Oleh: I N.

Sujaya

PENUNTUN PRAKTIKUM
MIKROBIOLOGI

Oleh

I Nengah Sujaya
Untuk Kalangan Internal
Program Studi Ilmu Kesehatan Masyarakat
Universitas Udayana
2016

Petunjuk Praktikum Mikrobiologi

1
 Oleh: I N. Sujaya

KATA PENGANTAR

Puji syukur penulis panjatkan ke hadapan Tuhan Yang Maha Esa, Ida Sang Hyang Widi
Waca, karena hanya atas rachmat-Nya lah, Penuntun Praktikum Mikrobiologi ini bisa
diselesaikan. Penuntun Praktikum Mikrobiologi ini disusun dengan tujuan memberikan
bahan acuan kepada mahasiswa Program Studi Ilmu Kesehatan Masyarakat (PS IKM),
Universitas Udayana, tentang pengetahuan dasar dalam praktek mikrobiologi umum.
Disamping langkah dasar dalam mikrobiologi yang harus dikuasai oleh mahasiswa,
buku ini juga memberikan gambaran sekilas tentang teknik dasar biologi molekuler yang
menyebabkan revolusi dibidang ilmu mikrobiologi dan belakangan menjadi teknik yang
paling terpercaya dalam pengelompokan/klasifikasi organisme hidup di alam semesta ini.
Akhirnya dengan segala kerendahan hati penyusun menyampaikan ucapan
terimaksih yang sedalam dalamnya kepada pihak pimpinan PS IKM Unud, teman teman
sejawat staf pengajar di PS IKM Unud, serta mahasiswa yang banyak memberikan
bantuan dan dorongan sehingga Penuntun Praktikum initersusun dengan harapan buku
kecil ini bisa bermanfaat. Penyusun menyadari bahwa buku ini masih sangat jauh dari
sempurna dan oleh karena itu segala saran dan bimbingan dari pembaca sangat
diharapkan untuk penyempurnaan edisi berikutnya.

Denpasar, Oktober 2016

Penyusun,

Ir. I N. Sujaya, M.Agr. Sc.,

Ph..D.

Petunjuk Praktikum Mikrobiologi

2
 Oleh: I N. Sujaya

PETUNJUK UMUM
PETUNJUK UMUM

1. Dalam praktikum mikrobiologi, anda akan bekerja dengan berbagai macam

mikroorganisme (Bakteri, Jamur, Yeast, dll). Walaupun sebagian besar
mikroorganisme yang dipakai tidak berbahaya, hendaknya saudara bekerja dengan
hati-hati. Taatilah petunjuk-petunjuk yang diberikan oleh pembimbing praktikum
saudara.
2. Sebelum saudara mulai bekerja, hendaknya saudara mempelajari betul pekerjaan yang
akan saudara lakukan. Buatlah rencana kerja yang baik, kalau perlu dengan membuat
skema kerja, sehingga saudara dapat bekerja dengan tepat, teliti dan cepat.
3. Dalam praktikum mikrobiologi, kondisi steril (bebas dari mikroorganisme
kontaminan) sangat penting dan merupakan faktor yang paling menentukan percobaan
saudara. Oleh karena itu, ikutilah selalu cara kerja steril yang diajarkan oleh
pembimbing praktikum saudara. Transfer material, pananaman dilakukan dalam ruang
steril (cleanbench) yang dilengkapi api burner (Bunsen), filter udara, lampu UV.
4. Jagalah selalu kebersihan dan kerapihan tempat saudara bekerja, sebelum, selama, dan
sesudah praktikum.
5. Janganlah memasukkan atau menggigit pensil, kertas dan sebagainya ke dalam mulut
selama berada di dalam ruang praktikum.
6. Kalau terjadi kecelakaan, cepat laporkan kepada asisten atau pembimbing praktikum
saudara.
7. Sesudah selesai praktikum, jangan lupa mencuci tangan dengan air dan sabun.
8. Hanya dengan memperhatikan ketelitian, kebersihan, dan kesabaran, pekerjaan saudara
akan berhasil.
9. Selama di laboratorium sangat dilarang melakukan aktivitas makan atau minum
10. Peserta praktikum diwajibkan mengenakan jas praktikum (jas lab) selama melakukan
praktikum.
11. Semua bahan yang akan diinkubasi harus diberi label yang cukup (berisi nama
kelompok, tanggal, dan informasi lain yang saudara anggap penting) agar tidak
tertukar dengan bahan lain yang tampak serupa. Inkubasi umumnya dilakukan dalam
inkubator dnegan suhu yang bisa dikontrol (atau pada kasus tertentu dilakukan dalam
suhu kamar atau waterbath).

