NIlai 70

- Kurva serapan tidak perlu dicari persamaan

garisnya
LAPORAN PRAKTIKUM - Persamaan garis kurva standar belum benar,
shg perhitungan konsentrasi sampel juga
KIMIA ANALITIK belum benar
- Kegunaan blanko?
- Linearitas konsentrasi-absorbansi hanya
berlaku pada absorbansi 0,2-0,8

SPEKTROFOTOMETRI

Nama Anggota : Bintang Firzha / 2301909926

Felisha Airin / 2301894672
Graciosa Elano Milendia / 2301847410
Lin Hill Field / 2301908034
Livia Meisaka / 2301866681
Kelas : BA46
Shift / Kelompok : 2/1
Hari / Tanggal : Jumat / 2 Oktober 2020
Asisten : Stefanny

LABORATORIUM KIMIA
FOOD TECHNOLOGY
FAKULTAS TEKNIK
BINA NUSANTARA UNIVERSITY
2020
1. Pendahuluan
Spektroskopi adalah cabang ilmu (kimia analitik) yang mempelajari tentang
interaksi radiasi elektromagnetik dengan materi. Sebelum adanya terapan dan dasar
yang nyata tentang spektroskopi dan spektrometri, yang diketahui hanya interaksi
analit terjadi di antara keduanya materi dan radiasi elektromagnetik. Namun,
sekarang dengan adanya dasar dan terapan nyata, spektroskopi telah diperluas
untuk mencakup interaksi antara materi dan bentuk energi lainnya. Alat
yangdigunakan untuk menghitung atau analisis dalam spektroskopi disebut
spectrometer (Lucatorto, Parr dan Baldwin, 2014).
Berdasarkan teknik analis spektroskopi menggunakan cahaya serapan infra
merah dan sinar ultra-violet sehingga teknik spektroskopi ini diklasifikasi sebagai
spektrofotometri. Spektrofotometri adalah suatu metode spektro-analitik
pengukuran baik untuk kualitatif maupun kuantitatif dari transmisi (atau
penyerapan), refleksi dan sifat emisi suatu spesies kimia atau bahan sebagai fungsi
panjang gelombang. Karena setiap senyawa secara unik menyerap,
mentransmisikan, atau memantulkan cahaya pada suatu benda tertentu rentang
panjang gelombang (Kafle, 2020).
Prinsip kerja spektrofotometri yaitu mengukur seberapa banyak bahan
kimia zat menyerap, mentransmisikan atau memancarkan radiasi dan
menghubungkan radiasi yang diserap atau dipancarkan dengan jumlah analit yang
diinginkan. Metode untuk pengukuran reflektansi yang akurat pada kejadian miring
dari bahan reflektansi yang sangat tinggi seperti: cermin dan cermin laser.
Contohnya: Fourier transform infrared (FTIR), ultraviolet, dan spektrofotometri
inframerah-dekat yang terlihat (UV / Vis / NIR) (Lucatorto, Parr dan Baldwin,
2014).
Tujuan dari spektrofotometri adalah untuk mengkualifikasikan,
mengidentifikasi ataupun menentukan kadar senyawa-senyawa kimia maupun zat
gizi, seperti protein dalam suatu larutan atau sampel pangan dengan ketelitian yang
tinggi sehingga metode ini sering digunakan dalam dunia pangan, khususnya dalam
bidang teknologi pangan. Maka dari itu, prinsip dasar dari spektrofotormetri harus
dipahami dan diterapkan (Lucatorto, Parr dan Baldwin, 2014).

2. Tujuan
Tujuan dari praktikum ini, yaitu mengetahui dan memahami cara kerja
spektrofotometri, dapat menentukan kurva serapan spektrofotometer, kurva larutan
standar, serta menentukan jumlah konsentrasi suatu sampel melalui perhitungan
absorbansi.

