KR OMATOGR AFI

Good Laboratory Practices

Farmasi klinis
Universitas Prima Indonesia
K R O M AT O G R A F I
LAPIS TIPIS
KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS

• KLT (Izmailoff dan Schraiber-1938)

Merupakan bentuk kromatografi planar yang mempunyai fase diam berupa lapisan yang uniform
pada permukaan bidang datar yg didukung oleh lempeng kaca, alumunium atau plastik dan fase
gerak berupa cairan (pengembang/pelarut) yang bergerak disepanjang fase diam karena
pengaruh gaya kapiler.
KEUNTUNGAN KLT
• Lebih mudah pelaksanaannya n peralatan serta lebih murah biayanya dari jenis
kromatografi lain.
• Peralatan yang digunakan lebih sederhana.
• Hampir setiap lab. dapat melaksanakan setiap saat secara cepat.
• Banyak digunakan untuk tujuan analisis.
• Identifikasi pemisahan dapat dilakukan dengan banyak cara, mis: pereaksi warna dan
fluorosensi/radiasi dgn sinar uv.
• Ketepatan penentuan kadar dapat terpenuhi.
FASE DIAM KLT
Secara umum
• Penjerap berukuran kecil, d= 10-30 mikrometer.
• Ketebalan: 250 mikrometer
• Semakin kecil ukuran partikel, semakin baik kinerja KLT.
• Cth; silika, serbuk selulosa, alumina, kieselguhr, gel sphadex.
• + pengikat, + fluoresen.
 PEMBUATAN PL AT KLT
• Lempeng kaca dibersihkan dengan akuades lalu dibilas dengan alkohol atau
aseton, lalu dikeringkan.
• Pembuatan bubur silika: campur bagian zat penjerap dengan akuades
perbandingan (1:2), dikocok kuat2 dlm labu erlenmeyer selama 30 detik.
Massa kental dicetak menjadi plat dengan cara (salah satu): penuangan,
pencelupan, penyemprotan dan memakai alat khusus pembuat plat.
• Persiapan di atas harus segera selesai dalam waktu 2 menit.
• Plat silika didiamkan sampai mengering (±24 jam).
• Kemudian plat diaktifkan pada suhu 105ºC selama 30 menit.
• Ditunggu sampai plat telah dingin, plat siap dipakai.
TATA NA MA LE MPENG K LT ( SUMBER: A D AMOVICS, 1 997)
Simbol/Singkatan Arti

G Pengikat gipsum (CaSO4.½H2O)

S Pengikat starch (pati)
O Pengikat organik: polimetaklirat, polikarboksilat, bersifat keras dan tahan
terhadap abrasi
H atau N Todak ada pengikat luar.
HL Lapisan keras yang tahan terhadap abrasi krn mengandung pengeras
organik
P Lapisan untuk preparatif
P + CaSO4 Lapisan preparatif yang mengandung kalsium sulfat
F atau UV Ditambah bahan yang berfluorosensi seperti seng silikat
254 dan 366 Digunakan setelah simbol F atau UV, untuk menunjukkan panjang
gelombang
60 Silika gel (E. Merck) yang mempunyai ukuran pori 60Aº
4,7,9 Bilangan yang dicantumkan setelah nama penjerap dan menunjukkan pH
bubur penjerap
FASE D IAM PADA K LT ( SUMBER: K EALEY D AN HAINES, 2 002)
Penjerap (Fase Diam) Mekanisme Sorpsi Penggunaan

Silika Gel Adsorpsi Asam Amino, Hidrokarbon,

Vitamin, Alkaloid

Silika yang dimodifikasi dengan Partisi termodifikasi Senyawa-senyawa nonpolar

hidrokarbon

Serbuk Selulosa Partisi Asam amino, nukleotida,

karbohidrat

Alumina Adsorpsi Hidrokarbon, ion logam, pewarna

makanan, alkaloid

Kieselguhr (tanah Diatome) Partisi Gula, asam2 lemak

Selulosa penukar ion Pertukaran ion Asam nukleat, nukleotida, halida

dan ion2 logam

Gel sphadex Eksklusi Polimer, protein, kompleks logam

ᵝ-siklodekstrin Interaksi adsorpsi stereospesifik Campuran enansiomer

FASE GERAK KLT

Pemilihan dan optimasi fase gerak

1. Mempunyai kemurnian yg sangat tinggi.
2. Daya elusi : harga Rf 0,2-0,8.
3. Peningkatan harga Rf dengan pelarut sedikit polar, mis dietil eter kedalam metil benzen.
4. Penambahan asam atau basa untuk analit yang bersifat asam atau basa.
Sumber pemilihan fase gerak:
1. Pustaka/literatur
2. Cara coba-coba dimulai dengan pemakaian 2 pelarut
APLIKASI PENOTOLAN SAMPEL
 Syarat:
1. Ukuran bercak sekecil dan sesempit mungkin.
2. Penotolan sampel secara otomatis lbh dipilih.
3. Penotolan sampel yg tidak tepat: bercak menyebar dan puncak ganda.
4. Sampel yang dittolkan paling sedikit 0,5µl.
5. Penotolan 2-10µl, penotolan dilakukan bertahap dan dilakukan
pengeringan.
6. Penotolan: pita dan noda.
 PARAMETER-PARAMETER APLIKASI
PENOTOLAN YANG DIREKOMENDASIKAN

