Instumentasi

Kromatografi

 
OLEH :
1. RURY MARILYNA
2. SITI HAJAR MUNADA
3. SOFIA RAGILIA
4. SOPIATI
5. SUMARNI
6. THENA ADI GOTAMA
7. TRISNA MARTHA DEWI
8. ULIYA MARDHIYANTI
9. WIDYA INDRASWARI
10. YULIANA ASRI IFTIHANI
11. YUNITA NOVERA

KEMENTERIAN KESEHATAN REPUBLIK INDONESIA

POLITEKNIK KESEHATAN KEMENKES MATARAM
JURUSAN TEKNOLOGI LAB MEDIK
2015
 BAB I
PENDAHULUAN

A.  Latar  belakang
Kromatografi merupakan suatu metode pemisahan yang dewasa ini telah banyak
digunakan, dibandingkan dengan metode yang lainnya seperti detilasi, kristalisasi,
pengendapan, ekstraksi, dan lain-lain mempunyai keuntungan dalam pelaksanaan yang lebih
sederhana, penggunaan waktu yang sangat singkat terutama mempunyai kepekaan yang
tinggi serta mempunyai kemampuan memisahkan yang tinggi, Metode ini digunakan, jika
dengan metode lain tidak dapat di lakukan misalnya karena jumlah cuplikan sangat sedikit
atau campurannya kompleks.
Meskipun dasar kromatografi adalah suatu proses pemisahan namun banyak diantara
cara ini dapat digunakan untuk analisi kuatitatif. Jenis-jenis kromatografi yang bermanfaat
dalam analisi kualitatif dan analisis kuantitatif adalah kromatografi kertas, kromatigrafi lapis
tipis (KLT), kromatografi kolom, kromatografi gas, dan kromatografi cair kinerja tinggi.
Kromatografi kertas dan KLT pada umunya lebih bermanfaat untuk tujuan indentifikasi,
karena lebih mudah dan sederhana.
Kromatografi kolom memberikan pemilihan fase diam yang lebih luas dan berguna
untuk pemisahan campuran secara kuantitatif. Dalam indutri metode inibanyak dipakaiuntuk
menghilangkan zat-zat yang tidak diinginkandalam hasil, misalnya pada pemurnian minyak
tanah atau minyak goring dan pemurnian hidroksidayang dihasilkan dari proses elektrolisis.
Teknik pemisahan kromatografi dilakukan untuk mendapatkan pemisahan campuran
diantara dua fase.Fase tersebut adalah fase diam dan fase gerak.Fase diam dapat berupa zat
cair dan zat padat, sedangkan fase gerak dapat berupa zat cair atau gas.
Latar belakang dari makalah ini adalah menghadirkan materi dasar yang akan
memperkenalkan dengan berbagai aspek dari proses kromatografi, menjelaskan dalam istilah
yang sederhana bagaimana prinsip kerja kromato grafi, dan menunjukan beberapa penerapan
yang telah membuat kromatografi tidak dapat diabaikan dalam berbagai bidang kehidupan.

B. Rumusan Masalah
1. Apa pengertian dari kromatografi?
2. Bagaimana pembagian kromatografi?
3. Bagaimana cara membedakan fase gerak dan fase diam?

C. Tujuan
1.      Mengetahui dan memahami pengertian kromatografi.
2.      Mengetahui dan memahami pembagian kromatografi.
3.      Mengetahui dan memahami cara membedakan fase gerak dan fase diam.
 BAB II
PEMBAHASAN

