangat menurun. Hal ini beralasan
karena tidak ada albumin yang terdeteksi setelah ikatan protein itu pulih pada saat adsorpsi yang dilakukan
pada pH 4. Oleh karena itu spesifisitas kuat dari magnetic beads ini menuju igG diekspresikan dalam beberapa
kondisi asam lemah.

Ligan tiofilik diketahui memiliki interaksi campuran (interaksi hidrofobik dan interaksi donor-akseptor
elektron (EDA)) dengan antibodi. Untuk interaksi hidropholik, perubahan entalpi selalu kecul dan perubahan
entropi adalah kekuatan utama untuk menentukan energi bebeas Gibbs. Suhu harus memiliki efek hebat pada
∆G. Untuk membedakan interaksi EDA dari interaksi hidrofobik, adsorpsi masing-masing dilakukan pada 00C
dan 3700C. Nilai-nilai negatif ∆ G untuk setiap suhu menunjukkan bahwa adsorpsi adalah proses yang
menguntungkan. Tidak ada perubahan signifikan dari energi bebas Gibbs dan kapasitas adsorpsi untuk setiap
suhu. Dengan demikian, kekuatan pendorong ligan tiofilik antara igG terutama didorong oleh perubahan
entalpi, yang berarti adsorpsi dikontrol oleh efek EDA.

3.5 Mild conditions for the recovery (kondisi ringan untuk pemulihan)

Proses isolasi yang baik harus merupakan kombinasi yang sempurna antara adsorpsi dan pemulihan.
Tetapi adsorpsi spesifik dan desorpsi bertentangan dalam batas tertentu. Untuk mencapai spesifisitas tinggi
terhadap antibodi, diperlukan interaksi yang sangat selektif antara igG dan sorben. Namun mengingat
pemeliharaan bioaktivitas antibodi, lebih baik melepaskan protein yang terikat dalam beberapa kondisi ringan.
Ditemukan pada tabel 1 bahwa banyak kondisi dalam beberapa metode konvensional yang agak kasar, tidak
menguntungkan dalam menjaga bioaktivitas antibodi.

Serangkaian garam (NaCl, KCl, Na2SO4, (NH4)2SO4, K2SO4, dan Na2CO3) digunakan untuk
melepaskan antibodi yang terikat. Pada gambar 6, jelas bahwa protein yang terikat dapat pulih dengan lancar
L-1
bahkan dalam konsentrasi rendah (0,1 mol ). Itu berarti interaksi spesifik antara igG dan thiophillic
magnetic beads dapat dengan mudah dihancurkan oleh efek ion garam. Larutan (NH4)2SO4 menjadi lebih
L-1
efektif untuk memulihkan igG yang diserap pada konsentrasi rendah (0,1 mol ). Tetapi kelompok amina
L-1
tidak ramah terhadap biaktivitas antibodi. Dengan demikian larutan KCl (0,2 mol ) dipilih sebagai buffer
elusi untuk melepaskan antibodi yang terikat.
 Dengan demikian, baik adsorpsi maupun desorpsi dapat dilakukan dalam kondisi ringan sehingga
bioaktivitas igG dapat dipertahankan sebanyak mungkin. Tes ELISA digunakan untuk mengukur bioaktivitas
karena afinitas spesifik antara antibodi dan antigen. Bioaktivitas igG terisolasi mencapai 98%.

Fig. 5. Dependence of adsorption with the pH value of adsorption buffer. (A) The adsorption behavior was
effected by the pH value of adsorption buffer. The standard deviation of these data (SD) is below 7%. (B) The
corresponding isolated IgG was changed with the pH value of adsorption buffer. SD < 5%) (error bars: ±SD).

Fig. 6. Effect of types and concentration of different salts in elution on the recovery of bound IgG from magnetic
beads (error bars: ±SD) The standard deviation of these data is as follows: SD(K2 SO4 ) < 5%, SD(KCl) < 4%, SD((NH4 )2
SO4 ) < 7%, SD(NaCl) < 5%,
SD(Na2 SO4 ) < 5%).

3.6 Repeated use of these magnetic absorbent (penggunaan berulang magnetik absorben)

Pemisahan batch dilakukan untuk menguji potensi teknologi dalam pemurnian skala besar, proses
ditunjukkan pada gambar 7. Isolasi berturut-turut digunakan untuk mengisolasi igG dari plasma manusia untuk
mengurangi konsentrasi residu igG. Itu berarti bahwa plasma berulang kali diisolasi oleh magnetic beads
hingga igG diekstraksi sepenuhnya. Ditemukan pada gambar 7 bahwa puncak igG menghilang setelah empat
kali berturut-turut isolasi.

Butuh 1,5 jam di laboratorium untuk mengekstrak 36,4 mg igG dari 4 ml plasma manusia. Efisiensi
isolasi mencapai 76,4%, yang lebih tinggi dari itu dengan menggunakan T-gel tiofilik biasa. Keuntungan
penting yang lain dari magnetic beads bahwa magnetik ini dapat langsung digunakan kembali setelah protein
yang terikat ditemukan dalam larutan garam. Ini berarti bahwa magnetic beads dapat digunakan berulang kali
tanpa perawatan regenerasi. Ditemukan pada gambar 7 bahwa efisiensi isolasi menurun sedikit setelah 16
siklus adsorpsi-desorpsi. Kesalahan terkait kapasitas adsorpsi lebih kecil dari 1%

Keuntungan nyata dari teknologi ini adalah, seperti bioaktivitas dan kemurnian tinggi, pengoperasian
yang mudah, kondisi ringan dan pemanfaatan daur ulang yang sangat baik, semua diperlihatkan.
Dibandingkan dengan adsorben protein A, thiophillic magnetic beads lebih nyaman dan bersih. Ini menjadi
sangat stabil dalam kondisi basa atau asam sehingga kebocoran dari ligan teofilik bisa efektif untuk dihindari
karena hubungan kovalen antara ligan teofilik dan magnetic beads. Dengan demikian, perawatan sanitasi
drastis bisa langsung digunakan untuk mensterilkan dan mendesinfeksi untuk magnetic beads. Namun
perawatan ini tidak dapat digunakan dalam adsorben protein A karena sifat proteinnya. Selain itu, kebocoran
magnetic beads juga diselidiki. Tidak ada sinyal Fe+3 yang ditemukan dalam antibodi yang terisolasi ketika
diukur dengan spektrofotometer plasma yang digabungkan secara induktif.

Magnetic beads ini diaplikasikan pada alas yang sudah distabilkan secara megnetis. Tergantung pada
teknologi ini, pemurnian protein dapat dilakukan secara kontinu, yang menjadi lebih efisien dan stabil
daripada proses batch. Oleh karena itu, magnetik adsorben hanya menyediakan metode yang menjanjikan
untuk memurnikan antibodi dalam skala besar.

Fig. 7. Successive isolation of IgG by the thiophilic magnetic beads and its repeated use. (4 mL human plasma was
isolated by 1.7 g magnetic beads. Adsorption buffer: 25 mM PBS pH 4.5; elution buffer: 0.2 M KCl aqueous
solution; a: dulated human plasma (×35); b: 1st adsorption supernatant; c: 2nd adsorption supernatant; d: 3rd
adsorption supernatant; e: 4th adsorption supernatant; f: 1st isolated IgG solution; g: 2nd isolated IgG solution;
h: 3rd isolated IgG solution; i: 4th isolated IgG solution. The standard deviation of these date is below 6%. (error
bars: ±SD).