Abstrak Tujuan dari penelitian ini adalah

untuk
(P<0,001). Metode pewarnaan fluoresen diferensial lebih
mengevaluasi metode pewarnaan yang berbeda untuk
sensitif daripada pewarnaan Gram dalam deteksi bakteri dalam
membedakan bakteri gram positif dan bakteri gram negatif
kultur darah selama periode inkubasi. Teknik ini
dalam fluoresensi. Metode ini didasarkan pada dua fluorokrom,
memberikancepat, sederhana metode pewarnaan yangdan
satu bertindak dalamgelombang panjangmerah, yaitu oranye
sangat sensitif yang dapat digunakan bersama dengan metode
acridine, dan yang lain bertindak dalam panjang gelombang
subkultur. Sedangkan subkultur membutuhkan masa inkubasi
hijau, yaitu fluorescein. Dengan metode ini, bakteri gram positif
18-24 jam, teknik pewarnaan flu dapat mendeteksi bakteri
tampak kuning dan bakteri gram negatif tampak hijau.
pada hari yang sama saat apusan disiapkan dan diperiksa.
Mengingat pentingnya diagnosis etiologi yang cepat dalam
Metode pewarnaan fluoresen diferensial juga dievaluasi
kasus-kasus septikemia, metode pewarnaan diferensial dalam
kemampuannya untuk mendeteksi mikroorganisme dalam
fluoresensi dibandingkan dengan pewarnaan Gram untuk
cairan otak dan spesimen klinis lainnya. The microorgan-
mendeteksi bakteri dalam darah. Dari 5.820 kultur darah yang Eur J Clin Microbiol Infect Dis (2002) 21: 373-378
DOI

dimasukkan ke dalam penelitian dan diidentifikasi

10.1007 / s10096-002-0731-3

olehfluorescent Bactec 9120 instrumen(Becton Dickinson

ARTICLE
Europe, Prancis), 774 positif. Dari 774 kultur positif, 689 hanya

menghasilkan satu organisme. Metode pewarnaan diferensial

dalam fluoresensi mendeteksi 626 dari 689 kultur, sedangkan

pewarnaan Gram mendeteksi 468. Berdasarkan hasil ini,

sensitivitas metode pewarnaan diferensial dalam fluoresensi

adalah 90,9%, sedangkan pewarnaan Gram adalah 67,9%.

Perbedaan antara kedua metode secara statistik signifikan

isme mudah dideteksi, bahkan ketika jumlah bakteri dalam
acridine, buffer pada pH asam, digunakan untuk memberikan
spesimen rendah. satu warna untuk bakteri dan warna yang kontras untuklatar

belakang bahan[6]. Pewarna ini berfluoresensi melalui interaksi

Pendahuluan
dengan DNA dan RNA, atau oleh gaya tarik elektrostatik [7].
Pentingnya diagnosis etiologi yang cepat dalam kasus
Dalam percobaan sebelumnya kami mencatat bahwa bakteri
septikemia tidak perlu dipersoalkan lagi. Banyak penulis telah
gram positif dan gram negatif yang diwarnai dengan acridine
menggunakan pewarnaan jeruk acridine yang sangat sensitif
orange dihilangkan warna secara berbeda oleh etil alkohol /
untuk meningkatkan deteksi bakteri dalam kultur darah [1, 2, 3,
aseton. Hipotesis kami adalah bahwa, pada konsentrasi yang
4]. Dalam penelitian ini, kami membandingkan metode
digunakan, oranye acridine berinteraksi dengan
pewarnaan fluoresen diferensial dengan pewarnaan Gram untuk
komponenbakteri dinding sel, seperti polisakarida [8, 9] dan
deteksi organisme dalam kultur darah.fluoresen diferensial
lipopoly- sakarida [10]. Mungkin, etil alkohol / aseton

Metode pewarnaanmembedakan bakteri gram positif dan

mendepresi membran luar yang kaya lipopolysaccharide dari
bakteri gram negatif dalam fluoresensi dan dapat diterapkan
bakteri gram negatif, sebagian menghilangkan pewarna dari
pada spesimen klinis. Sebelumnya, Mason et al. [5] bakteri ini. Dengan demikian, prosedur ini dapat meningkatkan
menggambarkan pewarnaan Gram fluorescent yang cocok
kemampuan fluorescein untuk menghasilkandiferensial efek
untuk deteksi bakteri hidup dalam suspensi, tetapi mereka
pewarnaan. Karena dekolourisasi oleh etil alkohol / ace- tone
menemukan teknik tersebut tidak cocok untuk deteksi bakteri
menghasilkan sedikit perubahan pada bakteri yang diwarnai
tetap [5]. Kami menggunakan dua fluorokrom, satu bertindak
dengan fluorochrome acridine orange, kami
dalamgelombang panjangmerah, dan yang lain bertindak
menggunakanmerah / hijau
dalam panjang gelombang hijau, yang bersama-sama ) · G. Riario Sforza
P. Fazii(✉ Patologi Klinis Rumah Sakit “Spirito
membentuk sistem merah / hijau. Dalam panjang gelombang
Santo”, Via Fonte Romana 8 , 65100 Pescara, Italia e-mail:
merah, kami menggunakan oranye acridine. Noda oranye
paolo.fazii@tin.it Tel .: + 39-085-4252542, Faks: + 39-085-4252699