A. Pengertian Kromatografi
Kromatografi pertama kali dikembangkan oleh seorang ahli botani RusiaMichael
Tsweet pada tahun 1903 untuk memisahkan pigmen berwarna dalam tanaman dengan cara
perkolasi esktrak petroleum eter dalam kolom gelas yangberisi kalsium karbonat (CaCo3).
Saat ini kromatografi merupakan teknik pemisahan yang paling umum dan paling sering
digunakan dalam bidang kimia analisis dan dapat dimanfaatkan untuk melakukan analisis,
baik analisis kualitatif, kuantitatif, atau preparative dalam bidang farmasi, lingkungan,
industri, dan sebagainya. Kromatografi suatu teknik pemisahan yang menggunakan fase
diam (stationary phase) dan fase gerak (mobile phase)(Rohman, 2007).
Kromatografi adalah salah satu metode pemisahan kimia yang didasarkan pada
adanya perbedaan partisi zat pada fasa diam (stationary phase) dan fasa gerak (mobile
phase).Kromatografi berasal dari bahasa Yunani yaitu χρῶμα yang berarti warna dan
γράφειν yang berarti menulis.
Kromatografi dapat bersifat preparatif maupun analitik.Tujuan kromatografi
preparatif biasanya adalah untuk memisahkan senyawa dalam campuran (biasanya
digunakan untuk pemurnian).Kromatografi analitik digunakan untuk mengetahui
perbandingan senyawa dalam campuran.
Dalam kromatografi, dikenal beberapa istilah, antara lain:
1. Analit adalah zat yang dipisahkan.
2. Kromatogram adalah output visual yang diperoleh dari hasil pemisahan. Adanya puncak
karakterisitik yang berbeda menunjukkan adanya senyawa yang berbeda.
3. Eluen adalah pelarut yang digunakan untuk memisahkan analit.
4. Fasa gerak adalah fasa zat yang bergerak pada arah tertentu.
5. Fasa diam adalah fasa yang tetap pada tempatnya.
6. Waktu retensi adalah waktu yang diperlukan analit untuk melewati sistem.
7. Volume retensi adalah volume fasa gerak yang dibutuhkan untuk mengelusi komponen
analit.
B. Pembagian/penggolongan kromatografi
Penggolongan kromatografi ada 3 yaitu :
1. Berdasarkan prinsip/mekanisme pemisahan
2. Berdasarkan fase yang digunakan
3. Berdasarkan alat yang digunakan
 Kromatografi Berdasarkan prinsip/mekanisme pemisahannya pemisahannya,
kromatografi dapat dibedakan menjadi: (a) kromatografi adsorpsi; (b) kromatografi partisi;
(c) kromatografi penukar ion; (d) kromatografi eksklusi ukuran; (e) kromatografi afinitas.
a. Kromatografi Adsorpsi
Adsorpsi merupakan penyerapan pada permukaannya saja dan jangan sekali-kali
dikacaukan dengan proses absorpsi yang berarti penyerapan keseluruhan. Adsorpsi pada
permukaan melibatkan interaksi-interaksi elektrostatik seperti ikatan hidrogen, penarikan
dipol-dipol, dan penarikan yang diinduksi oleh dipole.Silika gel merupakan jenis
absorben (fase diam) yang penggunaannya paling luas.Permukaan silika gel terdiri atas
gugus Si-O-Si dan gugus silanol (Si-OH). Kromatografi Adsorpsi seperti:
1) Kromatografi Kertas
Pada kromatografi kertas sebagai penjerap digunakan sehelai kertas dengan
susunan serabut dan tebal yang sesuai.Sebagai alternatif dapat juga digunakan sistem
dua fase.Kertas diimpregnasi dengan salah satu fase yang kemudianmenjadi fase
diam (umumnya fase yang lebih polar dalam hal kertas yang
dimodifikasi).Kromatogram dilakukan dengan merambatkan fase gerak, melalui
kertas. Dapat dilakukan kromatografi menaik, pelarut merambat naik pada kertas
ditarik oleh gaya kapiler ataupun kromatografi menurun, pelarutnya mengalir oleh
gaya gravitasi.
2) Kromatografi Lapis Tipis
Pada KLT, zat penjerap merupakan lapis tipis serbuk halus yang dilapiskan pada
lempeng kaca. Plastik atau logam secara merata, umumnya digunakan lempeng kaca.
Pemisahan yang tercapai dapat didasarkan pada adsorpsi, partisi atau kombinasi dari
kedua efek, tergantung jenis penyangga, cara pembuatan, dan jenis pelarut yang
digunakan. Perkiraan identifikasi diperoleh dengan pengamatan bercak dengan harga
