Tanggal percobaan awal : 2 April 2019

Tanggal percobaan akhir : 2 April 2019

HIGH PERFORMANCE LIQUID CHRROMATOGRAPHY (HPLC)
PENENTUAN KADAR ZAT ADITIF DALAM SAMPEL MINUMAN MENGGUNAKAN
HPLC
A. Tujuan Percobaan
a. Mahasiswa memahami cara kerja instrumen HPLC untuk analisis kuantitatif.
b. Mahasiswa dapat melakukan preparasi dengan tepat dan akurat , serta dapat
mengikuti manual pengoperasian HPLC.
c. Mahasiswa dapat menentukan/menghitung kadar zat aditif dalam sampel
minuman.
B. Tinjauan Pustaka
HPLC (High Performance Liquid Chromatography) merupakan tipe kromatografi
elusi yang paling serbaguna dan digunakan secara luas. Teknih ini digunakan oleh para
kimiawan untuk memisahkan dan menentukan spesi-spesi dalam berbagai bahan atau
senyawa seperti senyawa organik, anorganik, maupun material biologis. Pada
kromatografi cair, fasa gerak merupakan pelarut cair berisi sampel yang berupa campuran
dari bahan-bahan terlarut. Jenis-jenis kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC) biasanya
dikelompokkan oleh mekanisme pemisahannya ataupun jenis
fasa diamnya. Pengelompokkan tersebut diantaranya:
a) Partisi atau Kromatografi Cair-Cair
b) Adsorpsi atau kromatografi Padat-Cair
c) Penukar Ion atau Kromatografi Ion
d) Size-Exclusion Chromatography (Kromatografi Eksklusi Ukuran)
e) Kromatografi Afinitas
f) Kromatografi Kiral

Ada dua cara pengelusian dalam kromatografi cair kinerja tinggi, yaitu elusi isokratis
dan elusi gradien. Elusi yang menggunakan pelarut tunggal dengan komposisi tetap atau
campuran beberapa pelarut ynag komposisinya dibuat tetap disebut elusi isokratik.
Sedangkan pada elusi gradien, digunakan dua (atau kadang lebih) pelarut dalam suatu
sistem yang memiliki perbedaan kepolaran yang besar / signifikan. Perbandingan dari
kedua atau lebih pelarut ini divariasikan melalui cara yang telah ditentukan dengan
program saat pemisahan berlangsung. Pengubahan perbandingan ini kadang dilakukan
secara terus-menerus dan kadang secara bertahap. Elusi gradien seringkali meningkatkan
efisiensi pemisahan, seperti halnya pemrograman suhu pada GC. Instrumen HPLC
modern biasanya dilengkapi dengan katup yan berpotongan sehingga dapat memasukkan
cairan dari dua atau lebih reservoir dengan perbandingan yang dapat divariasikan secara
terus menerus.
(Skoog, 2004: 973-977)
Di dalam kromatografi cair komposisi dari solven atau rasa gerak adalah salah satu
dari variabel yang mempengaruhi pemisahan. Terdapat variasi yang sangat luas pada
solven yang digunakan untuk KCKT/HPLC, tetapi ada beberapa sifat umum yang sangat
disukai, yaitu rasa gerak harus :
1. Murni, tidak terdapat kontaminan
2. Tidak bereaksi dengan wadah (packing)
3. Sesuai dengan defektor
4. Melarutkan sampel
5. Memiliki visikositas rendah
6. Bila diperlukan, memudahkan "sample recovery"
7. Diperdagangan dapat diperoleh denganharga murah (reasonable price)
Umumnya, semua solven yang sudah digunakan langsung dibuang karena prosedur
pemumiannya kembali sangat membosankandan mahal biayanya. Dari semua
persyaratan di atas, persyaratan 1) s/d 4) merupakan yang sangat penting.
Menghilangkan gas (gelembung udara) dari solven, terutama untuk KCKT/HPLC
yang menggunakan pompa bolak balik(reciprocating pump) sangat diperlukan terutama
bila detektor tidak tahan kinerja sampai 100 psi. Udara yang terlarut yang tidak
dikeluarkan akan menyebabkan gangguan yang besar di dalam detektor sehingga data
yang diperoleh tidak dapat digunakan (the data may be useless). Menghilangkan gas
(degassing) juga sangat baik bila menggunakan kolom yang sangat sensitif terhadap udara
(contoh :kolom berikatan dengan NH2).