1
3. Metodologi
3.1. Alat
Alat yang digunakan dalam praktikum ini adalah spketrofotometer,
kuvet, gelas beker, mikropipet.
3.2. Bahan
Bahan yang digunakan dalam praktikum ini adalah akuades, pewarna
makanan, tisu.
3.3. Cara Kerja
Cara kerja dari praktikum kali ini adalah sembilan gelas beker diisi
dengan larutan stok berupa pewarna makanan berwarna ungu dimana masing-
masing gelas beker diisi dengan larutan stok yang konsentrasinya berbeda-
beda sesuai data yang telah ditentukan, yaitu 1 mL diencerkan dengan aquades
hingga 20 mL, 40 mL, 60 mL, 80 mL, 100 mL, 150 mL, 200 mL, 250 mL, dan
sample X. Kedelapan larutan stok tersebut digunakan sebagai referensi supaya
konsentrasi sampel X dapat ditentukan. Tiga belas kuvet disiapkan, delapan
untuk larutan stok, tiga untuk sampel X, satu untuk aquades sebagai blanko,
dan masing-masing kuvet dibersihkan terlebih dahulu dengan aquades.
Caranya adalah aquades dimasukkan ke dalam kuvet dan dikocok sehingga
mengenai seluruh bagian kuvet, kemudian setiap larutan stok dimasukkan ke
masing-masing kuvet dan hal yang sama dilakukan. Penentuan konsentrasi
sampel X dapat dimulai dengan cara menentukan panjang gelombang
maksimum (λmax) sesuai data yang telah ditentukan, yaitu 350 nm, 370 nm,
390 nm, 410 nm, 430 nm, 450nm sehingga absorbansi terkuat diketahui. Pada
langkah ini, dapat digunakan salah satu larutan stok saja, yaitu larutan dengan
konsentrasi tertinggi (1 mL diencerkan menjadi 20 mL). Larutan stok tersebut
(larutan standar) dan aquades (blanko) dipindahkan ke dalam kuvet masing-
masing, kurang lebih sebanyak ¾ tinggi kuvet menggunakan pipet mikro.
Kuvet-kuvet tersebut dibersihkan dengan tisu yang telah dibasahkan oleh
alkohol, selanjutnya dimasukkan ke dalam spektrofotometer yang telah
dikalibrasi dan sisi tembus pandang kuvet harus diletakkan menghadap lubang
dudukan supaya cahaya dapat menembusnya, kemudian tentukan λmax. Setelah
lamda maksimum ditentukan, larutan stok lainnya termasuk sampel X
dimasukkan ke dalam masing-masing kuvet dimana secara khusus sampel X
dimasukkan ke dalam tiga kuvet sekaligus untuk pengulangan perhitungan
absorbansi supaya lebih valid (triplo). Kuvet-kuvet tersebut dimasukkan
secara bergantian ke dalam spektrofotometer, lima terlebih dahulu, kemudian

2
 sisanya dimana blanko juga termasuk ke kedua proses tersebut karena
disesuaikan dengan jumlah lubang duduknya. Selanjutnya, absorbansi masing-
masing larutan stok dan sample dicari pada lamda maksimum yang telah dicari
sebelumnya, blanko harus di-nol-kan terlebih dahulu pada setiap pengukuran
absorbansi larutan stok yang berbeda. Setelah semua data absorbansi telah
didapatkan, data tersebut dicatat kemudian dibuat perhitungan, serta kurva
larutan standarnya sehingga didapatkan konsentrasi sample X.

