BAGIAN ILMU KESEHATAN MATA JOURNAL READING

FAKULTAS KEDOKTERAN FEBRUARI 2020

UNIVERITAS PATTIMURA

Kumpulan Tugas Ilmiah Bagian

Ilmu Kesehatan Mata

Disusun oleh:
Asma Yuni Jumad
2018-84-003

Konsulen:
dr. Elna Anakotta, Sp. M
dr. Carmila Tamtelahitu, Sp.M

DIBAWAKAN DALAM RANGKA TUGAS KEPANITERAAN KLINIK

PADA BAGIAN ILMU KESEHATAN MATA
FAKULTAS KEDOKTERAN
UNIVERSITAS PATTIMURA
AMBON
2020
 EKSPERIMENTAL DAN TERAPEUTIK OBAT 16: 3539-3545, 2018

Analisis Komprehensif dari Profil Ekspresi Gen yang berkaitkan dengan

Retinopati Diabetik Proliferatif
Meng-Ting Gong 1 *, Wen-Xing Li 2 *, Qing Zhang 3 *, Wen-Wen Lv 4,5, Zheng-Hong
He 6, Shu-Li Zhou 6, Hui Zhang 6, Jing Wang 6 dan Kan Dia 1,6
1 Pusat Stem Sel dan Translational Medicine, School of Life Sciences, Universitas Anhui, Hefei, Anhui 230.601;
2 Negara Kunci Laboratorium Sumber Daya dan Evolusi Genetik, Kunming Institute of Zoology, Chinese Academy of Sciences, Kunming, Yunnan 650.223;
3 Departemen Ophthalmology, Rumah Sakit Kedua Anhui Medical University, Hefei, Anhui 230.601;
4 Hongqiao International Institute of Medicine, Rumah Sakit Shanghai Tongren / Fakultas Kesehatan Masyarakat;
5 Clinical Research Center, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Shanghai 200.025;
6 Departemen biostatistik, Sekolah Ilmu, Universitas Anhui, Hefei, Anhui 230.601, PR China
Menerima 19 Maret 2018; Diterima 26 Juli 2018

Abstrak
Retinopati diabetik proliferatif (PDR) merupakan karakteristik neovaskularisasi yang terjadi pada permukaan
retina atau disk optik, yang berhubungan dengan faktor lingkungan dan genetik. Namun, mekanisme regulasi
masih harus dijelaskan, terutama pada tingkat molekular. Dalam penelitian ini, analisis yang komprehensif
dilakukan dari profil ekspresi gen dari membran fibrovascular (FVMs) terkait dengan PDR, termasuk analisis
gen yang diekspresikan secara berbeda, pengayaan fungsional, dan regulasi faktor transkripsi (TF).
Akibatnya, gen penanda PDR dapat diidentifikasikan, termasuk flavin yang mengandung mono oxygenase 2.
Selanjutnya, secara umum beberapa gen tertentu dan TF telah ditemukan untuk FVMs tipe aktif dan tidak
aktif. Dalam penelitian ini, limfoid penambah mengikat faktor 1 (LEF1) diidentifikasi sebagai upregulator di
FVMs aktif dan tidak aktif, yang mampu mengaktifkan atau menekan gen target, termasuk claudin 2,
disekresikan phosphoprotein 1 (SPP1), dan aristaless seperti homeobox 4. ditunjukkan bahwa Wnt / β-catenin
efektor LEF1 mengatur SPP1 berpotensi penting dalam PDR. Hasil penelitian ini dapat memberikan wawasan
baru pada mekanisme molekuler yang mendasari patofisiologi PDR.