E.Ciancaglini Rumah Sakit Militer, Villa Comunale, 66100 Chieti, Italia

Metode Diferensiasi Fluoresen

P. Fazii · E. Ciancaglini · G. Riario Sforza

Diferensial untuk Deteksi Bakteri dalam Kultur Darah, Cairan

Serebrospinal dan Spesimen Klinis Lainnya

Diterbitkan online: 17 Mei 2002 ©

Springer-Verlag 2002
sistem dengan menambahkan fluorochrome kedua,
Klebsiella pneumoniae (27 strain), Klebsiella oxytoca (12 strain),
fluorescein, untuk mengintensifkan ini perbedaan. Bakteri
Citrobacter freundii (13 jenis), Enterobacter cloacae (9 strain),

yang lebih tahan terhadap dekolourisasi (bakteri gram positif)

Enterobacter aerogenes (18 strain), Pseudomonas orescens flu- (2 jenis),

Pseudomonas aeruginosa ( 20 galur), Burk-holderia cepacia (3 galur),

akan tetap memiliki jumlah oranye acridine yang cukup dan
Proteus mirabilis (8 galur), Proteus vulgaris (3 galur), Morganella
akan muncul kuning ketika fluorochrome merah ditambahkan
morganii (5 galur), Stenotrophoastas maltophilia (3 galur), Shigella
ke fluorochrome kedua (hijau). Sebaliknya, bakteri yang kurang
flexneri (2 galur), Serra-tia marcescens (4 galur), Serratia liquefaciens (6
tahan terhadap dekolourisasi (bakteri gram negatif) tidak akan
galur), Hae- mophilus influenzae (6 galur), Neisseria meningitidis (5

mempertahankan cukup oranye acridine dan akan muncul hijau.

galur) dan Acinetobacter baumannii (8 galur). Spesies bakteri diperoleh

dari budaya positif yang diketahui. Slide disiapkan dengan terlebih dahulu
Dalam penelitian ini, metode pewarnaan fluoresen diferensial
menempatkan setetes air suling pada slide dan kemudian menerapkan
diuji menggunakan spesies bakteri yang berbeda, termasuk
sampel kultur. Apusan kemudian dikeringkan dengan udara dan difiksasi
coccigram positif dan gram negatif dan basil. Kami juga
dengan panas.
mengevaluasi kemampuan metode ini untuk mendeteksi
Pengumpulan, Kultur dan Subkultur Spesimen Darah
mikroorganisme dalam kultur darah serta apusan yang dibuat
Spesimen
dari cairan serebrospinal dan spesimen klinis lainnya, yaitu
darah dikumpulkan menggunakan teknik steril. Di laboratorium, 10 ml
sekret uretra dankulit eksudat inflamasi.
spesimen darah diinokulasi ke dalam botol kultur Bactec Plus Aerobic / F,

Anaerobic / F atau Ped Plus (Becton-Dickinson Europe, Prancis). Botol

Bahan dan Metode
yang diinokulasi ditempatkan dalam instrumen seri fluoresen Bactec
Mikroorganisme
(Bactec 9120), di mana mereka diuji secara otomatis. Sampel darah dari

Berikut adalah 328 jenis bakteri gram positif dan gram negatif yang botol positif disubkultur. Sampel 0,3-0,5 ml disedot ke dalam jarum suntik

dimasukkan dalam penelitian ini: Staphylococcus au-reus (40 jenis), melalui jarum steril. Beberapa bagian bahan aspirasi diaplikasikan pada

Staphylococcus aureus ATCC 29213 (1 jenis), Staphylococcus media padat berikut, semua diperoleh dari bioMérieux, Prancis: agar

epidermidisepidermidis (15 jenis),(15 jenis), Staphylococcusolyticus coklat, agar darah, agar garam manitol, agar MacConkey, agar darah

haem- (5 jenis), Streptococcus pyogenes (20 strain), Streptococcus Schaedler, agar darah Schaedler dan agar Sabouraud dextrose agar. Pelat

salivarius (6 strain), Streptococcus mitior (4 strain), Streptococcus kemudian diinkubasi pada suhu 35 ° C dalam atmosfer aerobik atau

pneumoniae (5 jenis), Streptococcus agalactiae (7 strain), Enterococcus anaerob. Semua lempeng subkultur diinkubasi selama 48 jam dan

faecalis (11 strain ), Enterococcus faeci- (7 strain), Corynebacterium spp.diperiksa setelah 24 dan 48 jam inkubasi. Strain bakteri diidentifikasi oleh