4. Hasil dan Pembahasan

4.1. Hasil
Tabel 1. Data Pembuatan Larutan Standar
V1 (mL) M1 (ppm) V2 (mL) M2 (ppm)
1 20 20 1
1 20 40 0.5
1 20 60 0.33
1 20 80 0.25
1 20 100 0.2
1 20 150 0.13
1 20 200 0.1
1 20 250 0.08
Contoh perhitungan:
Diketahui : V1 = 1 mL
M1 = 20 ppm
V2 = 40 mL
Ditanya : M2
Dijawab :
V1 × M1 = V2 × M2
1 mL × 20 ppm = 40 mL × M2
M2 = 0.5 ppm

3
Tabel 2. Data Panjang Gelombang Dalam Penentuan Lamda Maksimum
Konsentrasi Larutan Panjang Gelombang
Absorbansi (Å)
(mg/L) (nm)
1 350 1.006
1 370 0.765
1 390 0.880
1 410 0.978
1 430 0.920
1 450 1.209

Kurva Serapan Spektrofotometer y = 0.0023x + 0.058

R² = 0.322
1.400

1.200

1.000
350
Absorbansi

0.800 370

0.600 390
410
0.400
430
0.200
450
0.000
0 100 200 300 400 500
Panjang Gelombang (nm)

Grafik 1. Kurva Serapan Spektrofotormeter (Data Praktikum)

Tabel 3. Penentuan Konsentrasi Sampel

Konsentrasi (mg/L) Absorbansi
1 1.209
0.5 0.681
0.33 0.461
0.25 0.340

4
 0.2 0.270
0.13 0.177
0.1 0.142
0.08 0.108

Kurva Larutan Standar y = 0.827x - 0.0265

R² = 0.9952
1.2

0.8
Absorbansi

0.6

0.4

0.2

0
0.000 0.200 0.400 0.600 0.800 1.000 1.200 1.400

Konsentrasi (mg/L) Linear (Konsentrasi (mg/L))

Grafik 2. Kurva Larutan Standar (Data Praktikum)

Tabel 4. Data Pengulangan Perhitungan Konsentrasi Sampel (Data Praktikum)

Ulangan Absorbansi Konsentrasi (mg/L)
1 0.345 0.449
2 0.337 0.439
3 0.340 0.443
Contoh perhitungan:
Diketahui : y = 0.827x – 0.0265
A1 = y = 0.345
Ditanya : x
Dijawab :
y = 0.827x – 0.0265
0.345 = 0.827x – 0.0265

5
 0.345+0.0265 = 0.827x
0.3715
=x
0.827

0.449 =x

4.2. Pembahasan
Spektrofotometer berfungsi untuk mengukur jumlah cahaya yang
diserap oleh sampel. Instrumen ini bekerja dengan meneruskan seberkas cahaya
melalui sampel dan mengukur intensitas cahaya yang mencapai detektor.
Teknik spektofotometri umumnya digunakan untuk pendugaan biomolekul
kualitatif dan kuantitatif seperti protein, gula karbohidrat, asam amino, asam
nukleat, vitamin, dan lain-lain. Teknik ini diterapkan atau dilakukan
berdasarkan Hukum Beer Lambert. Spektrofotometer UV-Visible digunakan
untuk mengukur absorbansi di UV dan daerah spektrum yang terlihat. Prisma
atau kisi akan membagi cahaya menjadi warna komponennya dan mengarahkan
cahaya monokromatik ke larutan sampel yang akan dianalisis. Berkas cahaya
terdiri dari aliran foton. Ketika foton bertemu dengan molekul analit, analit
akan menyerap foton. Penyerapan ini mengurangi jumlah foton dalam berkas
cahaya, sehingga mengurangi intensitas berkas cahaya. Spektrofotometer dapat
mengukur dan menghasilkan rentang spektrum tampak yang lengkap dan
berkelanjutan. Sumber cahaya diatur untuk memancarkan foton dan beberapa
foton diserap saat berkas cahaya melewati sel yang berisi larutan sampel.
Intensitas cahaya yang mencapai detektor kurang dari intensitas yang
dipancarkan oleh sumber cahaya (Nair, 2008).
Dalam spektrofotometer UV-Visible terdapat dua sumber lampu, satu
filamen tungsten yang menyediakan panjang gelombang tampak dan yang
lainnya adalah lampu hidrogen yang membentuk sumber cahaya dalam rentang
UV. Spektofotometer dibagi menjadi dua, yaitu single beam dan double beam.
Pada single beam, sel yang mengandung pelarut ditempatkan pada berkas
cahaya untuk mengukur absorpsi, kemudian larutan absorbansi ditempatkan di
dalam sel dan absorbansi zat terlarut ditentukan dari perbedaan antara kedua
pengukuran. Agar akurat, metode ini membutuhkan sumber radiasi yang sangat
stabil dan untuk menghindari kesalahan karena ketidakstabilan sumber. Saat
ini, sebagian besar spektrofotometer modern sudah dalam mode double beam.
Pada double beam, berkas sumber dibagi menjadi dua komponen, salah satunya
dilewatkan melalui sel referensi yang hanya mengandung pelarut dan yang