Petunjuk Praktikum Mikrobiologi

3
 Oleh: I N. Sujaya

Filter udara

Burner

Alas stainless steel

Selang gas
Switch (lampu, uv,
blower)
Gambar cleanbench

Petunjuk Praktikum Mikrobiologi

4
 Oleh: I N. Sujaya

PRAKTIKUM
PENYIAPAN DAN PEMBUATAN MEDIUM 1
1.1 Fungsi Media
Media merupakan substrat yang diperlukan untuk menumbuhkan dan mengembang-
biakkan mikroorganisme. Sebelum dipakai dalam percobaan, media ini perlu disterilkan
terlebih dahulu, supaya tidak ditumbuhi oleh mikroorganisme yang tidak dikehendaki
(kontaminan). Agar mikroba yang kita kultur dapat tumbuh dengan baik, maka persyarat-
an yang harus dipenuhi oleh suatu media adalah :
a. Didalamnya harus terkandung bahan-bahan yang diperlukan oleh mikroba yang akan
ditumbuhkan. Bahan-bahan ini meliputi unsur-unsur makro, unsur mikro, dan trace
elemen serta zat pengatur tumbuh.
b. Media tersebut harus mempunyai tekanan osmosis, tegangan permukaan, dan pH yang
sesuai dengan kebutuhan mikroba yang akan dikultur.
c. Media harus dalam keadaan steril sebelum dipakai untuk menumbuhkan mikroba yang
diperlukan.

1.2. Jenis Media

1.2.1. Menurut bahan yang dipakai dalam pembuatannya, media dapat
digolongkan menjadi :
a. Media alami : Media yang komponen pembentuknya terdiri dari bahan-bahan alam,
seperti kentang, tauge, daging, nasi, dan lain sebagainya.
b. Media semi sintetik : Media yang bahan pembentuknya terdiri dari campuran bahan-
bahan alami dan bahan sintetik. Contoh : Agar Tauge, Agar Kentang Dextrosa, dll.
c. Media sintetik : Media yang bahan pembentuknya secara keseluruhan terbuat dari
bahan-bahan sintetik. Contoh : Agar Sabouraud, Endo Agar, Agar Czapex Dox, dll.

1.2.2. Menurut bentuknya, media dapat digolongkan menjadi :

a. Media cair : Media yang tidak ditambahkan zat pemadat (agar), sehingga media ini
dalam keadaan encer (cair). Contoh : Lactose Broth, Nutrient Broth.
b. Media semi padat : Media yang mengandung bahan yang sama dengan media cair,
tetapi ditambah sedikit agar (setengah konsentrasi agar), sehingga menjadi agak padat.
Media ini dipakai untuk menumbuhkan mikroba yang banyak memerlukan air dan
hidup dalam lingkungan yang anaerob atau anaerob fakultatif. Media ini juga dipakai
untuk uji motilitas suatu bakteri.
c. Media padat : Media cair yang ditambahkan dengan agar-agar sehingga menjadi padat.
Contoh : Nutrient Agar (NA), Potato Dextrose Agar (PDA), dll.

1.2.3. Menurut kegunaanya, Media digolongkan menjadi:

Petunjuk Praktikum Mikrobiologi

5
 Oleh: I N. Sujaya

a. Media umum: Media yang digunakan untuk menumbuhkan satu atau lebih kelompok
mikroba secara umum. Contoh : Nutrient Agar (media untuk menumbuhkan kelompok
bakteri, Potato Dextrose Agar (media yang dipakai untuk menumbuhkan kelompok
jamur, dll.
b. Media pengaya: Media yang dipakai untuk menyuburkan mikroba tertentu sebelum
ditumbuhkan pada media yang dipakai dalam penelitian. Contoh: Selenit Broth (untuk
menyuburkan pertumbuhan bakteri Salmonella.
c. Media selektif: Media yang dipakai untuk menumbuhkan species tertentu dari
mikroba, dengan menghambat pertumbuhan species lain yang tidak dikehendaki.
Contoh: Media SS Agar(Salmonella dan Shigella Agar) untuk bakteri Salmonella dan
Shigella.
d. Media penghitungan : Media yang dipakai untuk menghitung jumlah mikroba suatu
bahan. Media ini dapat berupa media media umum dan media selektif.