(5 galur), Listeria monocytogenes (4 galur), Gardnerella vaginalis (5 sistem API (bioMérieux)

374
galur), Gemella haemolysans (3 galur), Providencia rettgeri (8 galur),

Escheria coli (27 galur), Escherichia coli ATCC 35218 (1 strain), atau sistem Vitek (bioMérieux). Corak duplikat disiapkan dari masing-
masing vial biakan positif dan diwarnai dengan pewarnaan Gram dan Buffer asetat (pH 4) mengandung 82 ml asam asetat (0,2 mol / l) dan 18

dengan fluorokrom diferensial. Setelah spesimen diaplikasikan, slide ml natrium asetat (0,2 mol / l). Etil alkohol / aseton disiapkan sebagai

dikeringkan dengan udara dan difiksasi dengan panas. Slide ditutupi padalarutan 50% -50%, sehingga 100 ml larutan mengandung 50 ml etil

status hasil subkultur positif dan diperiksa menggunakan pembesaran × alkohol dan 50 ml aseton. Solusi pewarnaan natrium fluorescein

1000. PF membaca hasil pewarnaan Gram. GRS membaca hasil yang (Tecnochimica Industri-ale, Italia) disiapkan sebagai larutan 0,002%

diperoleh dengan persiapan fluoresens. Hasil reaksi Gram tidak diketahuidalam etil alkohol (pH 5,5). Volume larutan 100 ml mengandung 2 mg

oleh GRS Semua slide dan vii kultur darah diberi kode dengan angka yang
natrium fluorescein, 1,5 ml asam asetat, 0,5 ml buffer asetat (pH 4,6) dan

dihasilkan secara acak. EC melakukan pembutakan dan memiliki kode. 98 ml etil alkohol. Buffer asetat (pH 4,6) mengandung 52 ml asam asetat

(0,2 mol / l) dan 48 ml natrium asetat (0,2 mol / l). Karena sensor kimia
Spesimen Klinis
yang terkandung dalam botol kultur Bactec Plus Aerotic / F dan

Apusan sekresi uretra diperoleh dari pasien pria dengan dugaan infeksi Anaerobik / F mengganggu konsentrasi di atas, slide yang dibuat dari

gonokokal. Duplikasi smear diaplikasikan pada lempeng agar Thayer- kultur darah diwarnai dengan larutan berikut: larutan

Martin yang dimodifikasi (Biolife Italiana, Italia), yang kemudian

q acridine orange 10% dalam buffer asetat (pH 4). Jadi, 100 ml larutan
diinkubasi pada 35 ° C dalam 5% CO2. Apusan eksudat inflamasi kulit
mengandung 10 g jeruk asridin dalam 100 ml buffer asetat (pH 4); q
diperoleh dari pasien pria dengan folikulitis superfisial. Sebagian dari
larutan etil alkohol / aseton 50% –50%. Jadi, 100 ml larutan
masing-masing spesimen diaplikasikan pada pelat agar coklat yang
mengandung 50 ml etil alkohol dan 50 ml aseton; q larutan natrium
diperkaya (Biolife Italiana), yang kemudian diinkubasi pada 35 ° C dalam
fluorescein 0,0001% dalam etil alkohol (pH 5,5). Jadi, 100 ml larutan
5% CO2. Slide disiapkan dengan terlebih dahulu menerapkan spesimen
mengandung 0,1 mg natrium fluorescein, 1,5 ml asam asetat, 0,5 ml buffer
pada slide, yang kemudian dikeringkan dengan udara dan difiksasi dengan
asetat (pH 4,6) dan 98 ml etil alkohol.
panas. Sampel cairan serebrospinal diaplikasikan pada slide dan difiksasi

dengan panas, diwarnai dengan pewarnaan Gram dan dengan pewarnaan Prosedur Pewarnaan

fluoresen diferensial dan diperiksa tanpa orang tersebut memeriksa slide

Pertama, slide ditutup dengan larutan oranye acridine selama 2 menit
yang memiliki pengetahuan tentang hasil kultur. Sampel masing-masing
untuk memungkinkan pewarnaan bekerja. Setelah itu, slide dibilas dengan
spesimen diaplikasikan pada media kaldu jantung otak dan media kalio
air ledeng. Larutan etil alkohol / aseton diterapkan dan diaplikasikan
glikolat (Biolife), yang kemudian diinkubasi pada suhu 35 ° C. Strain

bakteri diidentifikasi oleh sistem API (bioMérieux) atau oleh sistem Vitek

(bioMérieux).

Solusi Pewarnaan
Pewarnaan larutan

oranye Acridine (Sigma-Aldrich, Italia) disiapkan sebagai solusi 0,7%

dalam buffer asetat (pH 4). Volume 100 ml larutan acridine orange

mengandung 700 mg acridine orange dalam 100 ml buffer asetat (pH 4).