6
lainnya dilewatkan melalui sel sampel yang berisi larutan. Perbandingan dari
dua intensitas pancaran memberikan absorbansi (Nair, 2008).
Prinsip spektrofotometer, yaitu berdasarkan absorpsi cahaya pada
panjang gelombang tertentu melalui larutan yang mengandung kontaminan dan
konsentrasinya akan ditentukan dimana proses ini disebut "absorpsi
spektrofotometer”. Spektrofotometer menggunakan gelombang cahaya
tampak, panjang gelombang pada gelombang ultraviolet dan infra merah.
Prinsip kerjanya adalah jumlah cahaya yang telah diabsorpsi oleh larutan
sebanding dengan konsentrasi kontaminan dalam larutan. Prinsip ini dijelaskan
dalam Hukum Beer Lambert, yaitu menghubungkan antara absorbansi cahaya
dengan konsentrasi pada suatu bahan yang mengabsorspi. Persamaan Hukum
Beer Lambert dapat ditulis sebagai berikut (Lestari, 2010).
𝐼 1
A= log(𝐼𝑜) = (𝑇) = a × b × c
(Lestari, 2010)
Keterangan :
A : Absorbance
I : Intensitas cahaya masuk
Io : Intensitas cahaya keluar
T : Transmittansi
A : Tetapan absorpsivitas molar
B : Panjang jalur
C : Konsentrasi bahan yang mengabsorpsi
Nilai absorbansi adalah perbandingan jumlah sinar yang akan diserap
dengan jumlah sinar yang datang. Nilai absorbansi bergantung pada jumlah zat
yang terkandung dalam bahan, semakin banyak kadar zat maka semakin banyak
pula cahaya yang terserap pada panjang gelombang tertentu sehingga nilai
absorbansi akan sebanding dengan konsentrasi zat. Nilai absorbansi dapat
terbaca karena adanya cahaya yang dipantulkan. Apabila cahaya putih yang
mengandung seluruh spektrum panjang gelombang melewati daerah tertentu
dan menyerap panjang gelombang tertentu, maka medium itu akan terlihat
berwarna. Panjang gelombang yang diteruskan ke mata akan menentukan
warna medium. Warna medium ini disebut juga dengan warna komplementer
terhadap warna yang diabsorpsi (Neldawati, Ratnawulan dan Gusnedi, 2013).
Dalam praktik analitik, konsentrasi analit yang diberikan, dalam banyak
kasus, ditentukan oleh teknik kurva standar. Teknik ini didasarkan pada
penentuan hubungan antara absorbansi dan konsentrasi analit dalam kondisi
pengukuran. Hubungan tersebut diberikan dalam persamaan regresi, atau secara