Pendahuluan
Retinopati diabetik (DR) secara umum merupakan komplikasi pada pasien dengan tipe 1 dan tipe 2
(1,2)
diabetes mellitus . Proliferatif DR (PDR) adalah tahap yang lebih serius dari DR, yang ditandai dengan
neovaskularisasi pada permukaan retina atau disk optik (3). Neovaskularisasi yang baru dibentuk rentan
terhadap pendarahan, yang mengancam penderita dan akhirnya berakhir pada kebutaan. PDR dikaitkan
dengan faktor lingkungan dan genetik. Pasien yang telah lama menderita diabetes, kontrol glikemik,
(4)
hipertensi, dan faktor lingkungan lainnya merupakan faktor risiko terjadinya PDR . Variasi genetik mungkin
menjelaskan beberapa heterogenitas dalam pengembangan PDR. Beberapa gen telah terlibat dalam
patogenesis PDR pada pasien dengan diabetes tipe 2 (5). Sebagai contoh, faktor pertumbuhan endotel vaskular
(VEGF) ditemukan untuk diekspresikan dalam membran fibrovascular (FVMs), Pada pasien dengan PDR,
(6)
menunjukkan bahwa mungkin berkontribusi pada pengembangan PDR . Gen polymorphisms merupakan
faktor pertumbuhan lainnya, termasuk faktor pertumbuhan dasar fibroblast. Insulin-like growth faktor juga
(7,8)
telah terbukti penting dalam patogenesis PDR . Hubungan antara gen polimorfisme nukleotida tunggal dan
stres oksidatif pada PDR dengan diabetes tipe 2 telah dilaporkan dalam sejumlah studi sebelumnya, termasuk
mangan superoksida dismutase, katalase myeloperoxidase, glutathione S-transferase, NADPH oksidase,
endotel nitrat oksida sintase dan nitrat diinduksi oksida sintase (9-11).
Namun, patogenesis yang tepat dari PDR masih harus dijelaskan. Saat ini, peningkatan jumlah profil
(3,12,13)
ekspresi gen pada penelitian telah dilakukan untuk mengetahui mekanisme genetik PDR . Database The
transcriptomic menggunakan platform dari microarrays atau RNA-sequencing, menyediakan dalam database
(14)
publik termasuk genomik fungsional dari data repositori Gene Expression Omnibus (GEO) . Dalam
penelitian ini, dataset microarray ekspresi gen di FVMs dikeluarkan dari pasien dengan retinopati diabetik
proliferatif dimanfaatkan secara komprehensif menganalisis pola ekspresi molekul PDR.

Bahan dan Metode

Pengumpulan data microarray dan preprocessing. Dalam rangka untuk mengetahui mekanisme
pengaturan dari PDR ditingkat tomic transkripsi, maka digunakan database profil ekspresi gen dari GEO.
Akhirnya, digunakan data yang belum diolah (data mentah) dari GSE60436 yang disediakan oleh Ishikawa et
(3)
al, yang merupakan profil ekspresi gen dari FVMs terkait dengan PDR . Dalam lingkup ini, tersedia total
sembilan sampel RNA. Dari jumlah tersebut, tiga sampel kontrol RNA berasal dari retina orang sehat
diperoleh dari CLONTECH Laboratories (Mountainview, CA, USA), dan enam sampel RNA diperoleh dari
retina pasein PDR dengan potongan horizontal yang menjalani pars plana vitrectomy, dan diklasifikasikan ke
dalam sampel aktif dan tidak aktif menurut temuan klinis adanya neovaskularisasi (NV) di FVMs, dengan
membagi 3 sampel per kelompok. FVMs aktif mewakili sampel dengan tanda klinis adanya NV pada
membran, dan FVMs tidak aktif mewakili sampel dengan tidak adanya NV pada membran (15).
Analisis Diferensial expression gen (DEG) dilakukan dengan menggunakan Rv3.2.2 dan kepustakaan
Bioconductor (http://www.bioconductor.org/). Algoritma Bayes empirik (function ‘eBayes’) dalam paket
Limma digunakan untuk mendeteksi DEG antara sampel kasus, termasuk sampel aktif atau tidak aktif dan
kontrol. Gen diregulasi dianggap sebagai transformasi log2 logaritmik 2x perubahan (FC) ≥1 dan tingkat
penemuan palsu (FDR) disesuaikan P-nilai ≤0.05. Gen yang menurunkan regulasi dianggap sebagai log2 (FC)
≤-1 dan FDR P-nilai ≤0.05. Analisis ekspresi diferensial dalam dua perbandingan untuk FVMs aktif dan tidak
aktif dilakukan.
Analisis Targeted genes by transcription factor (TF). Set gabungan dari gen target diferensial dinyatakan
secara total dan subkelompok diperoleh dan software IneractiVenn digunakan untuk menggambarkan hasil.
Analisis TF dilakukan dengan mengintegrasikan database TRANSFAC ® 7.0 (http: // genex-
plain.com/transfac/), yang menyediakan data tentang TF eukariotik, situs eksperimental terbukti mengikat,
konsensus yang mengikat urutan (matriks berat badan posisi), dan gen yang diatur (17,18).
Hasil dan Diskusi
DEGS terkait dengan PDR. Berdasarkan analisis dari DEGS dibandingkan dengan sampel kontrol,
gen signifikan yang terkait dengan FVMs aktif dan FVMs tidak aktif diidentifikasi (Gambar 1). Ada total
2.480 gen signifikan disregulasi, termasuk 690 diregulasi dan 1.790 gen menurunkan regulasi, yang
diidentifikasi dalam FVMs aktif. Selanjutnya, untuk FVMs tidak aktif total 2.369 gen yang diidentifikasi
sebagai signifikan disregulasi, termasuk 503 diregulasi dan 1.866 gen menurunkan regulasi (Gambar 1A-C).
Menurut perbandingan gen yang signifikan dalam setiap kelompok, total 1.838 gen tumpang tindih
diidentifikasi sebagai signifikan dalam FVMs aktif dan tidak aktif, yang terdiri dari 642 gen spesifik untuk
FVMs aktif dan 531 gen spesifik untuk FVMs tidak aktif. Di antara gen tumpang tindih, ada total dari 1505
gen umum menurunkan regulasi dan 332 gen yang biasa diregulasi (Gambar 1D). Hanya satu gen, flavin yang
mengandung monooxygenase isoform 2 (FMO2), secara signifikan menurunkan regulasi (logFC = -1,44, P =
0,00743) di FVMs aktif tetapi secara signifikan diregulasi (logFC = 1,28, P = 0,000986) di FVMs tidak aktif
(Gambar 1E). FMO2 telah dilaporkan menunjukkan fungsi katalitik dalam berbagai spesies (19,20). Dalam
studi sebelumnya, aktivasi FMO2 telah dilaporkan sebagai biomarker terkait di Caenorhabditis elegans ( 21,22).