1.3. Pembuatan Media

Dalam praktikum ini, saudara akan membuat beberapa macam media, yaitu media
Nutrient Agar, Malt extract, Lactose Broth, Brilliant Green 2 % Bile Broth, dan media
Endo Agar. Semua media tersebut merupakan media sintetik yang banyak dijual dalam
bentuk instant, sehingga dalam pembuatannya, saudara cukup memperhatikan petunjuk
yang tertera pada setiap media.

1.3.1. Cara pembuatan Nutrient Agar.

Untuk membuat 1 liter medium ini, lakukanlah prosedur berikut ini :
a. Timbang sebanyak 23,5 gram medium instant.
b. Suspensikan dalam akuadest dan volume akhir dibuat 1000 ml.
c. Panaskan suspensi ini sampai agar-agar menjadi matang.
d. Masukkan ke dalam tabung reaksi ( 5ml untuk media miring, dan  10 ml untuk
media tegak).
e. Sterilkan dengan autoclave pada temperatur 121 oC dan tekanan 15 lbs. Selama 15
menit.
f. Simpan pada tempat yang dingin dan kering (dalam kulkas).

1.3.2. Pembuatan Malt Extrak

Untuk membuat 1 liter medium ini, lakukan kangkah-langkah berikut :
a. Timbang sebanyak gram media instant.
b. Suspensikan dalam akuadest sampai volume akhir menjadi 1000 ml.
c. Masukkan ke dalam tabung reaksi (kurang lebih 7 ml tiap tabung)
d. sterilkan dengan autoclave pada suhu 121 oC dan tekanan 15 lbs, selama 15 menit.

1.3.3. Pembuatan medium Lactose Broth

Dalam praktikum ini akan dibuat medium lactose broth dengan dua konsentrasi (single
strength dan double strength). Untuk membuat satu liter single strength lactose broth,
lakukanlah prosedur berikut ini :
a. Timbang sebanyak 13 gram medium lactose broth instant.
b. Suspensikan dalam akuades sampai volume akhir mencapai 1000 ml.
c. Masukkan ke dalam tabung reaksi yang telah dilengkapi dengan tabung Durham.
Petunjuk Praktikum Mikrobiologi
6
 Oleh: I N. Sujaya

d. Sterilkan dengan autoclave pada suhu 121 oC pada tekanan 15 lbs selama 15 menit.
e. Simpan pada tempat yang sejuk dan kering (dalam kulkas).
f. Prosedur yang sama dikerjakan untuk membuat double strength lactose broth, tapi
konsentrasinya dilipat duakan.
g.
1.3.3. Pembuatan medium BGBB (Brilliant Green Bile 2 % Broth)
Untuk membuat satu liter medium ini, lakukan prosedur berikut ini :
a. Timbang sebanyak gram medium instant.
b. Suspensikan dalam akuadest dan volume akhir dibuat menjadi 1000 ml.
c. Masukkan ke dalam tabung reaksi kecil yang telah dilengkapi dengan tabung Durham.
d. Sterilkan dengan autoclave pada temperatur 121 oC pada tekanan 15 lbs, selama 15
menit.
e. Simpan di tempat yang sejuk dan kering.

1.3.4. Pembuatan medium Endo Agar

Untuk membuat 1 liter medium ini, lakukanlah prosedur berikut:
a. Timbang sebanyak gram medium instant.
b. Suspensikan dalam akuades dan buat volume akhir menjadi 1000 ml.
c. Panaskan sampai semua komponen larut.
d. Sterilkan dengan autoclave pada suhu 121 oC pada tekanan 15 lbs, selama 15 menit.
e. Simpan ditempat yang sejuk dan kering (dalam kulkas).

1.3.5. Pembuatan medium Palte Count Agar

Untuk membuat 1 liter medium ini, lakukanlah prosedur berikut:

a. Timbang sebanyak 23,5 gram medium instant PCA, Pronadisa).
Catatan :
Merk yang berbeda mempunyai kompisisi yang berbeda sehingga berat gram / lt
mungkin berbeda. Sehingga, perhatikan panduan yang tertulis pada kemasan/botol
media yang diupergunakan.
b. Suspensikan dalam akuades dan buat volume akhir menjadi 1000 ml.
c. Panaskan sampai semua komponen larut (langkah ini bisa tdak dilakukan apabila tidak
mempersiapkan agar tega/agar mirin dalam tabung reaksi).
d. Sterilkan dengan autoclave pada suhu 121 oC pada tekanan 15 lbs, selama 15 menit.
e. Media bisa dituang ke dalam cawan petri yang sudah di autovlave (lihat gambar di
bawah).
Untuk satu cawanpetri diameter 9,9mm, ketebalan 1,5 cm, maka volume agar yang
diperkukan sebanyak 17,5-20 ml untuk ketebalan media agar yang baik.
Agar di tulang ke dalam cawan petri pada kondisi suhu media + 65-75oC. Pada suhu di
bawah itu agar akan memberku.
f. Biarkan agar dalam cawan petri membeku, tutup cawan di buka sampai agar
memebrku (20-30 menit dalam laminar flow).
g. Simpan ditempat yang sejuk dan kering (dalam kulkas) dalam keadaan dibungkus
kantong plastik dan agar diletakkan terbalik (bagian tutup cawan petri di bawah dan
agar di atas).

Petunjuk Praktikum Mikrobiologi

7
 Oleh: I N. Sujaya

Media umumnya dibuat dalam bentuk media agar (agar plate) yang mana media
dituangkan dalam cawan petri, media agar miring/agar tegak yang disiapkan dalam
tabung reaksi umunya digunakan untuk menyimpan kultur. Kultur aerob biasanya
disimpan dalam agar miring, semantara kultur anaerob umumnya disimpan dalam agar
tusuk (stab) pada media tegak.
B. Agar tegak C. Agar miring

A. Media agar

Gambar 1-1. Menyiapkan media agar yang telah disterilkan di tuang ke dalam cawan petri. (A).
Perhatikan bahwa mulut erlenmeyer harus dibakar pada api bunsen terlebih dahulu. Pada media
tegak dan miring, tutup kapas harus dibuat dalam keadaan padat dan ketat sehingga tidak mudah
lepas.

Petunjuk Praktikum Mikrobiologi

8
 Oleh: I N. Sujaya

PRAKTIKUM
MORFOLOGI SEL BAKTERI 2
2.1. Pendahuluan.
Walaupun ada ratusan species bakteria yang berbeda, namun suatu bakteria dalam bentuk
sel tunggal akan memiliki salah satu dari tiga bentuk yang umum dikenal, yaitu:
a. Bentuk bulat/elips/spherical shape yang lazim disebut dengan coccus.
b. Bentuk batang yang umum disebut basil.
c. Bentuk spiral.

Bakteri berbentuk bulat atau coccus, sering menunjukkan variasi bentuk. Variasi bentuk
ini sering dipakai sebagai ciri yang khas dalam proses identifikasi jenis. Beberapa variasi
bentuk tersebut antara lain:
a. Diplococcus: Dua buah sel saling bedempetan atau berpasangan.
b. Streptococcus: Untaian sel yang lebih dari 4 sel dan membentuk suatu untaian yang
menyerupai rantai.
c. Tetrad atau tetracoccus: Empat buah sel yang saling berdempetan yang membentuk
suatu bentuk yang menyerupai bujur sangkar.
d. Staphylococcus: Kumpulan sel yang saling bedempetan, sehingga menyerupai buah
anggur.
e. Sarcina: Kelompok yang terdiri atas 8 sel (4 sel pada bagian depan dan 4 sel pada
bagian belakang) yang membentuk suatu bentuk yang menyerupai kubus.

Berbeda dengan bakteri bentuk bulat, bakteri bentuk batang (basil) jarang sekali
berada dalam variasi diatas. Pada bakteri bentuk batang ini, variasi diatas (jarang)
bukan merupakan karakteristik dari bakteri ini. Bila dialam dijumpai adanya variasi
bentuk dari bakteri basil ini, maka hal tersebut cenderung disebabkan oleh tahap
pertumbuhannya atau kondisi-kondisi yang mempengaruhi kultur tersebut.
Bakteri berbentuk spiral pada umumnya dijumpai dalam bentuk soliter atau bersel
tunggal dan bukan merupakan kumpulan sel yang berdempetan.
Dalam praktikum ini saudara akan diperkenalkan beberapa species bakteri yang
mewakili bentuk bentuk diatas. Disamping itu juga akan diperkenalkan beberapa struktur
luar dan struktur dalam bakteri, seperti flagella, capsula, dan endospora, sebagai
pelengkap morfologi bakteri tersebut.