(Effendy De Lux Putra, 2004: 7-8)

Komponen-komponen alat dalam HPLC diantaranya ialah:

  Reservoir (wadah pelarut / cairan)
 Pompa
 Sistem injeksi sampel
 Kolom, terdiri dari
1. Kolom Analitik / Kolom Utama
2. Kolom Guard
3. Termostat
 Detektor
 Komputer (Pengolah data)

Reservoir merupakan wadah yang menampung cairan-cairan yang akan digunakan

dalam pemisahan. Cairan-cairan tersebut berupa pelarut. Masing-masing reservoir
dihubungkan kepada katup berpotongan, dimana katup ini berfungsi untuk mengatur
cairan-cairan yang masuk / dipompa kedalam kolom.

Pelarut dimasukkan ke kolom melalui pipa atau selang menggunakan pompa. Pelarut
dipompa dari reservoir sehingga dapat membawa sampel menuju kolom. Pompa yang
digunkan dalam HPLC hatus memenuhi kriteria sebagai berikut:
1) Harus memiliki aliran terkontrol yang ‘reproducible’
2) Harus menghasilkan aliran yang ‘pulse-free’ (bebas pulsa, tidak menghasilkan
gelembung)
3) Hold-up volume (volume tampungan) kecil
(R.P. Budhiraja, 2004: 172)
 Karena HPLC menggunakan tekanan yang cukup tinggi, mustahil sampel dapat
diinjeksikan dengan cara yang sama seperti pada kromatografi gas. Maka dari itu, sampel
dimasukkan melalui loop injector. Sampling loop dapat diganti dan tersedia pada volume
0,5 mikroliter sampai 2 mililiter. Pada posisi terisi, sampling loop terisolasi dari fasa
gerak dan terbuka terhadap atmosfer. Sebuah syringe dengan kapasitas beberapa kali dari
loop sampling digunakan untuk menempatkan sampel kedalam loop.

Kolom yang paling umum digunakan untuk HPLC dibuat dari stainless steel dengan
diameter internal antara 2,1 mm dan 4,6 mm dengan panjang mulai dari sekitar 30 mm
sampai 300 mm. kolom-kolom ini dipak dengan 3-10 mikrometer partikel-partikel silika
berpori yang dapat berbentuk irregular atau spherical. Kolom ini berfungsi sebagai
tempat pemisahan berlangsung.
Terdapat dua masalah yang menyebabkan kolom analitik berkurang masa
hidupnya. Pertama, zat terlarut yang mengikat fasa diam secara irreversibel menurunkan
performa kolom karena fasa diam yang tersedia menjadi berkurang. Kedua, material
partikulat yang diinjeksikan bersama sampel dapat menyumbat kolom analitik. Maka dari
itu, kolom guard ditempatkan sebelum kolom analitik untuk meminimalisasi masalah-
masalah tersebut. Kolom guard biasanya berisi material partikulat packing dan fasa diam
yang sama dengan kolom analitik, namun jauh lebih pendek dan murah. Panjangnya 7,5
mm dan harganya satu persepuluh dari kolom analitik. Hal ini dikarenakan kolom guard
digunakan sebagai “tumbal” dan diganti secara berkala.

Selanjutnya sampel yang telah terpisahkan dibawa menuju detektor. Detektor ini
berfungsi untuk memberikan sinyal sehingga data dapat diolah dan ditampilkan.
Detektor-detektor yang dapat digunakan dalam HPLC diantaranya:
 Detektor Spektroskopi (adsorpsi sinar UV)
 Detektor elektrokimia
Selain itu, ada juga detektor yang menggunakan pengukuran pada perubahan index
refraksi dari fasa gerak, namun kurang berguna untuk elusi gradien kecuali komponen-
komponen fasa gerak memiliki index refraksi yang mirip.
(Harvey David, 2000: 578-585)
Keuntungan KCKT/HPLC

