#001 Tantangan Replikasi DNA

1) Bila terdapat sekuen DNA pada salah satu rantai DNA template (cetak) berikut ini:

5’ – ATGCCCTTAGCCTAAAAGGGCATAGGTACTTACGGTTAAACCTTGAAAAC – 3’
3’ – TTTTG – 5’

Apabila sekuen tersebut adalah satu bukaan dalam garpu replikasi. Tentukan:
a) Urutan sekuen DNA pada utas rantai komplemennya (3’5’)
Jawab: 3’ – TACGGGAATCGGATTTTCCCGTATCCATGAATGCCAATTTGGAACTTTTG – 5’

b) Utas mana yang menjadi utas cetak untuk leading strand

Jawab: 3’ – TACGGGAATCGGATTTTCCCGTATCCATGAATGCCAATTTGGAACTTTTG – 5’

c) Mengapa pada utas lainnya terjadi perpanjangan rantai DNA copy secara lagging?
Jawab: Pemanjangan rantai DNA baru dengan arah 3’-5’ (antiparallel terhadap utas DNA
template 5’-3’), berlangsung terputus-putus ( fragmentasi) karena DNA
polymerase berkerja berlawanan arah dengan pembukaan garpu replikasi.
Fragmen-fragmen yang terbentuk disebut fragmen Okazaki. Lagging Strand
terbentuk dengan menggunakan banyak primer ( 1 primer untuk tiap fragmen)

d) Gambaran proses replikasi DNA yang terjadi pada kedua untai DNA template (2 utas
DNA template dan 2 utas DNA copy, gunakan warna hitam untuk sekuen DNA
template dan warna hijau untuk sekuen DNA copy, biarkan primer tetap berwarna
merah)
Jawab:
1. 5’ – ATGCCCTTAGCCTAAAAGGGCATAGGTACTTACGGTTAAACCTTGAAAAC – 3’
3’ – TACGGGAATCGGATTTTCCCGTATCCATGAATGCCAATTTGGAACTTTTG – 5’

2. 3’ – TACGGGAATCGGATTTTCCCGTATCCATGAATGCCAATTTGGAACTTTTG – 5’
5’ – ATGCCCTTAGCCTAAAAGGGCATAGGTACTTACGGTTAAACCTTGAAAAC – 3’
 molekul dna cetak
2) Bila satu molekul DNA cetak dan copy dimodelkan seperti berikut:
molekul dna copy

a) Gambarkan prediksi hasil replikasi DNA secara conservative, semi-conservative, dan dispersive pada 3 siklus regenerasi bakteri E. coli.
Tentukan dan tuliskan proporsi (perbandingan) jumlah varian DNA double helix hasil replikasi yang dibuat.
Jawab:
Generasi 0 100% (semua) varian molekul DNA cetak

Varian molekul Conservative Semi-conservative Dispersive

DNA % % %
Pembelahan 50% 50% 100%
sel (Generasi) 1 DNA DNA DNA
cetak, cetak, hybrid
50 % 50 %
DNA DNA
copy copy
Pembelahan 25 % 25 % 100%
sel (Generasi) 2 DNA DNA DNA
cetak, cetak, hybrid
75% 75%
DNA DNA
copy copy
Pembelahan 12,5% 12,5% 100%
sel (Generasi) 3 DNA DNA
DNA
cetak hybrid
cetak ,
87.5%
,
DNA
87.5 copy
%
DNA
copy
 b) Kaitkan gambaran di atas dengan inti penelitian Messelson Stahl dan bagaimana
Messelson-Stahl menggunakan gambaran prediksi di atas untuk membuktikan
model replikasi semi-conservative sebagai model replikasi DNA double helix yang
paling tepat.
Jawab:
1. Sebelum perlakuan maka diuji dulu untuk memastikan DNA parental yang dipakai
adalah DNA yang mengandung isotop 15N. Kontrol 1, DNA bakteri yang
dibiakkan di medium isotop 14N yang semuanya masa jenisnya ringan. Kontrol 2
campuran antara bakteri yang dibiakkan di isotop 14N dan 15N yang terpisah
membentuk dua lapisan yang berbeda.
2. Pada generasi pertama, setelah bakteri yang dibiakkan pada isotop15N dipidahkan
ke 14N, diperoleh hasil DNA yang massa jenisnya terletak antara massa jenis DNA
bakteri yang dibiakkan di medium isotop 15N dan isotop 14N (DNA hibrid). Hasil
ini memenuhi teori semikonservatif dan teori dispersif.
3. Pada generasi kedua,diperoleh bakteri dengan DNA hibrid dan DNA ringan
(mengandung 14 N) yang setara.
4. Pada generasi ketiga diperoleh hasil seperempat DNA hibrid dan tiga perempatnya
DNA ringan.