Rf yang identik dan ukuran yang hamper sama. Dengan menotolkan zat uji dan baku
pembanding pada lempeng yang sama. Bercak dapat dikerok dari lempeng,
kemudian diekstraksi dengan pelarut yang sesuai dan diukur secara spektrofotometri.
Kromatografi kertas termasuk kromatografi partisi.Fasa diamnya air dan fasa
penyokongnya adalah selulosa.Fasa geraknya biasanya merupakan campuran dari salah satu
pelarut-pelarut organik atau air.Setelah elusi selesai, noda ditandai dengan penanda.Bila
noda tidak berwarna maka harus dideteksi secara fisika dan kimia.
a.      Secara fisika dengan menggunakan uap iodium, lampu UV
b.      Secara kimia dengan menggunakan pereaksi cerium sulfat,
      dragendrof, liberman burchard.
Kecepatan elusi pada kromatografi kertas dipengaruhi oleh:
a.       Ketebalan kertas
b.      Kekentalan eluen
c.       Pelarut, jangan menggunakan pelarut yang terlalu cepat
      menguap.
   Pada kromatografi kertas, eluen bergerak berdasarkan gaya kapiler dari bawah keatas
(ascending) sama dengan KLT. Tetapi bisa juga dengan gaya gravitasi bila elusinya dari atas
ke bawah (descending). Eluen yang digunakan pada kromatografi kertas umumnya adalah
campuran berbagai pelarut terutama air.
Kertas kromatografi yang sering digunakan adalah kertas whatmann yang beredar
bermacam-macam seperti ukuran 20 x 20 cm, 5 x 100 cm dan 50 x 50 cm.
Kromatografi kertasserat fasa penyokongnya lebih pendek, bercaknya lebih kecil dari
pada KLT (kromatografi lapis tipis), waktunya lebih lama dari pada adsorben lain, tapi lebih
singkat dari pada KLTtidak bisa menggunakan pereaksi H2SO4 karena selulosa akan
terdekomposisi.
b. Kromatografi Partisi
Partisi merupakan analog dengan ekstraksi pelarut.Fase diam diikatkan pada padatan
lapis tipis yang lembam (inert). Karena fase diam cair diikatkan pada padatan pendukung
maka masih diperdebatkan apakah proses adsorpsinya merupakan partisi murni atau partisi
yang dimodifikasi karena absorpsi juga mungkin terjadi (Rohman,2007).
Cara ini didasarkan pada partisi linarut antara dua pelarut yang tak bercampur, salah
satunya diam (fase diam) dan yang lainnya bergerak (fase gerak). Pada tahap awal KC, fase
diam dibuat dengan cara yang sama seperti membuat penyangga kromatografi gas (Johnson,
Stevenson,1991).
c. Pertukaran Ion
Cara ini didasarkan pada pertukaran (penjerapan) ion antara fase gerak dan titik ion
pada kemasan.Banyak dammar diperoleh dari kopolimer stirena divinilbenzena yang telah
ditambahi gugus fungsi.Dammar jenis asam sulfonat dan jenis amin kuartener merupakan
pilihan terbaik untuk sebagian besar pemakaian.Baik fase terikat maupun dammar telah
digunakan. Cara tersebut banyak dipakai dalam ilmu hayat, contohnya pemisahan asam
amino, dan dapat pula dipakai untuk pemisahan kation dan anion (Jonhson, Stevenson,1991)
d. Kromatografi Eksklusi
Eksklusi berbeda dari mekanisme sorpsi yang lain, yakni dalam eksklusi tidak ada
interaksi spesifik antara solute dengan fase diam. Teknik ini unik karena dalam pemisahan
didasarkan pada ukuran molekul dari zat padat pengepak (fase diam). Pengepak adalah suatu
gel dengan permukaan berlubang-lubang sangat kecil (porous) yang inert.Sebagai fase gerak
digunakan cairan. Kromatografi jenis ini sangat dipengaruhi oleh perbedaan bentuk struktur
dan ukuran molekul (Rohman,2007).
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
Kromatografi cair kinerja tinggi atau KCKT atau biasa juga disebut dengan HPLC
(High Performance Liquid Chromatography) dikembangkan pada akhir tahun 1960an dan
awal tahun 1970an. Saat ini, KCKT merupakan teknik pemisahan yang diterima secara luas
untuk analisis dan pemurnian senyawa tertentu dalam suatu sampel tertentu seperti asam-
asam amino, asam-asam nukleat, dan protein-protein dalam cairanfisiologis;menentukan
kadarsenyawa-senyawa aktif obat, produk hasil samping proses sintesis,