2.2 Alat dan Bahan yang diperlukan

a. Mikroskop cahaya.
b. Minyak emersi
c. Objek glass dan alat fiksasi
d. Kultur bakteri (sebaiknya yang masih muda).
Petunjuk Praktikum Mikrobiologi
9
 Oleh: I N. Sujaya

e. Jarum ose (loop)

f. Burner (bunsen)

2.3. Cara Kerja

a. Amatilah bentuk-bentuk sel bakteri yang disediakan oleh asisten dan pembimbing
praktikum saudara, dengan menggunakan mikroskop cahaya dan mulai dengan
perbesaran lemah.
b. Bila pengamatan kurang jelas, lakukan pengamatan dengan lensa objektive yang
berkekuatan 100 x. (Ingat : pakailah minyak emersi pada perbesaran 100 x ini).
c. Gambarlah bentuk-bentuk bakteri beserta variasinya pada buku journal saudara.
d. Bersihkan minyak emersi pada lensa yang saudara pakai dengan menggunakan larutan
xylol (Ingat : hati-hati bekerja dengan xylol ini, karena bersifat karsinogenik/penyebab
terjadinya kanker).

Gambar 2-1 A. Kocok kultur cair dan ambil satu Gambar 2-1B. Sebarkan di atas glas objek dan
mata loop yang sebelumnya dipanaskan di atas lakukan pengamatan di bawah mikroskop
api

Gambar 2-1 C. Bentuk sel bakteri

Petunjuk Praktikum Mikrobiologi

10
 Oleh: I N. Sujaya

PRAKTIKUM
STERILISASI 3
3.1. Pendahuluan
Sterilisasi merupakan suatu proses membebaskan peralatan atau bahan dari
mikroorganisme yang tidak dikehendaki. Untuk mencapai tujuan ini, ada beberapa
macam sterilisasi yang dapat dipilih dan disesuaikan dengan sifat bahan yang akan
disterilkan. Cara-cara yang umum dilakukan adalah:
a. Sterilisasi secara fisik : sterilisasi dengan menggunakan pemanasan, penggunaan sinar
UV, sinar X dan sinar-sinar yang panjang gelombangnya pendek.
b. Sterilisasi secara kimia : sterilisasi dengan menggunakan bahan-bahan kimia, seperti
alkohol, desinfektan, larutan formalin, dll.
c. Sterilisasi mekanik : sterilisasi dengan menggunakan filter atau saringan.

3.2. Sterilisasi dengan pemanasan

a. Pemanasan dengan udara kering atau udara basah
Cara ini sangat cocok untuk mensterilkan alat-alat atau bahan-bahan yang tahan panas.
Dalam cara ini, temperatur yang dipakai adalah 170 oC dan dilakukan selama 1 jam.
b. Tindalisasi
Cara ini dipakai untuk mensterilkan bahan-bahan yang tidak tahan suhu tinggi. Dalam
cara ini, bahan dan alat dipanaskan selama 30 menit pada suhu 100 oC, dan diulang
sebanyak 3 kali berturut-turut, dengan selang waktu 1 hari. Bahan dan alat disimpan
pada suhu kamar pada saat tidak dipanaskan.
c. Pasteurisasi
Cara ini dipakai untuk mensterilkan bahan makanan yang akan mengalami denaturasi
pada suhu tinggi. Dengan cara ini, alat dan bahan dipanaskan pada suhu 60 - 80 oC
selama satu jam sebanyak 3 kali berturut-turut, dengan selang waktu 1 hari.
d. Sterilisasi dengan nyala api langsung.
Cara ini sangat cocok untuk mensterilkan jarum inokulasi.
e. Sterilisasi dengan uap panas yang bertekanan
Cara ini umum dipakai untuk mensterilkan alat dan bahan yang tahan panas tinggi dan
tekanan. Alat yang dipakai adalah autoclave yang dapat mencapai suhu 121 oC dan
tekanan 15 lbs.

Cara memakai AUTOCLAVE.

a. Isi autoclave dengan air sebanyak 3-5 liter.
b. Siapkan alat atau bahan yang akan disterilkan pada bagian rak autoclave.
c. Masukkan alat dan bahan yang ada di dalam rak tersebut ke dalam bejana autoclave,
dan tutup dengan rapat (kecuali klep udara).