3) Genome bakteri E.coli (sekuen tahun 1997) terdiri dari 4 juta bp yang menyusun 3000
gen. Bila tingkat kesalahan replikasi E.coli adalah ± 1 bp per 10 9 bp, sedangkan waktu
regenerasi sel bakteri tersebut adalah 15 menit, pada menit keberapakah kultur bakteri
E.coli diperkirakan mengandung kopi DNA yang mengalami mutasi? (sertakan dengan
perhitungan untuk memperoleh angka tersebut)
Jawab:
Dalam 15 menit terdapat 4.000.000 replikasi. Berapa menit untuk mencapai
1.000.000.000 replikasi ?

15 4.000.000
=
x 1.000.000 .000

15 4.106
=
x 1.109

15.109 = 4.106. x

15.109
=x
4.106
3,75. 103 =x

X = 3.750 menit (1.000.000.000)

1
Tingkat kesalahan = 3.750 menit
1.000.000 .000

Atau menggunakan perhitungan kelipatan:

Jumlah genom awal bakteri E. Coli adalah 4 juta bp (4.106). Waktu generasi selnya adalah
15 menit. Maka, genom akan berubah 2 kali lipat dari jumlah sebelumnya setiap 15 menit.
Sehingga:

0 menit = 4x106 bp
15 menit = 2. 4x106 bp = 8x106 bp
30 menit = 2. 8x106 bp = 16x106 bp
45 menit = 2. 16x106 bp = 32x106 bp
60 menit = 2. 32x106 bp = 64x106 bp
75 menit = 2. 64x106 bp = 128x106 bp
90 menit = 2. 128x106 bp = 256x106 bp
105 menit = 2. 256x106 bp = 512x106 bp
120 menit = 2. 512x106 bp = 1024x106 bp

Dari perhitungan kelipatan diatas, dapat dilihat bahwa dalam menit ke 120 jumlah genom
bakteri E. coli

***Bonus question (optional) -thought question-

4) Sebelum mentransfer materi genetic, sel prokariot/eukariot perlu memperbanyak
materi genetic terlebih dahulu.
a) Apakah proses di atas terjadi pada proses mitosis, meiosis atau keduanya?
Mengapa?
Jawab:

Kegiatan memperbanyak materi genetik tidak terjadi pada proses mitosis maupun
meiosis. Hal ini karena proses perbanyakan materi genetic (replikasi DNA) tersebut
terjadi di fase s (dalam interphase namun diluar G1 dan G2), dimana fase tersebut
diluar dari fase mitosis maupun meiosis.
b) Bagaimana cara sel memperbanyak materi genetiknya? (gunakan hint berikut dalam
penjelasanmu, urutan bebas: ORi, garpu replikasi, DNA polymerase, fragmen
okazaki, ligase, telomer)
Jawab:
Materi genetik pada sel pada umumnya berupa DNA. DNA ini dapat diperbanyak
melalui proses yang disebut dengan replikasi DNA. Proses replikasi DNA terjadi melalui
beberap tahapan, meliputi:
a. TAHAP 1. Pemisahan untai ganda DNA
Replikasi bermula pada lokasi tertentu yang disebut origins of replication (ORI). ORI
merupakan sekuen tertentu pada untai DNA double helix. Kemudian enzim
helikase/ gyrase akan membuka untai helix ganda pada daerah ORI dan bergerak
untuk memisahkan untai ganda dengan memutus ikatan hidrogen antar basa
komplementer. Setelah untai ganda DNA terbuka, lalu SSB akan mempertahankan
supaya struktur untai ganda tetap terbuka.
Ketika untai ganda DNA terbuka, akan terdapat 2 struktur Y atau yang dikenal
dengan garpu replikasi. Secara keseluruhan, kedua garpu replikasi akan
membentuk struktur θ atau yang disebut juga gelembung replikasi. Garpu replikasi
akan berjalan menuju kedua arah yang berlawanan selama proses replikasi.

