Tes Diagnostik terkini untuk COVID-19.

Gejala-gejala yang diungkapkan oleh pasien COVID-19 tidak

spesifik dan tidak dapat digunakan untuk diagnosis yang akurat. Guan et al. melaporkan bahwa 44% dari
1099 COVID-19 pasien dari China mengalami demam ketika mereka memasuki rumah sakit dan bahwa
89% mengalami demam saat di rumah sakit.25 Mereka lebih lanjut menemukan bahwa pasien
mengalami batuk (68%), kelelahan (38%) , produksi dahak (34%), dan sesak napas (19%). Banyak dari
gejala ini dapat dikaitkan dengan infeksi pernapasan lainnya. Tes asam nukleat dan pemindaian CT telah
digunakan untuk mendiagnosis dan menyaring COVID-19.

Teknik-teknik molekuler lebih cocok daripada pengujian sindrom dan CT scan untuk diagnosis yang
akurat karena mereka dapat menargetkan dan mengidentifikasi patogen spesifik. Perkembangan teknik
molekuler tergantung pada pemahaman (1) komposisi proteomik dan genom patogen atau (2) induksi
perubahan ekspresi protein / gen dalam inang selama dan setelah infeksi. Pada 24 Maret 2020,
komposisi genomik dan proteomik dari SARS-CoV-2 telah diidentifikasi, tetapi respons host terhadap
virus tersebut masih dalam penyelidikan. Urutan genom pertama dari SARS-CoV-2 dilakukan dengan
sekuensing RNA metagenomik, sebuah metode yang tidak bias dan proses-tinggi dari sekuensing
beberapa genom. 26 Temuan ini diungkapkan secara publik, dan urutan ditambahkan ke repositori
urutan GenBank pada bulan Januari. 10, 2020.26,27 Sejak saat itu, lebih dari 1000 urutan telah tersedia
pada Inisiatif Global tentang Berbagi Semua Data Influenza (GISAID) dan GenBank oleh para peneliti di
seluruh dunia.29,30 Menurut laporan bersama oleh Organisasi Kesehatan Dunia ( WHO) dan China, 104
strain virus SARS-CoV-2 diisolasi dan diurutkan menggunakan sequencing Illumina dan Oxford nanopore
dari akhir Desember 2019 hingga pertengahan Februari 2020.2,4 Sequencing Illumina adalah metode
sintesis urutan-per-sintesis menggunakan solid amplifikasi jembatan fase, di mana sekuensing nanopore
melibatkan translokasi molekul DNA melalui pori protein dan mengukur pergeseran tegangan berikutnya
untuk menentukan urutan DNA. Sekuensing genom diimpor semut bagi peneliti untuk merancang
primer dan memeriksa urutan untuk PCR dan tes asam nukleat lainnya.

Pengujian Asam Nukleat. Merancang Tes Asam Nukleat untuk SARS-CoV-2. Pengujian asam nukleat
adalah metode utama untuk mendiagnosis COVID-19.32 Sejumlah kit reaksi balik rantai transkripsi
polimerase (RT-PCR) telah dirancang untuk mendeteksi SARS-CoV-2 secara genetik (Tabel 1). RT-PCR
melibatkan transkripsi terbalik RNA SARS-CoV-2 menjadi untai DNA komplementer (cDNA), diikuti oleh
amplifikasi daerah spesifik cDNA.33,34 Proses desain umumnya melibatkan dua langkah utama: (1)
penyelarasan urutan dan desain primer, dan (2) pengujian dan optimalisasi pengujian. Corman et al.
menyelaraskan dan menganalisis sejumlah sekuens genom virus yang berhubungan dengan SARS untuk
merancang serangkaian primer dan probe.35

Di antara genom virus yang berhubungan dengan SARS, mereka menemukan tiga wilayah yang telah
melestarikan sekuens: (1) gen RdRP (RNA-dependen RNA gen polimerase) dalam kerangka bacaan
terbuka wilayah ORF1ab, (2) gen E (gen protein amplop), dan (3) gen N (gen protein nukleokapsid).
Kedua gen RdRP dan E memiliki sensitivitas analitik yang tinggi untuk deteksi (batas deteksi 3,6 dan 3,9
salinan per reaksi), sedangkan gen N memberikan sensitivitas analitik yang lebih buruk (8,3 salinan per
reaksi). Pengujian dapat dirancang sebagai sistem dua target, di mana satu primer secara universal
mendeteksi banyak virus korona termasuk SARS-CoV-2 dan set primer kedua hanya mendeteksi
SARS-CoV-2.