7
grafis dalam bentuk kurva standar. Untuk sistem yang mematuhi hukum
Lambert Beer (absorbansi berbanding lurus dengan konsentrasi), kurva
berbentuk garis lurus. Kesalahan penentuan lebih kecil jika penyerapan radiasi
adalah konsekuensi dari sifat analit itu sendiri, seperti ion berwarna logam
transisi, Konversi analit menjadi bentuk yang mampu menyerap radiasi dalam
priporsi ke konsentrasinya memerlukan beberapa prosedur tambahan. (seperti
penggunaan reagen kromogenik. penyesuaian pH, atau penambahan agen
penutup), yang harus identik dalam perlakuan larutan standar dan larutan
sampel. Pengukuran absorbansi harus dilakukan setelah equilibrium
diselesaikan di dalam sistem. Jika absorbansi bervariasi dengan waktu, waktu
pengukuran harus ditentukan secara ketat. Dalam praktik analitik, penggunaan
terkadang dibuat dari kurva standar di mana perubahan absorbansi berbanding
terbalik dengan perubahan konsentrasi analit. Konsentrasi analit diperoleh dari
pengurangan absorhanee sistem, yang sebanding dengan jumlah analit. Akurasi
ketepatan penentuan tergantung pada pengetahuan yang tepat tentang
konsentrasi reagen awal dan reproduktifitas kondisi reaksi untuk berbagai
konsentrasi analit (Marczenko dan Balcerzak, 2000).
Jika panjang jalur dan absorptivitas konstan, maka konsentrasi dan
absorbansi berhubungan langsung. Absorptivitas adalah properti panjang
gelombang yang dipilih dan senyawa yang diukur. Jika panjang jalur
digandakan, maka dua kali lebih banyak molekul di jalur cahaya.
Penyerapannya berlipat ganda, tetapi konsentrasinya tetap sama. Biasanya,
dalam spektrofotometri di laboratorium klinis, panjang jalur dan absorptivitas
adalah konstanta, dan satu-satunya variabel adalah konsentrasi standar dan
yang tidak diketahui. Hukum Beer memungkinkan penentuan konsentrasi
sampel yang tidak diketahui. Untuk menghitung konsentrasi yang tidak
diketahui, absorbansi dari standar konsentrasi yang diketahui diukur, kemudian
diplot pada kertas grafik. Karena absorbansi versus konsentrasi memiliki
hubungan linier, garis lurus akan diperoleh jika diplot pada kertas grafik linier.
Konsentrasi hal-hal yang tidak diketahui kemudian dapat dibaca dari grafik ini.
Karena% T versus konsentrasi adalah hubungan nonlinier, garis lengkung akan
dihasilkan ketika diplot pada kertas grafik linier. Untuk mendapatkan garis
lurus, konsentrasi dan nilai% T harus diplot pada kertas grafik semilogaritmik.
Hubungan lincar antara absorhance dan konsentrasi memungkinkan metode
yang lebih mudah untuk menghitung konsentrasi yang tidak diketahui (Haven,
Tetrault dan Schenken, 2000).
Jika zat yang diukur mengikuti hukum Beer, kita dapat menghitung
konsentrasi yang tidak diketahui menggunakan satu standar dan proporsi

