Biokimia Protein
Biokimia Protein
Identifikasi Protein
I. Tujuan
1. Mahasiswa dapat memahami metode identifikasi protein dengan cara uji
biuret.
2. Mahasiswa dapat memahami metode identifikasi protein menggunakan
cara pengedapan dengan logam.
3. Mahasiswa dapat memahami metode identifikasi protein menggunakan
cara pengendapan dengan garam.
4. Mahasiswa dapat memahami metode identifikasi protein menggunakan
cara pengendapan dengan alkohol.
5. Mahasiswa dapat memahami metode identifikasi protein dengan cara uji
koagulasi
6. Mahasiswa dapat memahami metode identifikasi protein dengan cara
denaturasi protein.
Prosedur pengamatan
1,5 ml protein + 0,5 ml Natrium Bening dan endapan putih
hidroksida 2.5N
+ 1 tetes larutan tembaga sulfat Warna ungu dan sedikit endapan
Prosedur Pengamatan
5 ml protein + ammonium sulfat Garam terlarut hingga sedikit yang
tersisa dan berwarna putih
Disaring dan diambil rendemennya dan Air : larut dan Reagen millon:
dilarutkan dengan air dan reagen millon tidak berwarna larut dan berwarna
kuning
Uji biuret : 1,5 ml protein + filtrat Berwarna putih
secukupnya
+ 1 tetes atau lebih larutan tembaga Berwarna ungu dengan sedikit endapan
sulfat
5. Uji koagulasi
Larutan protein ditambahkan dengan asam asetat menghasilkan
endapan, adanya endapan diambil dan diuji kelarutan dalam air dan
kelarutan dalam reagen millon hasilnya endapan tidak larut dalam
keduanya,dan menghasilkan warna kuning pada plat tetes reagen millon.
6. Denaturasi protein
VI. Pembahasan
1. Uji biuret
Pada percobaan uji biuret ditempatkan 1,5 ml larutan protein pada tabung
reaksi, kemudian ditambahkan larutan natrium hidroksida 2,5 N lalu diaduk.
Hasil yang terjadi adalah cairan bening disertai endapan berwarna putih yang
menggumpal. Penambahan larutan natrium hidroksida pada larutan protein
adalah sebagai katalis untuk memecah protein. Kemudian pada tabung reaksi
ditambahkan tembaga sulfat 0.01M , yang menghasilkan warna ungu dan
sedikit endapan yang menggumpal. Untuk membuktikan adanya ikatan
peptida pada larutan protein, yaitu dengan penambahan larutan tembaga
sulfat. Larutan tembaga sulfat yang bersifat basa bereaksi dengan polipeptida
yang merupakan penyusun protein. Yang menandakan adanya protein yaitu
adanya ikatan peptida, dengan menambahkan larutan tembaga sulfat beberapa
tetes lagi dan warna tidak berubah (tetap ungu) menandakan ikatan
peptidanya kuat.
2. Pengendapan dengan logam
Pada percobaaan pengendapan dengan logam,yaitu larutan protein
ditempatkan kedalam 2 tabung reaksi masing-masing sebanyak 1,5 ml. Pada
tabung pertama ditambahkan 5 tetes HgCl2 0,2 M dan pada tabung kedua
ditambahkan Pb asetat 0,2 M. Larutan yang ditambahkan HgCl 2
menghasilkan endapan putih susu lebih banyak, sedangkan larutan yang
ditambahkan Pb asetat menghasilkan endapan putih susu lebih sedikit. Hal ini
sesuai dengan literatur bahwa yang menghasilkan endapan lebih banyak yaitu
larutan protein yang ditambahkan dengan HgCl2, karena apabila protein
direaksikan dengan logam akan terjadi ikatan lebih kuat dan itu yang
menyebabkan terjadi reaksi lebih cepat, sehingga akan mempengaruhi logam
berat terhadap larutan protein. Dan hal ini juga terjadi karena tetapan
disosiasi HgCl2 lebih besar daripada PbSO4. Pada saat ditambahkan ke
dalam larutan protein, HgCl2 akan terionisasi dan lebih banyak dalam bentuk
Hg2+sehingga protein lebih cepat bereaksi dengan Hg2+ tersebut dan
menghasilkan endapan atau gumpalan dalam jumlah yang lebih banyak
ketimbang pengendapan oleh logam PbSO4 yang memiliki tetapan disosiasi
lebih kecil dari Hg
Ikatan yang amat kuat dari reaksi protein yang ditambahkan dengan
HgCl2 akan memutuskan ikatan jembatan garam, sehingga akan terjadi
denaturasi, secara bersama gugus –COOH dan gugus –NH2 yang terdapat
pada protein dapat bereaksi dengan ion logam berat dan dapat membentuk
senyawa kelat. Ion-ion yang dapat membentuk endapan logam dengan protein
antara lain adalah Ag, Ca, Zn, Hg, Fe, Cu, Co, Mn, dan Pb. Selain gugus –
COOH dan gugus –NH2, gugus –R pada molekul asam amino tertentu dapat
pula mengadakan reaksi dengan ion atau senyawa lain. Gugus –SH pada
molekul akan bereaksi dengan dengan ion Hg. Jumlah endapan yang
dihasilkan dipengaruhi oleh kereaktifan logam berat yang ditambahkan.