Tujuan Diameter Bercak Konsentrasi Banyaknya

(mm) Sampel (%) Sampel (µg)
Densitometri 2 mm untuk volume 0,02 - 0,2 0,1 – 1 (untuk KLT-
sampel 0,5µl KT)
1 – 10
(konvensional)
Identifikasi 3 mm untuk volume 0,1 - 1 1 - 20
sampel 1µl
Uji kemurnian 4 mm untuk volume 5 100
sampel 2µl
 TEKNIK PENGEMBANGAN
• Fase gerak dalam bejana harus sudah jenuh.
• Tepi bawah fase gerak 0,5-1 cm, tinggi 0,5-1 cm dr atas lempeng.
• Bejana harus tertutup rapat.
• Penjenuhan dengan mencelupkan sedikit ujung kertas saring kedalam bejana.
DETEKSI BERCAK
• Penyemprotan dengan Reagen kromogenik, mis: asam sulfat, FeCl3
• Sinar uv : 254 dan 366 nm.
• Melakukan scanning (densitometri).
B EBERAPA R EAGEN U MUM D A N S PESIFIK YANG D IGUNAK AN PA DA K LT

Metode Deteksi Warna Bercak Solut Penggunaan

Asam fosfomolibdat + Biru gelap Beberapa senyawa organik
pemanasan
Asam sulfat pekat + Hitam kecoklatan Semua senyawa organik
pemanasan
Uap iodium Coklat Beberapa senyawa organik
Ninhidrin Pink ke ungu Asam-asam amino dan amina
Vanilin/asam sulfat Merah/hijau/pink Alkohol, keton
Anisaldehid Berbagai macam Steroid
TEKNIK ANALISIS
• Perlakuan dan nilai Rf yang sama.
• Densitometri
• Pengerokan bercak lalu menetapkan kadar senyawa yg terdapat dalam bercak.
• Preparatif.
RF
 RF
(RETARDATION FACTOR)
Jarak yang ditempuh komponen
Rf =
Jarak yang ditempuh fase gerak

Jarak yang ditempuh komponen

hRf = X 100
Jarak yang ditempuh fase gerak
NILAI RF DIPENGARUHI:

• Suhu
• jenis kertas
• tebal kertas
• jenis eluen.
P ENGGUNA AN K LT
 Analisis Kualitatif: uji identifikasi dengan senyawa baku ataupun reagen kimia
(penyemprot/deteksi bercak) melalui parameter harga Rf dan warna yang diukur
pada kondisi KLT yang sama.
 Analisis Kuantitatif
1. Teknik densitometri: bercak diukur langsung pada lempeng menggunakan ukuran
luas.
2. Mengerok bercak, lalu menetapkan kadar senyawa yang terdapat dalam bercak
dengan metode analisis lain, seperti spektrofotometri.
 Analisis preparatif: untuk memisahkan analit dalam jumlah yang banyak lalu
dianalisis lebih lanjut, misalnya dengan spektrofotometri atau dengan teknik
kromatografi yang lain.
P ENGGUNA AN M ETODE K LT U NTUK A NALISIS O BAT
( SUMBER: A DAMOVICS, 1 997)

Obat (sediaan) Fase Diam Fase Gerak Deteksi

Asetaminofen Silika Gel Heksan:aseton Uv
(serbuk) (75:25)
Ampisilin (kapsul, Silika Aseton:toluen:air:asa ninhidrin
suspensi oral) m (650:100:100:25)
Vitamin C silika Metanol:aseton:air uv
(20:40:3)
morfin Silika (dijenuhkan Dikembangkan Uv 279
dengan natrium dengan cara 2
hidroksida 0,1N) dimensi,
sikloheksan:toluen:di
etilamin (75:15:10)
lalu
kloroform:metanol
(9:1)
MANFAAT DAN APLIKASI
Digunakan secara luas untuk analisis solut-solut organik, terutama di bidang
biokimia, farmasi, klinis, forensik, baik untuk analisis kualitatif maupun
kuantitatif, dengan membandingkan nilai/harga Rf, warna yang sama.
Memnentukan banyak komponen campuran.
Identifikasi senyawa.
Memantau berjalannya suatu reaksi.
Menentukan efektifitas kemurnian.
Menentukan kondisi sesuai untuk kromatografi kolom dan memantau
hasilnya.
Melakukan screening sampel untuk obat.
SEMOGA BERMANFAAT

TQ 