BAB 3

METODE PENELITIAN

3.1 Desain Penelitian

Penelitian yang dilakukan ini adalah jenis penelitian eksperimental, dimana
dilakukan penelitian di Laboratorium Kimia Analisis Farmasi Universitas
Muhammadiyah Banjarmasin tentang identifikasi dan penetapan kadar
hidrokuinon pada krim pemutih wajah.

3.2 Subjek Penelitian

Subjek yang digunakan pada penelitian ini adalah 5 sampel random krim
pemutih wajah dari 2 pasar tradisional di Sungai Tabukan, yaitu :
a. Pasar Sabtu (2 sampel)
b. Pasar Tradisional Rantau Bujur Hilir (3 sampel)

3.3 Tempat dan Waktu Penelitian

3.3.1 Tempat penelitian
Penelitian ini di Laboratorium Kimia Analisis Farmasi, Program Studi
(Prodi) S1 Farmasi, Fakultas Farmasi, Universitas Muhammadiyah
Banjarmasin (UMBjm)

3.3.2 Waktu penelitian

Penelitian ini dimulai dari bulan April 2020 sampai dengan Mei 2020

3.4 Alat dan Bahan

3.4.1 Alat
Plat KLT Silika Gel GF254 (20 x 20 cm) (Merck®), Pipa Kapiler
(Merck®), Lampu UV 254 nm, Spektrofotmetri UV-Vis (Merck®),
Kertas Saring (Whatman®), Timbangan Analitik (Matrix®), Labu Ukur
(Pyrex®), Beaker Glass (Pyrex®), Sonikator (Merck®), Penggaris,
Mikropipet (Accumax®), Batang Pengaduk (Iwaki®), Sendok Tanduk,
 Kertas Perkamen, Chambers (Merck®), Kalkulator, Gelas Ukur
(Pyrex®), Pipet Ukur (Pyrex®).

3.4.2 Bahan
Baku Hidrokuinon (p.a), N-Heksan (p.a), Aseton (p.a), Metanol (p.a),
Etanol 96 % (p.a), sampel krim pemutih A, B, C, D, dan E.

3.5 Cara Kerja

3.5.1 Pengambilan sampel
Sampel diambil sebanyak 5 (lima) produk krim pemutih berbeda yang
beredar di Pasar Sungai Tabukan Amuntai, kemudian sampel dibawa ke
laboratorium untuk dilakukan penelitian dan diberi tanda sampel A, B,
C, D, dan E.

3.5.2 Analisis kualitatif dengan KLT

3.5.2.1 Pembuatan eluen (Anonim, 2011)
Masukkan N-heksan 60 ml dan aseton 40 ml ke dalam chamber,
tutup rapat dan kocok hingga homogen, lalu jenuhkan.

3.5.2.2 Penyiapan larutan (Anonim, 2011)

a. Penyiapan larutan baku
Timbang baku hidrokuinon sebanyak 0,02 g, masukkan ke
dalam labu ukur 10 ml kemudian tambahkan etanol 96 % lalu
kocok hingga larut. Encerkan dengan metanol sampai tanda
batas.

b. Penyiapan larutan uji

Timbang 1,5 g sampel dalam Beaker glass 25 ml, tambahkan
15 ml etanol 96 % sedikit demi sedikit, kemudian aduk.
Masukkan campuran kedalam labu ukur 25 ml, homogenkan
dalam sonikator. Tambahkan etanol 96 % sampai tanda batas,
 kocok. Letakkan labu dalam tangas es hingga terjadi
pemisahan lemak (selama 10 menit), lalu saring.

3.5.2.3 Prosedur KLT (Anonim, 2011)

Aktifkan plat KLT dengan suhu 100°C selama 10 menit,
jenuhkan bejana kromatografi (chamber). Totolkan larutan baku
dan larutan uji pada plat KLT, penotolan dapat dilakukan 2x.
Kembangkan plat ke dalam bejana kromatografi di ruang gelap
pada suhu ruang, hingga jarak rambat mencapai ±15 cm dari
titik penotolan. Angkat plat, keringkan pada suhu ruang. Amati
plat di bawah peyinaran lampu UV 254 nm, tandai posisi
bercak.