Logam Hg lebih reaktif daripada logam Pb karena merupakan logam transisi
pada sistem periodik.
l
5. Uji koagulasi
Uji kelarutan dengan air
Berdasarkan percobaan,saat diujikan protein yang ditambahkan asam
asetat tidak larut dengan air karena saat pemanasan terjadi perusakan ikatan
hidrogen dan interaksi hidrofobik non polar pada protein sehingga protein
albumin terdenaturasi dan terkoagulasi dan menyebabkan kemampuan
mengikat airnya menurun. Hal tersebut dapat terjadi karena suhu tinggi dapat
meningkatkan energi kinetik dan menyebabkan molekul penyusun protein
bergerak atau bergetar sangat cepat sehingga merusak ikatan molekul tersebut
dan energi panas akan mengakibatkan terputusnya interaksi non-kovalen yang
ada pada struktur alami protein tapi tidak memutuskan ikatan kovalennya
yang berupa ikatan peptida. Aplikasi yang seringkali dilakukan dalam
kehidupan sehari-hari adalah kegiatan pemasakan telur dimana telur yang
mengandung albumin (protein) terdenaturasi dan terkoagulasi sehingga enzim
pencernaan dapat dengan mudah mencerna protein yang terkandung dalam
telur tersebut.Hal tersebut dikarenakan perubahan struktur tesier albumin ini
tidak dapat diubah kembali ke bentuk semula.
Uji Reagen Millon
Pada saat larutan protein ditambahkan asam asetat kemudian dipanaskan
dan diambil endapan lalu dilarutkan reagen millon hasilnya tidak larut.
Reagen millon adalah larutan merkuro dan merkuri nitrat dalam asam
nitrat,pada uji ini terjadi reaksi millon. Apabila pereaksi ini ditambahkan pada
larutan protein, akan menghasilkan endapan putih dan apabila dipanaskan
dapat berubah menjadi merah. Pada dasarnya reaksi ini positif untuk fenol-
fenol, karena terbentuknya senyawa merkuri dengan gugus hidroksifenil yang
berwarna. Endapan yang terbentuk masih bersifat sebagai protein, hanya saja
telah terjadi perubahan struktur tersier ataupun kwartener, sehingga protein
tersebut mengendap. Perubahan struktur tersier protein ini tidak dapat diubah
kembali ke bentuk semula, ini bisa dilihat dari tidak larutnya endapan
albumin itu dalam air.
6. Denaturasi protein
Pada percobaan ini dibuat tiga larutan protein yang dimasukkan dalam
tiga tabung reaksi yang berbeda, dengan larutan protein yang sama yaitu
larutan albumin yang kemudian ditambahkan dengan larutan yang berbeda,
yaitu larutan buffer asetat dengan pH 4,7 kemudian larutan HCl 0,1 M dan
larutan NaOH 0,1 M. Untuk larutan Albumin, pada tabung ke-1 ditambahkan
dengan larutan HCl 0,1 M, pada tabung ke-2 ditambahkan dengan NaOH 0,1
M dan pada tabung ke-3 ditambahkan dengan buffer asetat pH 4,7 kemudian
dipanaskan. Pada tabung pertama setelah ditambah dengan HCl dan
dipanaskan terjadi perubahan pada larutan protein yaitu larutan menjadi keruh
dan adanya endapan putih. Hal ini terjadi karena penambahan HCl yang
bersifat sebagai asam kuat menyebabkan pH larutan protein menjadi sangat
asam. Setelah larutan didinginkan dan ditambahkan larutan buffer asetat pH
4,7 sebanyak 10 ml, larutan yang diuji tidak mengalami perubahan, tetap
keruh dan ada endapan putih.