Gambar 1: Sekilas DEGS terkait dengan PDR. (A) diagram yang menggambarkan log2 (FC) nilai-nilai dari setiap gen antara aktif
dan kontrol sampel, termasuk 13.459 gen diregulasi dan 11.976 gen menurunkan regulasi. (B) diagram yang menggambarkan log2
(FC) nilai-nilai dari setiap gen antara sampel tidak aktif dan kontrol, termasuk 13.566 gen diregulasi dan 11.869 gen menurunkan
regulasi. (C) Histogram dari jumlah DEGS dalam sampel aktif dan tidak aktif. Ada 690 gen diregulasi dan 1.790 gen menurunkan
regulasi diidentifikasi sebagai signifikan dalam sampel aktif. Ada 503 gen diregulasi dan 1.866 gen menurunkan regulasi secara
signifikan yang diidentifikasi dalam sampel tidak aktif. (D) Venn diagram yang menggambarkan gen tumpang tindih dari degs dalam
sampel aktif dan tidak aktif. (E) Bar grafik pola ekspresi FMO2 dalam sampel aktif dan tidak aktif. FMO2 secara signifikan
menurunkan regulasi (logFC = -1,44, P = 0,00743) di FVMs aktif tetapi secara signifikan diregulasi (logFC = 1,28, P = 0,000986) di
FVMs tidak aktif. PDR, proliferatif retinopati diabetes; FC, perubahan kali lipat; FVMs, membran fibrovascular; FMO2, flavin yang
mengandung monooxygenase isoform 2; CT, kontrol.
Gambar 2. Jalur Secara signifikan terkait dengan PDR. (A) Venn diagram yang menggambarkan jalur tumpang tindih dalam sampel
aktif dan tidak aktif. (B) Informasi lengkap dari 10 jalur dalam sampel aktif. Untuk 690 gen diregulasi di FVMs aktif, 10 jalur yang
interaksi ECM-reseptor, adhesi focal, pencernaan protein dan penyerapan, amoebiasis, leishmaniasis, kanker paru-paru sel kecil,
rheumatoid arthritis, interaksi reseptor sitokin-sitokin, jalur pada kanker, dan leukosit transendothelial migrasi; untuk 1.790 gen
menurunkan regulasi di FVMs aktif, 10 jalur yang metabolisme jalur, metabolisme tirosin, arginin dan metabolisme prolin,
fototransduksi, metabolisme fenilalanin, metabolisme β-alanin, proksimal tubulus bikarbonat reklamasi, kalsium jalur sinyal,
metabolisme triptofan, dan metabolisme histidin. (C) Informasi lengkap dari 10 jalur dalam sampel tidak aktif. Untuk 503 gen
diregulasi di FVMs aktif, 10 jalur yang interaksi ECM-reseptor, adhesi focal, pencernaan protein dan penyerapan, amoebiasis,
leishmaniasis, kanker paru-paru sel kecil, rheumatoid arthritis, interaksi reseptor sitokin-sitokin, jalur pada kanker, dan leukosit
transendothelial migrasi; untuk 1.866 gen menurunkan regulasi di FVMs aktif, 10 jalur yang jalur metabolisme, metabolisme tirosin,
arginin dan prolin metabolisme, fototransduksi, metabolisme fenilalanin, metabolisme β-alanin, proksimal tubulus bikarbonat
reklamasi, kalsium jalur sinyal, metabolisme triptofan, dan metabolisme histidin. PDR, proliferatif retinopati diabetes; FVMs,
membran fibrovascular; Up, diregulasi; Turun, menurunkan regulasi; ECM, matriks ekstraselular.