3.5.3 Analisis kuantitatif

3.5.3.1 Pembuatan larutan baku (Irnawati, dkk., 2016 dengan
modifikasi)
Timbang baku hidrokuinon sebanyak 1000 mg dan dilarutkan
dalam metanol. Larutan dipindahkan kedalam labu ukur 1000 ml
dan ditambahkan metanol sampai 1000 ml, kemudian larutan
dikocok sampai homogen, didapatkan konsentrasi baku
hidrokuinon 1000 ppm dalam metanol.

3.5.3.2 Penentuan panjang gelombang maksimum

Dipipet 0,2 ml dari larutan baku 1000 ppm masukkan dalam
labu ukur 10 ml, encerkan dengan larutan metanol sampai tanda
batas lalu dikocok sampai homogen dan didapatkan larutan
hidrokuinon dengan konsentrasi 20 ppm (Irnawati, dkk., 2016
dengan modifikasi). Ambil 5 ml dari larutan baku 20 ppm,
masukkan ke dalam tabung reaksi. Tambahkan masing-masing 1
ml NaOH 0,5 N dan pereaksi Floroglusin 1%, panaskan di
penangas air selama 15 menit (70°C). Pindahkan larutan ke labu
ukur 10 ml, tambahkan metanol sampai tanda batas. Larutan 20
 ppm ini diukur pada panjang gelombang 200-800 nm (Sarah
2014 dalam Susan, dkk., 2015).

3.5.3.3 Penentuan Operating Time

Dipipet 0,2 ml dari larutan baku 1000 ppm masukkan dalam
labu ukur 10 ml, encerkan dengan larutan metanol sampai tanda
batas lalu dikocok sampai homogen dan didapatkan larutan
hidrokuinon dengan konsentrasi 20 ppm (Irnawati, dkk., 2016
dengan modifikasi). Ambil 5 ml dari larutan baku 20 ppm,
masukkan ke dalam tabung reaksi. Tambahkan masing-masing 1
ml NaOH 0,5 N dan Floroglusin 1%, panaskan di penangas air
selama 15 menit (70°C). Pindahkan larutan ke labu ukur 10 ml,
tambahkan metanol sampai tanda batas, kocok (Sarah 2014
dalam Susan, dkk., 2015). Kemudian lihat absorbansinya pada
menit ke 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 dan 18 pada panjang
gelombang maksimum yang sudah didapat, lalu dilihat pada
menit ke berapa penyerapan bisa terjadi secara maksimal dan
didapatkan operating time (Sarah, 2014).
.
3.5.3.4 Pembuatan kurva baku
Dipipet larutan baku 1000 ppm sebanyak 0,05; 0,1; 0,15; 0,2;
0,25; 0,3; 0,35 ml, masing-masing dimasukkan dalam gelas ukur
10 ml tambahkan metanol sampai tanda batas lalu dikocok
sampai homogen. Didapatkan larutan baku dengan konsentrasi
5, 10, 15, 20, 25, 30, dan 35 ppm (Irnawati, dkk., 2016 dengan
modifikasi). Masing-masing larutan baku dipipet 5 ml,
masukkan ke dalam tabung reaksi. Tambahkan masing-masing 1
ml NaOH 0,5 N dan Floroglusin 1%, panaskan di penangas air
selama 15 menit (70°C). Pindahkan masing-masing larutan ke
labu ukur 10 ml, tambahkan metanol sampai tanda batas, kocok
(Sarah 2014 dalam Susan, dkk., 2015). Kemudian diamkan
larutan sesuai operating time yang didapat, lalu ukur pada
 panjang gelombang maksimum, dengan metanol sebagai blanko.
Cara untuk membuat kurva baku yaitu dengan memplot
konsentrasi vs absorbansi.