Kromatografi berdasarkan fase yang digunakan dapat dibedakan menjadi

(a) kromatografi Padat cair; (b) kromatografi Padat cair;  (c) kromatografi Cair cair
(k.partisi); (d) kromatografi Gas cair
a. Kromatografi Padat cair, bila fase geraknya berupa air sedangkan fase diamnya berupa
padatan yang amorf yang dapat menyerap. 
b. Kromatografi gas-padat, bila fase geraknya berupa gas dan fase diamnya berupa padatan
yang dapat menyerap/mengadsorp. 
Kromatografi gas-padat, bila fase geraknya berupa gas dan fase diamnya berupa padatan
yang dapat menyerap/mengadsorp. 
c. Kromatografi cair-cair, bila fase gerak dan diamnya berupa cairan, dimana fase diamnya
dilapisi pada permukaan padatan pendukung yang inert 
d. Kromatografi gas-cair, bila fase geraknya berupa gas dan fase diamnya berupa cairan
yang dilapiskanpada padatan pendukung yang inert.

Kromatografi Berdasarkan alat yang digunakan dapat dibedakan menjadi

(a)    Kromatografi planar; (b) HPLC; (c) Kromatografi kertas; (d) Kromatografi cair
kinerja tinggi; (e) kromatogarfi vakum; (f) kromatografi kolom.
a. Kromatografi kolom, apabila komponen yang akan dipisahkan bergerak bersama fase
gerak melalui sebuah kolom kemudian setiap komponen terpisahkan berupa zona-zona
pita. Pada kromatografi analitik setiap komponen yang keluar dari kolom akan dicatat oleh
rekorder dan disajikan dalam bentuk puncak (peak) yang menunjukkan konsentrasi eluen
sebagai fungsi waktu. Untuk suatu senyawa yang mengandung komponen tunggal akan
ditandai dengan waktu elusi yang tampak pada konsentrasi eluen maksimum. Tinggi atau
luasan puncak sebanding dengan konsentrasi komponen sampel. Pada kromatografi
preparatif, akan diperoleh sejumlah fraksi isolate dari komponen sampel dalam fase gerak.
b. Kromatografi planar (kromatografi lapis tipis dan kromatogafi kertas), apabila komponen
yang akan dipisahkan bergerak bersama fase gerak dalam sebuah bidang datar. Senyawa
yang bergerak berupa bentuk noda (spot) yang dapat dikenali dengan bantuan metode
fisika, kimia, maupun biologis. Posisi noda menunjukkan identitas suatu komponen /
senyawa, sedangkan besar atau intensitasnya menunjukkan konsentrasinya. Pada
kromatografi planar beberapa komponen dapat dipisahkan secara bersamaan maupun
dipisahkan dengan dua langkah yang pertama, Cara ini dikenal dengan metode
kromatografi dua dimensi.
 c. Kromatografi cair kinerja tinggi atau KCKT atau biasa juga disebut dengan HPLC (High
Performance Liquid Chromatography) dikembangkan pada akhir tahun 1960an dan awal
tahun 1970an. Saat ini, KCKT merupakan teknik pemisahan yang diterima secara luas
untuk analisis dan pemurnian senyawa tertentu dalam suatu sampel tertentu seperti asam-
asam amino, asam-asam nukleat, dan protein-protein dalam cairanfisiologis;menentukan
kadar senyawa-senyawa aktif obat, produk hasil samping proses sintesis.
d. Kromatografi cair vakum (KCV)
Kromatografi Cair Vakum (KCV) merupakan salah satu metode fraksinasi yaitu dengan
memisahkan crude extract menjadi fraksi-fraksinya yang lebih sederhana. Pemisahan
tersebut memanfaatkan kolom yang berisi fasa diam dan aliran fasa geraknya dibantu
dengan pompa vakum.Fasa diam yang digunakan dapat berupa silika gel atau alumunium
oksida (Ghisalberti, 2008).
Fasa diam yang digunakan dikemas dalam kolom yang digunakan dalam KCV. Proses
penyiapan fasa diam dalam kolom terbagi menjadi dua macam, yaitu:
1) Cara Basah
Preparasi fasa diam dengan cara basah dilakukan dengan melarutkan fasa diam dalam
fase gerak yang akan digunakan. Campuran kemudian dimasukkan ke dalam kolom
dan dibuat merata.Fase gerak dibiarkan mengalir hingga terbentuk lapisan fase diam
yang tetap dan rata, kemudian aliran dihentikan (Sarker et al., 2006).
2) Cara kering
Preparasi fasa diam dengan cara kering dilakukan dengan cara memasukkan fase diam
yang digunakan ke dalam kolom kromatografi. Fase diam tersebut selanjutnya