Setelah merancang primer dan probe, langkah selanjutnya melibatkan mengoptimalkan kondisi
pengujian (misalnya, kondisi reagen, waktu inkubasi, dan suhu), diikuti dengan pengujian PCR. RT-PCR
dapat dilakukan dalam pengujian satu langkah atau dua langkah. Dalam pengujian satu langkah,
transkripsi balik dan amplifikasi PCR dikonsolidasikan menjadi satu reaksi. Format pengujian ini dapat
memberikan hasil yang cepat dan dapat direproduksi untuk analisis throughput tinggi.

Tantangannya adalah kesulitan dalam mengoptimalkan transkripsi terbalik dan langkah-langkah

amplifikasi ketika mereka terjadi secara bersamaan, yang mengarah pada generasi amplikon target yang
lebih rendah. Dalam pengujian dua langkah, reaksi dilakukan secara berurutan dalam tabung yang
terpisah. Format pengujian ini lebih sensitif daripada pengujian satu langkah, tetapi lebih memakan
waktu dan membutuhkan pengoptimalan parameter tambahan.

Terakhir, kontrol perlu dilakukan. dipilih dengan cermat untuk memastikan keandalan pengujian dan
untuk mengidentifikasi kesalahan eksperimental. Alur Kerja untuk Pengujian Asam Nukleat untuk
SARS-CoV-2. Setidaknya 11 metode berbasis asam nukleat dan delapan alat pendeteksi antibodi telah
disetujui di China oleh National Medical Products Administration (NMPA) untuk mendeteksi
SARS-CoV-2.38 Namun, RT-PCR adalah metode yang paling dominan digunakan untuk mendiagnosis
COVID- 19 menggunakan sampel pernapasan. Sampel pernapasan atas direkomendasikan secara luas,
meskipun sampel pernapasan bawah direkomendasikan untuk pasien yang menunjukkan batuk
produktif. Sampel saluran pernapasan atas termasuk penyeka nasofaring, penyeka orofaringeal,
pencucian nasofaring, dan aspirasi hidung. Sampel saluran pernapasan bawah termasuk dahak, cairan
BAL, dan aspirasi trakea. Baik aspirasi BAL maupun trakea dapat berisiko tinggi untuk pembentukan
aerosol. Viral load yang terdeteksi tergantung pada hari-hari setelah onset penyakit. Dalam 14 hari
pertama setelah onset, SARS-CoV-2 paling bisa dideteksi dalam dahak diikuti oleh usap hidung,
sedangkan usap tenggorokan tidak dapat diandalkan 8 hari setelah onset gejala. 41,42 Mengingat
variabilitas dalam viral load, tes negatif hasil dari sampel pernapasan tidak mengesampingkan penyakit.
Negatif ini dapat dihasilkan dari teknik pengambilan sampel yang tidak tepat, viral load yang rendah di
daerah sampel, atau mutasi pada genom virus.3,43 Winichakoon et al. merekomendasikan banyak jalur
bukti untuk pasien yang terkait secara epidemiologis bahkan jika hasilnya negatif dari swab nasofaring
dan / atau swab orofaring.43

Pusat Kontrol dan Pencegahan Penyakit (CDC) Amerika Serikat menggunakan uji RT-PCR (rRTPCR)
real-time satu langkah. , yang menyediakan informasi kuantitatif tentang viral load, untuk mendeteksi
keberadaan SARS-CoV-2.44 Untuk melakukan pengujian, RNA virus diekstraksi dan ditambahkan ke
master mix. Campuran master mengandung air bebas nuklease, primer maju dan mundur, probe
fluorophore-quencher, dan campuran reaksi (terdiri dari transkriptase terbalik, polimerase, magnesium,
nukleotida, dan aditif) .32 Campuran master dan RNA yang diekstraksi dimasukkan ke dalam
thermocycler PCR, dan suhu inkubasi diatur untuk menjalankan pengujian. CDC telah
merekomendasikan kondisi bersepeda untuk rRT-PCR.44 Selama rRTPCR, probe fluorophore-quencher
dibelah, menghasilkan sinyal fluorescent. Sinyal fluoresen terdeteksi oleh thermocycler, dan progres
amplifikasi direkam secara real time. Urutan probe digunakan oleh Guan et al. adalah Black Hole
Quencher-1 (BHQ1, quencher) dan fluorescein amidite (FAM, fluorophore). Reaksi ini memakan waktu
∼​45 menit dan dapat terjadi pada lempeng 96-sumur, di mana setiap sumur berisi sampel atau kontrol
yang berbeda. Harus ada kontrol positif dan negatif untuk menafsirkan hasil akhir dengan benar ketika
menjalankan rRT-PCR. Untuk SARS-CoV-2, CDC memberikan urutan kontrol positif yang disebut
nCoVPC.44 Sejumlah primer dan probe SARS-CoV-2 RT-PCR dari berbagai kelompok dan lembaga
penelitian tercantum pada Tabel 1.