8
 sebagai berikut dimana ubungan ini akan tetap valid bila hukum Lambert Beer
masih berlaku (Haven, Tetrault dan Schenken, 2000).
Astandar/Aunknown = cstandar/cunknown
(Haven, Tetrault dan Schenken, 2000)
Dari hasil percobaan, pada tabel 1 terlihat jelas bahwa setelah larutan
stock diencerkan, konsentrasi larutan (nilai ppm) semakin mengecil disebabkan
oleh proses pengenceran. Proses tersebut dilakukan untuk mendapatkan larutan
dengan jumlah konsentrasi lebih kecil daripada larutan stock dan menggunakan
rumus V1M1 = V2M2 untuk mendapatkan perhitungan nilai konsentrasi larutan
yang sudah di encerkan (Badriyah dan Manggara, 2015). Dari hasil tabel 2 yaitu
tabel panjang gelombang maksimal, dapat diketahui bahwa penentuan panjang
gelombang maksimum dilakukan dengan mengukur nilai absorbansi larutan
standar akuades 1 ppm pada rentang panjang gelombang 350-450 nm. Untuk
mengidentifikasi gelombang yang mendapat nilai absorbansi maksimum,
dibuat kurva serapan spektrofotometer dengan rumus persamaan linier. Hasil
pengukuran absorbansi aquades 1 ppm ditunjukkan pada tabel panjang
gelombang maksimal diatas. Nilai absorbansi tertinggi diperoleh pada panjang
gelombang 450 nm dengan nilai absorbansi sebesar 1.209. Hal ini terjadi karena
panjang gelombang yang digunakan untuk melakukan analisis adalah panjang
gelombang dimana suatu zat memberikan penyerapan paling tinggi yang
disebut λ maks. Jika pengukuran menggunakan gelombang yang menghasilkan
absorbansi paling tinggi, maka data yang diperoleh akan semakin akurat (Putri
dan Setiawati, 2015). Pada tabel 3 bisa dilihat data hasil nilai konsentrasi
berbanding lurus dengan absorbansi. Nilai konsentrasi yang besar juga
membuat absorbansinya besar pula. Hal ini sangat sesuai dengan hukum
lambert beer yang menyatakan bahwa absorbansi berbanding lurus dengan
konsentrasi dikarenakan semakin besar konsentrasi, semakin besar pula
absorbansinya. Dengan data dari tabel 3, kita bisa membuat kurva standar
dengan rumus persamaan linear dengan data yang ada pada tabel 3 dan terbukti
bahwa grafik konsentrasi dan absorbansi tidak berpotongan atau berbanding
lurus, yang kembali lagi sesuai dengan hukum lambert beer. (Haven, Tetrault
dan Schenken, 2000).

5. Kesimpulan
Kesimpulan dari praktikum ini adalah spektrofotometri dapat digunakan
untuk menentukan jumlah konsentrasi suatu zat atau senyawa dalam suatu sampel
dimana dalam praktikum ini menggunakan pewarna melalui pemahaman

9
 penggunaan spektrofotometer dan perhitungan konsentrasi dengan kurva serapan,
serta kurva larutan standar.

6. Daftar Pustaka
Badriyah, L. & Manggara, A. B. (2015). Penetapan Kadar Vitamin C Pada Cabai
Merah (Capsicum Annum L.) Menggunakan Metode Spektrofotometri Uv-
Vis. Jurnal Wiyata, 2(1), 27 – 28.
Haven, M. C., Tetrault, G. A. & Schenken, J. R. (2000). Laboratory
Instrumentation. New York: John Willey & Sons.
Kafle, B. P. (2020). Chemical Analysis and Material Characterization by
Spectrophotometry. Cambridge: Elsevier Inc.
Lestari, F. (2010). Bahaya Kimia Sampling dan Pengukuran Kontaminan di Udara.
Jakarta: Penerbit Buku Kedokteran EGC.
Lucatorto, T., Parr, A. C. & Baldwin, K. (2014). Experimental Methods in the
Physical Sciences. Cambridge: Elsevier Inc.
Marczenko, Z. & Balcerzak, M. (2000). Separation, Preconcentration and
Spectrophotometry in Inorganic Analysis. Amsterdam: Elsevier.
Nair, A. (2008). Principles of Biotechnology. New Delhi: Laxmi Publications.
Neldawati, N. (2013). Analisis Nilai Absorbansi dalam Penentuan Kadar Flavonoid
untuk Berbagai Jenis Daun Tanaman Obat. Journal Pillar of Physics, 2(1),
76-83.
Putri, M. P., Setiawati, Y. H. (2015). Analisis Kadar Vitamin C Pada Buah Nanas
Segar (Ananas Comosus (L.) Merr) Dan Buah Nanas Kaleng Dengan
Metode Spektrofotometri Uv-Vis. Jurnal Wiyata. 2(1). 36 – 38.

7. Pembagian Tugas
- Bintang Firzha
- Felisha Airin
dan menyatukan laporan
- Graciosa Elano Milendia
- Lin Hill Field
- Livia Meisaka
: pembahasan nomor 4 dan 5
:cara kerja, kesimpulan, daftar pustaka, mengedit
: pembahasan nomor 1,2, dan 3
: cover, pendahuluan, tujuan
: metodologi, hasil praktikum

10