Pengayaan fungsional yang berhubungan dengan PDR. Untuk keterangan fungsi set gen yang
signifikan dengan PDR, jalur KEGG pengayaan analisis dilakukan pada setiap kelompok DEG. Secara total,
ada 24 jalur signifikan terkait di FVMs aktif dan 23 jalur signifikan terkait di FVMs tidak aktif, termasuk 10
jalur tumpang tindih (Gambar 2A). Untuk gen diregulasi di FVMs aktif, 10 jalur yang matriks ekstraselular
(ECM) interaksi reseptor, adhesi focal, pencernaan protein dan penyerapan, amoebiasis, leishmaniasis, kanker
paru-paru sel kecil, rheumatoid arthritis, interaksi reseptor sitokin-sitokin, jalur pada kanker, dan leukosit
transendothelial migrasi; gen menurunkan regulasi di FVMs aktif, 10 jalur yang metabolik, metabolisme
tirosin, arginin dan metabolisme prolin, fototransduksi, metabolisme fenilalanin, metabolisme β-alanin
proksimal tubulus bikarbonat recla- mation, kalsium jalur sinyal, metabolisme triptofan, dan metabolisme
histidin (Gambar 2B). Sebaliknya, 10 jalur gen diregulasi di FVMs aktif yang interaksi ECM-reseptor,
rheumatoid arthritis, molekul adhesi sel (CAMS), Staphylococc aureus infeksi, asma, jaringan usus untuk
produksi IgA, amoebiasis, dan jenis diabetes mellitus. Top 10 jalur gen menurunkan regulasi di FVMs aktif
yang jalur metabolisme, transduksi foto-, arginin dan metabolisme prolin, penyakit Alzheimer, penyakit
Parkinson, proksimal tubulus bikarbonat reklamasi, kontraksi otot jantung, oksidatif fosfat phorylation,
penyakit Huntington, dan metabolisme fenilalanin (Gambar 2C). Rincian gen yang terkait di atas 10 jalur ini
di FVMs aktif dan tidak aktif disajikan dalam Tabel I dan II.