Pada tabung ke-2 ditambahkan dengan NaOH 0,1 N kemudian
dipanaskan. Penambahan larutan NaOH ini tidak menyebabkan perubahan
pada larutan protein. Hal ini disebabkan karena larutan NaOH bersifat sebagai
basa kuat, sehingga terjadi perubahan pH yang sangat extrem pada larutan
protein menjadi basa.
Pada tabung ke-3 ditambahkan dengan buffer asetat kemudian
dipanaskan. Penambahan buffer asetat dan pemanasan ini menyebabkan
timbulnya endapan putih. Endapan putih yang terbentuk mengindikasikan
terjadinya denaturasi protein. Denaturasi ini disebabkan karena buffer asetat
sangat kuat mempertahankan pHnya pada pH 4,7 sehingga dapat merusak
keseimbangan zwitter ion ke kondisi asam di bawah titik isoelektrik.
Perubahan struktur yang diakibatkan proses denaturasi adalah perubahan
konfigurasi protein a-heliks menjadi memanjang. Hal ini disebabkan karena
rusaknya ikatan hidrogen dan ikatan nonpolar yang terjadi pada struktur
berlipat dari protein.
Tabung dengan penambahan HCl 0,1 M yang larut dan mengendap
sempurna lebih banyak dibandingkan dengan penambahan buffer asetat dan
NaOH 0.1 M. Pada tabung dengan penambahan buffer asetat juga terdapat
endapan yang banyak tetapi termasuk pengendapan sebagian karena masih
terdapat pemisahan lapisan antara larutan yang mengendap dengan larutan
berwarna bening pada bagian atas tabung, tetapi berbeda saat penambahan
dengan NaOH 0.1 M yang tidak ada perubahan apapun (larutan tetap bening).
Pada percobaan ini, setelah larutan tersebut didinginkan lalu pada tabung
pertama dan kedua ditambahkan dengan Buffer asetat pH 4,7. Pada hal ini
terjadi proses denaturasi karena terjadi endapan. Pada pH buffer 4,5 dan pH
albumin 4,5 hal inilah yang membuat ikatan lebih cepat, dan membentuk
endapan lebih banyak.
Endapan yang paling banyak dihasilkan oleh HCl, dan yang paling
sedikit pada NaOH. Buffer asetat menghasilkan endapan karena memiliki pH
4,7 yang sama dengan pH albumin yaitu 4,5-4,9. Setiap protein mempunyai
isolistrik yang berbeda-beda. Titik isolistrik protein mempunyai arti penting
karena pada umumnya sifat fisika dan kimia erat hubungannya dengan pH
isolistrik. Pada pH diatas titik isolistrik protein bemuatan negatif, sedangkan
dibawah titik isolistrik, protein bermuatan positif. Titik isolisrtik pada
albumin adalah pH 4,5-4,9. berdasarkan percobaan albumin berdenaturasi
lebih banyak pada penambahan HCl, dengan demikian dapat disimpulkan
bahwa pada protein albumin, asam amino yang mendominasi adalah asam
amino yang bersifat asam.
Denaturasi protein meliputi ganguan dan kerusakan yang mungkin terjadi
pada struktur sekunder dan sruktur tersier protein. Pada struktur protein
tersier terdapat empat jenis interaksi yang membentuk ikatan pada rantai
samping seperti ikatan hydrogen, jembatan garam, ikatan disulfida dan
interaksi hidrofobik non polar, yang kemungkinan mengalami gangguan.
Denaturasi yang umum ditemukan adalah proses presipitasi dan koagulasi
protein seperti asam amino, protein yang larut dalam air akan membentuk ion
yang mempunyai muatan positif dan negatif. Dalam suasana asam molekul
protein akan membentuk muatan positif, sedangkan dalam suasana basa akan
membentuk ion negatif. pada titik isolistrik protein mempunyai muatan
positif dan negatif yang sama, sehingga tidak bergerak kearah elektroda
positif maupun negatif, apabila ditempatkan diantara dua elektroda tersebut.
Sehingga pada percobaan yang dilakukan sesuai dengan teori seperti yang
telah dijelaskan diatas, tabung yang ditambahkan dengan HCl memiliki
endapan lebih banyak dibanding dengan tabung yang ditambahkan dengan
buffer asetat dan NaOH.
DAFTAR PUSTAKA
Fessenden, R.J dan Fessenden, J. S..1982. Kimia Organik Edisi Ketiga jilid
II.Jakarta: Erlangga
Girindra, A. 1986. Biokimia I.Jakarta: Gramedia Pustaka Utama
Lehninger, Albert L..1982.Dasar-dasar Biokimia Jilid 1.Penerjemah: Maggy