dibasahi dengan pelarut yang akan digunakan (Sarker et al., 2006).
Preparasi sampel saat akan dielusi dengan KCV juga memiliki berbagai metode seperti
preparasi fasa diam. Metode tersebut yaitu cara basah dan cara kering (Canell, 1998).
Preparasi sampel cara basah dilakukan dengan melarutkan sampel dalam pelarut yang
akan digunakan sebagai fasa gerak dalam KCV. Larutan dimasukkan dalam kolom
kromatografi yang telah terisi fasa diam. Bagian atas dari sampel ditutupi kembali
dengan fasa diam yang sama. Sedangkan cara kering dilakukan dengan
mencampurkan sampel dengan sebagian kecil fase diam yang akan digunakan hingga
terbentuk serbuk. Campuran tersebut diletakkan dalam kolom yang telah terisi dengan
fasa diam dan ditutup kembali dengan fase diam yang sama (Canell, 1998; Sarker et
al., 2006).
e. HPLC (High Performance Liquid Chromatography)
Teknik pemisahan HPLC memiliki banyak keunggulan dibanding dengan kromatografi
lainnya, diantaranya adalah: cepat dalam proses analisa, resolusi yang lebih tinggi,
sensitivitas detektor yang lebih tinggi, kolom yang dipakai dapat digunakan kembali, ideal
dan cocok untuk zat bermolekul besar dan berionik dan mudah untuk rekoveri sampel.
 HPLC boleh dibilang sebagai teknik tercanggih dalam metode kromatografi. HPLC juga
menggunakan sistem instrumen seperti pada kromatogarfi gas. Di dalam teknik ini juga
digunakan tekanan dan kecepatan yang cukup tinggi sehingga mampu dihasilkan resolusi
yang lebih baik.
Jenis kromatografi yang bermanfaat dalam analisa kualitatif dan kuantitatif
yang digunakan dalam penetapan kadar dan pengujian Farmakope Indonesia adalah
kromatografi Kolom, Kromatografi Gas, Kromatografi Kertas, Kromatografi Lapis Tipis
dan KCKT.
C. Cara membedakan fase gerak dan fase diam
1. Fase diam (Stationary phase) merupakan salah satu komponen yang penting dalam
proses pemisahan dengan kromatografi karena dengan adanya interaksi dengan fase
diamlah terjadi perbedaan waktu retensi (tR) dan terpisahnya komponen suatu senyawa
analit termasuk asam amino. Fase diam dapat berupa bahan padat atau porous (berpori)
dalam bentuk molekul kecil atau cairan yang umumnya dilapiskan pada padatan
pendukung.
2. Fase gerak (Mobile phase) merupakan pembawa analit (asam amino), dapat bersifat inert
maupun berinteraksi dengan analit tersebut. Fase gerak dapat berupa bahan cair dan dapat
juga berupa gas inert yang umumnya dapat dipakai sebagai carrier gas senyawa mudah
menguap (volatil).
 BAB III
PENUTUP
A. Kesimpulan
Kromatografi merupakan suatu metode pemisahan yang dewasa ini telah banyak
digunakan, dibandingkan dengan metode yang lainnya seperti detilasi, kristalisasi,
pengendapan, ekstraksi, dan lain-lain mempunyai keuntungan dalam pelaksanaan yang lebih
sederhana, penggunaan waktu yang sangat singkat terutama mempunyai kepekaan yang
tinggi serta mempunyai kemampuan memisahkan yang tinggi, Metode ini digunakan, jika
dengan metode lain tidak dapat di lakukan misalnya karena jumlah cuplikan sangat sedikit
atau campurannya kompleks.
Penggolongan Kromatografi
1. Berdasarkan prinsip/mekanisme pemisahan
2. Berdasarkan fase yang digunakan
3. Berdasarkan alat yang digunakan
Cara membedakan fase gerak dan fase diam
1. Fase diam (Stationary phase) merupakan salah satu komponen yang penting dalam
proses pemisahan dengan kromatografi karena dengan adanya interaksi dengan fase
diamlah terjadi perbedaan waktu retensi (tR) dan terpisahnya komponen suatu senyawa
analit termasuk asam amino. Fase diam dapat berupa bahan padat atau porous (berpori)
dalam bentuk molekul kecil atau cairan yang umumnya dilapiskan pada padatan
pendukung.
2. Fase gerak (Mobile phase) merupakan pembawa analit (asam amino), dapat bersifat inert
maupun berinteraksi dengan analit tersebut. Fase gerak dapat berupa bahan cair dan
dapat juga berupa gas inert yang umumnya dapat dipakai sebagai carrier gas senyawa
mudah menguap (volatil).