Tabel I. Top 10 jalur diregulasi dalam membran fibrovascular aktif

 TF mengatur gen target terkait dengan PDR. Dengan mengintegrasikan gen target yang diidentifikasi
dalam studi ini dengan data regulasi gen dari TRANSFAC, beberapa TF terkait diidentifikasi untuk FVMs
aktif dan tidak aktif, masing-masing. Akibatnya, total 118 TF diidentifikasi untuk FVMs aktif, termasuk 26
diregulasi TF dan 92 menurunkan regulasi TF. Untuk FVMs tidak aktif, 103 Total TF diidentifikasi, termasuk
20 diregulasi dan 83 TF menurunkan regulasi. Menurut perbandingan data yang disebutkan di atas, ada 78
yang tumpang tindih TF, termasuk delapan umum diregulasi dan 70 TF umum (Gambar 3A). Di antaranya,
faktor transkripsi limfoid meningkatkan mengikat faktor-1 (LEF1) diidentifikasi sebagai regulator penting.
LEF1 dilaporkan menjadi pusat pengatur mempengaruhi diferensiasi dan sel jumlah sel T pembunuh alami
invarian(23). Telah terungkap bahwa Wnt / β-catenin efektor LEF1 dapat mengatur tyrosi- transkripsi gen nase
selama pengembangan melanosit dan diferensiasi (24). Dalam penelitian ini, LEF1 adalah diregulasi di FVMs
aktif dan tidak aktif, dengan kemampuan untuk mengaktifkan sembilan sasaran gen, termasuk claudin 2,
matriks metaloproteinase 7, MYC mengikat protein, molekul adhesi sel saraf, OCA2 dan disekresikan
phosphoprotein 1 (SPP1). Namun, transkripsi enam gen, yaitu ALX4, CD1d, desmoglein 4, interleukin (IL)
13, IL4 dan IL5, yang ditekan oleh LEF1. Sebagian target gen LEF1 memiliki tingkat ekspresi serupa antara
FVMs aktif dan tidak aktif. Namun, ekspresi SPP1 secara signifikan lebih tinggi pada sampel aktif (Gambar
3B), tetapi tidak signifikan mengubah dalam sampel tidak aktif (Gambar 3C), bila dibandingkan dengan
kontrol. Co-ekspresi SPP1 dan protein LEF1 sebelumnya diselidiki oleh kimia immunohisto-menggunakan
microarray tFVM, yang menunjukkan bahwa LEF1 dapat berfungsi sebagai biomarker prognostik untuk
utama colorectal carcinoma dan hati metastasis (25).
Dalam studi sebelumnya berdasarkan analisis microarray menggunakan Welch t-tes digabungkan
dengan kontrol multidimensi palsu-penemuan oleh Ishikawa et al ( 3), hanya 91 gen yang diidentifikasi secara
signifikan diregulasi di FVMs aktif, yang sebagian besar berkerumun dalam kategori fungsional genesis
angio-. Sebanyak 89 gen yang terbukti secara signifikan diregulasi di FVMs tidak aktif, mayoritas dari yang
clus- tered dalam kategori fungsional metabolisme. Selanjutnya, analisis kecerdikan jalur mengungkapkan
bahwa molekul-terkait ECM, termasuk periostin, tenascin C, hexabrachion, mengubah keluarga faktor
pertumbuhan β, dan faktor angiogenik, sangat penting dalam mempromosikan pengembangan FVMs associ-
diciptakan dengan PDR. Faktor genetik juga diidentifikasi dalam daftar gen diregulasi di FVMs aktif dan
tidak aktif dalam penelitian ini. Sejumlah gen yang sebelumnya dilaporkan sedang reidentified, oleh karena
itu, hasil ini tampaknya lebih sistematis dan komprehensif, bila dibandingkan dengan penelitian sebelumnya.
Namun, karena kurangnya data eksperimen biologi molekuler yang relevan dalam penelitian ini, identifikasi
informasi situs genetik memerlukan konfirmasi lebih lanjut dalam penyelidikan masa depan.
Tabel II. Top 10 diregulasi jalur di membran fibrovascular tidak aktif
Gambar 3.
Faktor-faktor transkripsi yang terkait dengan retinopati diabetik proliferatif. (A) Venn diagram yang menggambarkan TF kunci tumpang
tindih dalam sampel aktif dan tidak aktif. (B) Model resmi dari LEF1 dalam sampel aktif, termasuk jenis regulasi aktivasi, represi, dan tidak
dikenal. (C) Model resmi dari LEF1 dalam sampel tidak aktif, termasuk jenis regulasi aktivasi, represi, dan tidak dikenal. TF, faktor
transkripsi; LEF1, limfoid meningkatkan faktor-1 mengikat.