KCKT dapat dipandang sebagai pelengkap Kromatografi Gas (KG). Dalam

banyak hal kedua teknik ini dapat digunakan untuk memperoleh efek pemisahan yang
sama membaiknya. Bila derivatisasi diperlukan pada KG, namun pada KCKT zat-zat
yang tidak diderivatisasi dapat dianalisis. Untuk zat-zat yang labil pada pemanasan atau
tidak menguap, KCKT adalah pilihan utama. Namun demikian bukan berarti KCKT
menggantikan KG, tetapi akan memainkan peranan yang lebih besar bagi para analis
laboratorium. Derivatisasi juga menjadi populer pada KCKT karena teknik ini dapat
digunakan untuk menambah sensitivitas detektor UV Visibel yang umumnya digunakan.
KCKT menawarkan beberapa keuntungan dibanding dengan kromatografi cair klasik,
antara lain:
1. Cepat: Waktu analisis umumnya kurang dari 1 jam. Banyak analisis yang dapat
diselesaikan sekitar 15-30 menit. Untuk analisis yang tidak rumit (uncomplicated),
waktu analisis kurang dari 5 menit bisa dicapai
2. Resolusi : Berbeda dengan KG, Kromatografi Cair mempunyai dua rasa dimana
interaksi selektif dapat terjadi. Pada KG, gas yang mengalir sedikit berinteraksi
dengan zat padat; pemisahan terutama dicapai hanya dengan rasa diam.
Kemampuan zat padat berinteraksi secara selektif dengan fasa diam dan fasa
gerak
pada KCKT memberikan parameter tambahan untuk mencapai pemisahan yang
diinginkan.
3. Sensitivitas detektor: Detektor absorbsi UV yang biasa digunakan dalam KCKT
dapat mendeteksi kadar dalam jumlah nanogram (10-9 gram) dari bermacam-
macam zat. Detektor-detektor Fluoresensi dan Elektrokimia dapat mendeteksi
jumlah sampai picogram(10-12 gram). Detektor-detektor seperti Spektrofotometer
Massa, Indeks Refraksi, Radiometri, dll dapat juga digunakan dalam KCKT
4. Kolom yang dapat digunakan kembali: Berbeda dengan kolom kromatografi
klasik, kolom KCKT dapat digunakan kembali (reusable) . Banyak analisis yang
bisa dilakukan dengan kolom yang sma sebelum darijenis sampel yang diinjeksi,
kebersihan dari solven dan jenis solven yang digunakan Ideal untuk zat
bermolekul besar dan berionik :zat – zat yang tidak bisa dianalisis dengan KG
 karena volatilitas rendah , biasanya diderivatisasi untuk menganalisi spsesies
ionik. KCKT dengan tipe eksklusi dan penukar ion ideal sekali untuk mengalissis
zat –zat tersebut.
5. Mudah rekoveri sampel: Umumnya setektor yang digunakan dalam KCKT tidak
menyebabkan destruktif(kerusakan) pada komponen sampel yang diperiksa, oleh
karena itu komponen sampel tersebut dapat dengan mudah dikumpulkan setelah
melewati detector.Solvennya dapat dihilangkan dengan menguapkan ksecuali
untuk kromatografi penukarion memerlukan prosedur khusus.
(Effendy De Lux Putra, 2004: 8)

Teknik HPLC merupakan satu teknik kromatografi cair-cair, yang dapat

digunakan baik untuk keperluan pemisahan maupun analisis kuantitatif. Analisis
kuantitatif dengan teknik HPLC didasarkan pada pengukuran luas/area puncak analit
dalam kromatogram, dibandingkan dengan luas/area standar. Pada prakteknya,
pembandingan kurang menghasilkan data yang akurat bila hanya melibatkan satu
standar. Oleh karena itu, maka pembandingaan dilakukan dengan menggunakan teknik
kurva kalibrasi.
Parasetamol dan kafein pada umumnya terdapat bersama sama dalam satu tablet obat
yang memiliki sifat kepolaran berbeda. Gugus kromofor yang dimilikinya menyebabkan
senyawa ini dapat menyerap sinar UV. Karaktersitik senyawa ini memungkinkan analisis
dengan teknik HPLC menggunakan kolom nonpolar seperti C-18 dan fasa gerak polar
campuran beberapa pelarut.

(Tim Dosen Praktikum Pemisahan dan Pengukuran, 2019: 15)

C. Alat dan Bahan
a. Alat
 Perangkat HPLC
 Spatula
 Labu ukur 50 mL dan 10 mL (6 buah)
 Neraca analitik terkalibrasi
 Corong pendek
 Pipet tetes
 Gelas kimia 20 mL
 Gelas ukur 500 mL
  Ultrasonic vibrator
 Pipet seukuran (1,2,3,4, dan 5 mL)
 kertas saring whattman
 membrane PTFE dan selulosa nitrat

b. Bahan
 Natrium benzoat p.a 20 mg
 Vitamin C standar 20 mg
 Kafein 20 mg
 Metanol for HPLC
 Sampel minuman yang mengandung vit. C
 Kalium dihidhirogenfosfat
 Aquabides
 asetonitril
D. prosedur kerja
a. analisis larutan