3.5.3.5 Validasi metode

a. Akurasi
Timbang 25 mg sampel krim pemutih wajah, kemudiaan
suspensikan ke dalam 50 ml metanol. Tambahkan larutan
hidrokuinon 10 ppm, 25 ppm dan 50 ppm (yang sudah
dibuat) ke dalam larutan sampel. Analit uji dimasukkan
dalam kuvet kemudian diukur serapannya pada panjang
gelombang maksimum dengan menggunakan
spektrofotometer UV-Vis (Irnawati, dkk., 2016). Nilai yang
didapatkan dihitung nilai % recovery, dikatakan memenuhi
syarat jika didapatkan % recovey dalam rentang nilai 80-110
% (Andayani, 2018).
Rumus: % Akurasi = (Ct – Cs)/Ca × 100 %
Keterangan : Cs = konsentrasi sampel mula-mula
Ct = konsentrasi total sampel dengan
penambahan baku hidrokuinon
Ca = konsentrasi baku yang ditambahkan
b. Presisi
Buat larutan baku hidrokuinon konsentrasi 20 ppm, kemudian
ukur absorbansinya pada panjang gelombang maksimum,
ulangi pengukurannya sebanyak 10 kali (Irnawati, dkk., 2016
dengan modifikasi). Koefisien Variasi (KV) = Sb/xi × 100 %.
Hasil memenuhi syarat jika % KV ˂7,3 % (Andayani, 2018).
c. Linearitas
Larutan baku dengan konsentrasi 5, 10, 15, 20, 25, 30, dan 35
ppm masing-masing diukur serapannya pada panjang
gelombang maksimum yang sudah didapatkan (Irnawati,
dkk., 2016 dengan modifikasi). Hasil absorban larutan baku
 hidrokuinon dapat dihitung persamaan regresi liniernya
dengan mencari nilai koefesien korelasi (r), koefisien regresi
(b), dan nilai (a). Persamaan regeresi linier ini dapat
dikatakan linier jika nilai koefisien korelasi (r) mendekati 1.
Rumus : y = bx + a (Andayani, 2018).
d. LOD dan LOQ
Batas deteksi dan batas kuantitasi dihitung secara statistik
dengan persamaan regresi linier dari kurva baku. Perhitungan
dilakukan dengan cara memasukkan absorbansi hasil
pengukuran larutan baku ke dalam persamaan regresi linear
yang diperoleh (Irnawati dkk, 2016). Rumus LOD = 3 ×
sb/b ; LOQ = 10 × sb/b
Sb = simpangan baku (Andayani, 2018)

3.5.3.6 Preparasi sampel (Irnawati, dkk., 2016)

Preparasi sampel dilakukan melalui penimbangan masing-
masing sampel krim pemutih sebanyak 25 mg dan
disuspensikan dalam metanol 50 ml, kemudian dikocok sampai
homogen, saring. Didapatkan larutan dengan konsentrasi 500
ppm.

3.5.3.7 Penetapan kadar hidrokuinon

Dipipet 5 ml dari larutan 500 ppm, masukkan ke dalam tabung
reaksi. Tambahkan masing-masing 1 ml NaOH 0,5 N dan
Floroglusin 1%, panaskan di penangas air selama 15 menit
(70°C). Dinginkan larutan sampai suhu 25°C (Sarah 2014 dalam
Susan, dkk., 2015). Lalu masukkan ke dalam kuvet kemudian
diukur menggunakan spektrofotometer Uv-vis pada panjang
gelombang maksimum. Kadar hidrokuinon pada sampel
dianalisis dengan spektrofotometri UV-Vis. Ukur absorbansi
sampel secara spektrofotometri ultraviolet pada panjang
gelombang yang didapatkan pada pengukuran panjang
gelombang (Irnawati, dkk., 2016).