Mengintegrasikan Alur Kerja untuk Asam Nukleat Deteksi dengan Manajemen Klinis. Ada alur kerja
implementasi yang berbeda untuk tes RT-PCR dalam pengaturan klinis. Corman et al. mengusulkan alur
kerja tiga langkah untuk diagnosis SARSCoV-2.45 Mereka mendefinisikan tiga langkah sebagai
penyaringan garis pertama, konfirmasi, dan tes diskriminatif. Untuk memaksimalkan jumlah pasien yang
terinfeksi yang diidentifikasi, langkah pertama mendeteksi semua virus yang berhubungan dengan SARS
dengan menargetkan berbagai wilayah gen E. Jika tes ini positif, maka mereka mengusulkan deteksi gen
RdRP menggunakan dua primer berbeda dan dua probe berbeda. Jika hasil ini juga positif, maka mereka
melakukan tes diskriminatif dengan salah satu dari dua urutan penyelidikan.45 Lihat Tabel 1 (Charite,
Jerman). Chu ́ et al. mengusulkan alur kerja uji yang sedikit berbeda.46 Mereka menyaring sampel
menggunakan primer untuk gen N dan menggunakannya dari gen ORFlb untuk konfirmasi. Diagnosis di
mana sampel pasien positif dengan primer gen N dan negatif dengan gen ORFlb tidak dapat disimpulkan.
Dalam situasi seperti itu, tes protein (yaitu, tes antibodi) atau pengurutan akan diperlukan untuk
mengkonfirmasi diagnosis.46

Computed Tomography. Karena kekurangan kit dan tingkat negatif palsu RT-PCR, Provinsi Hubei, Cina
sementara menggunakan CT scan sebagai diagnosis klinis untuk COVID-19,47 Scan CT dada tidak invasif
dan melibatkan banyak pengukuran sinar-X di berbagai sudut. melintasi dada pasien untuk
menghasilkan gambar cross-sectional.48,49 Gambar dianalisis oleh ahli radiologi untuk mencari fitur
abnormal yang dapat menyebabkan diagnosis.48 Fitur pencitraan COVID-19 beragam dan tergantung
pada tahap infeksi setelah timbulnya gejala. Misalnya, Bernheim et al. melihat temuan CT normal yang
lebih sering (56%) pada tahap awal penyakit (0-2 hari) 50 dengan keterlibatan paru maksimum
memuncak pada sekitar 10 hari setelah timbulnya gejala.51 Fitur ciri yang paling umum dari COVID-19
termasuk kekeruhan tanah-kaca bilateral dan perifer (bidang opacity kabur) 52 dan konsolidasi
paru-paru (cairan atau bahan padat dalam jaringan paru-paru kompresibel) .50,51 De Wever et al.
menemukan bahwa kekeruhan tanah-kaca paling menonjol 0−4 hari setelah timbulnya gejala. Ketika
infeksi COVID-19 berlangsung, selain kekeruhan tanah-kaca, pola paving gila (yaitu, pola batu beraspal
berbentuk tidak teratur) berkembang, 51 diikuti oleh peningkatan konsolidasi paru-paru.

Berdasarkan fitur-fitur pencitraan ini, beberapa studi retrospektif telah menunjukkan bahwa CT scan
memiliki sensitivitas yang lebih tinggi (86−98%) dan meningkatkan tingkat negatif palsu dibandingkan
dengan RT-PCR. 3,25,53,54 Peringatan utama menggunakan CT untuk COVID -19 adalah bahwa
spesifisitasnya rendah (25%) karena fitur pencitraan tumpang tindih dengan pneumonia virus lainnya.
COVID-19 saat ini didiagnosis dengan RT-PCR dan telah diskrining dengan CT scan, tetapi masing-masing
teknik memiliki kelemahannya sendiri. Ada tiga masalah yang muncul dengan RT-PCR. Pertama,
ketersediaan kit reagen PCR belum memenuhi permintaan. Kedua, rumah sakit komunitas di luar kota
perkotaan kekurangan infrastruktur PCR untuk mengakomodasi throughput sampel yang tinggi.
Terakhir, RT-PCR mengandalkan keberadaan SARS-CoV-2 yang terdeteksi dalam sampel yang
dikumpulkan. Jika pasien tanpa gejala terinfeksi SARS-CoV-2 tetapi telah pulih, PCR tidak akan
mengidentifikasi infeksi sebelumnya, dan langkah-langkah pengendalian tidak akan ditegakkan.
Sementara itu, sistem CT mahal, membutuhkan keahlian teknis, dan tidak dapat secara spesifik
mendiagnosis COVID-19. Teknologi lain perlu disesuaikan dengan SARS-CoV-2 untuk mengatasi
kekurangan ini.