larutan

larutan induk larutan

sampel

di analisis

dihasilkan
kromatogram

dibuat kurva
kalibrasi

diperoleh
konsentrasi

kesimpulan

b. Set instrumen HPLC

 instrumen
HPLC

Fasa gerak panjang

kolom C-18 laju alir 0,7 volume
elusi gradien gelombang
12,5 cm mL/menit injeksi 20 μL
254 nm

kondisi siap

E. Hasil dan Analisis Data

percobaan penentuan zat aditif pada minuman energi dengan teknik
kromatografi cair kinerja tinggi tidak pengukuran luas area puncak dalam ag lalu
dibandingkan dengan luas area standar prinsip dasar dari HPLC adalah ketika suatu
sampel yang akan diuji diinjeksikan kedalam kolom maka sampel tersebut akan
terurai dan terpisah menjadi senyawa-senyawa kimia sesuai dengan afinitas nya dan
berdasarkan perbedaan dua fasa.
fasa gerak yang itu campuran dari asetonitril dengan polar sedangkan fasa
diamnya adalah kolom C-18 bersifat non polar dan kepolaran antara fase gerak dan
fasa diam nya maka metode yang digunakan yaitu kromatografi fase terbalik. Dalam
pengukurannya, dilakukan pembuatan standar natrium benzoat, kafein dan asam
askorbat dan didapat kurva kalibrasi serta persamaan reaksi Y= mx +C dimana y =
luas area dan m= konsentrasi. Lalu sampel diukur yang digunakan yaitu hormoviton
150 ml dan diambil hanya 1,2 ml. dalam sampel hanya mengandung kafein dan
natrium benzoat tidak mengandung vitamin C. analisis yang digunakan yakni analisis
kualitatif dan analisis kuantitatif pada analisis kualitatif yaitu membandingkan waktu
retensi sampel dengan waktu retensi standar nya. Komponen yang kepolarannya sama
dengan kolom akan tertahan lebih lama. Komponen yang keluar pertama yaitu
vitamin C, kafein lalu natrium benzoate. Hal ini berarti vitamin C sifat kepolaran nya
tinggi lalu diikuti kafein dan natrium benzoat.
didapat maka setiap komponen dalam 150 ml hormoviton yaitu kafein 61,05
mg dan natrium benzoat 42,9875 mg

F. Kesimpulan
Pada praktikum menentukan zat aditif minuman dengan HPLC didapatkan bahwa
terdapat dua komponen yang terdapat pada sampel hormoviton yaitu kafein dengan
massa 61,05 mg dan natrium benzoat dengan massa 42,9875 mg.
DAFTAR PUSTAKA

Budhiraja, R.P. (2004). Separation Chemistry. New Delhi: New Age International (p)
Ltd.

David, Haervey. (2000). Modern Analytical Chemistry. New York: McGraw-Hill

De Lux Putra, Effendy. (2004). Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Dalam Bidang
Farmasi Jurnal, hlm. 5-8.

Skoog, dkk. (2004). Fundamentals of Analytical Chemistry. USA: Thomson

Brooks/Cole

Tim Dosen Praktikum Pemisahan dan Pengukuran. (2019). Penuntun Praktikum

Kimia Pemisahan Dan Pengukuran. Bandung: UPI
 LAMPIRAN
1. Perhitungan
a. Sampel 1
i. Penentuan kadar Vit. C  tidak ada
ii. Penentuan kadar kafein
y = 3632x + 49795
1643729 = 3632x + 49795
1593934 = 3632x
x = 48,845 ppm
150 mL x 0,4884 m g
kadar kafein =
1,2 mL
= 61, 05 mg
iii. Penentuan kadar natrium benzoat
150 mL x 0,3439 mg
Kadar natrium benzoat =
1,2mL
= 42,9875 mg
2. Pembuatan larutan
a. Pembuatan fasa gerak
M=n/v
0,01 M = n / 0,5 L
n = 5 x 10-3
n = m/ massa molar
5 x10-3 = m / 136
m = 0,68 gram
LAPORAN PRAKTIKUM KIMIA PEMISAHAN DAN PENGUKURAN
HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY
PENENTUAN KADAR ZAT ADITIF DALAM SAMPEL MINUMAN
MENGGUNAKAN HPLC
Dosen pengampu : Dr. Soja Siti Fatimah, M.Si.

disusun oleh :
Silvia Widiyanti 1705675
Rekan kerja
Nurul Farhah Faadiyah

PROGRAM STUDI KIMIA

DEPARTEMEN PENDIDIKAN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS PENDIDIKAN INDONESIA
2019