b. TAHAP 2. Inisiasi sintesis DNA

Inisiasi sintesis DNA dimulai dengan peletakan primer oleh enzim primase.
Umumnya, polimerisasi rantai DNA copy akan dilakukan oleh DNA polymerase.
Tetapi, enzim ini hanya dapat melakukan penambahan nukleotida (polimerisasi)
pada gugus –OH bebas di ujung 3’ rantai DNA yang telah ada. Enzim ini tidak bisa
menambahkan nukleotida bila tidak ada rantai nukleotida sebelumnya. Oleh karena
itu, primase akan membentuk RNA primer, suatu rantai pendek (umumnya 5-10
nukleotida) yang komplementer terhadap template. Primer akan berfungsi untuk
menyediakan ujung 3’ bagi DNA polymerase.

c. TAHAP 3. Elongasi (pemanjangan) untai DNA copy

Bila telah ada primer, maka DNA polymerase akan bekerja menambahkan satu per
satu nukleotida komplementer pada utas DNA baru. Ada 2 cara pemanjangan
(elongasi) rantai DNA baru:
1) Leading strand, yaitu pemanjangan rantai DNA baru dengan arah 5’3’
(antiparallel terhadap utas DNA template 3’5’), berlangsung secara kontinu
karena DNA polymerase berjalan searah dengan arah pembukaan garpu repikasi.
2) Lagging strand, yaitu pemanjangan rantai DNA baru dengan arah 3’5’
(antiparallel terhadap utas DNA template 5’3’), berlangsung terputus-putus
(fragmentasi) karena DNA polymerase bekerja berlawanan arah dengan arah
pembukaan garpu replikasi. Fragmen-fragmen yang terbentuk disebut Fragmen
Okazaki.

d. TAHAP 4. Ligasi fragmen Okazaki

Saat primer RNA diganti menjadi DNA oleh DNA Pol I, masih terdapat celah antar
fragmen Okazaki. Celah-celah tersebut disambungkan oleh DNA ligase.

e. TAHAP 5. Terminasi sintesis DNA

 Pada prokariot yang memiliki jenis kromosom sirkuler, tidak terdapat permasalahan
dalam mereplikasi DNA hingga titik akhir (terminal). Namun, pada eukariot yang
memiliki jenis kromosom linier, ada 2 masalah yang muncul:

1) Permasalahan pertama yaitu ujung double helix yang terbuka ikatannya apabila
tidak dilekatkan kembali, maka akan memiliki efek seperti double stranded breaks
(dsBs) dimana ujung rantai DNA dapat mengalami translokasi (fusi antar
kromosom) atau mengalami degradasi oleh nuclease. Untuk mengatasi masalah
tersebut, maka terdapat peran telomer disini. Kromosom linier pada ujungnya
terdiri dari telomer, yaitu suatu sekuen STRS (short tandem repeating sequence)
yang terdiri dari ulangan TTAGGG/TTGGGG (disebut sebagai utas kaya G (G-rich
strand) pada template berakhiran 3’. Ujung telomere yang mengantung (tidak
berpasangan) akan melingka dan membentuk t-loop, sehingga terjadi
pertemuan/perpasangan G-G antar STRS (G-G quartets). Pada bagian ujung yang
tidak berpasangan, rantai DNA akan berbentuk sirkuler sehingga tidak terbuka.

2) Permasalahan kedua yaitu DNA polymerase tidak dapat mensintesis DNA baru pada
ujung 5’. Oleh karena itu, akan terbentuk gap (panjang DNA yang tidak sama), dan
copy DNA akan menjadi lebih pendek. Untuk mengatasi masalah tersebut, maka
terdapat peran dari enzim telomerase. Enzim telomerase akan berfungsi untuk
menambahkan STRS ke ujung 3’ utas kaya G. Enzim ini mengandung utas RNA
pendek yang sebagiannya komplemen dengan urutan DNA ujung 3’. Utas RNA
pendek tersebut menjadi ‘template’ RNA untuk mensintesis DNA (reverse
transcription) sehingga ujung DNA utas 3’ bertambah panjang. Saat telomerase
berpindah, primase dan DNA polymerase dapat bekerja untuk membentuk utas
DNA yang panjangnya seperti rantai DNA original.

*** Good Luck ***

Accept the challenges so that you can feel the exhilaration of victory (George S. Patton)