Petunjuk Praktikum Mikrobiologi

11
 Oleh: I N. Sujaya

d. Panaskan autoclave ini dan biarkan semua udara yang ada di dalamnya keluar (yang
ditandai dengan keluarnya tetes-tetes air melalui lkep udara.
e. Tutup klep udara bila semua udara dalam autoclave sudah keluar.
f. Pemanasan dilanjutkan sampai mencapai suhu 121 oC dan tekanan 15 lbs, selama 15
menit.
g. Pemanasan dihentikan, suhu dikembalikan ke suhu kamar dan tekanan pada titik 0.
h. JANGAN PERNAH MENCOBA UNTUK MEMBUKA AUTOCLAVE SEBELUM
JARUM PENUNJUK TEKANAN MENUNJUKAN PADA ANGKA 0 (NOL),
KARENA SANGAT BERBAHAYA!!!!!!!.

Meter tekanan Tempat

uap dan suhu pembuangan uap

Klep pengunci

Gambar 3-1. Autoclave manual

Catatan : Bila di dalam autoclave terdapat :

a. 100 % uap air murni, maka suhu yang dicapai adalah 121 oC dan tekanan 15 lbs.
b. 2/3 bagian uap air dan 1/3 udara, maka suhu dan tekanan yang dicapai adalah 115 oC
dan 15 lbs.
c. 1/3 bagian uap air dan 2/3 udara, maka suhu dan tekanan yang dicapai adalah 109 oC
dan 15 lbs.
d. 100 % udara, maka suhu dan tekanan yang dicapai adalah 100 oC dan 15 lbs.

3.2. Sterilisasi dnegan radiasi

Dilakukan dengan menggunakan cahaya gelombang pendek, seperti UV atau sinar
Co 60 atau Cs 69. Dalam praktikum ini akan dilakukan sterilisasi medium padat dengan
menggunakan sinar UV.

Petunjuk Praktikum Mikrobiologi

12
 Oleh: I N. Sujaya

Gambar 3-2. autoclave elektrik

Dalam melakukan autoclaving menggunakan autoclave ini lakukan sebarai berikut :

1. Isi chamber dengan air sampai permukaan atas air sedikit di atas permukaan
kerajang.
2. Masukkan bahan dan alat ke dalam kerajang di dalam autoalve dnegan memutar
(full) handle 1.
3. Hidupkan mesin dnegan menekan power on.
4. Tutup rapat autoclave
5. Atur meter suhu (4) untuk menetukan susu autoclave (panel 4)
Petunjuk Praktikum Mikrobiologi
13
 Oleh: I N. Sujaya

6. Atur lama waktu aucocklave (panel 5)

7. Tutup rapat pengeluaran uap panel 2)
8. Tekan star (panel 8)
Auclaving akan berjalan secara otomati, dan lampu pada panel lama waktu
autoclaving akan menyala menunjukkan proses autoclaving (panel 7).
Apabila proses autoclaving telah selesai, maka akan mterdengar bunyi
“Ti..Ti.....Ti....”.

Setelah selesai proses autoclaving maka lakukan sebagai berikut:

1. Tekan stop (panel 9)

2. Buka keran pengeluaran uap (panel 2) sampai uap semuanya keluar
3. Pastikan tekanan di dalam mesin ‘NOL” (lihat panel 3).
4. Setelah tenaklan NOL baru mesin autoclave bisa di buka dan bahan/alat yang
diosterilkan dikeluarkan dan di aruh ditempat yang berseih.
5. Matikan power mesin autoclave.

A. Sterilisasi dengan UV
Alat dan bahan
a. Cawan petri
b. Medium Agar tegak.
c. Lampu UV
d. Lampu Bunsen

Cara kerja
a. Cairkan 3 tabung medium Agar tegak dalam penangas air.
b. Tuangkan ke dalam 3 cawan petri steril dan biarkan membeku.
c. Sinari cawan petri pertama dengan UV selama 1 menit, cawan kedua selama 3 menit,
dan cawan ketiga tidak disinari (dalam keadaan terbuka).
d. Inkubasi cawan petri selama 24 - 48 jam pada suhu 37 oC, dalam keadaan terbalik.
e. Amati pertumbuhan mikroba pada ketiga cawan petri tersebut.

3.3. Sterilisasi dengan zat kimia

Zat-zat kimia seperti alkohol, formalin, karbol, lisol, sabun, dan lain-lain dapat dipakai
untuk mensterilkan alat-alat. Pada praktikum ini akan dilakukan sterilisasi dengan
menggunakan beberapa zat kimia.
A. Sterilisasi dengan alkohol
Alat dan bahan
a. Cawan petri steril
b. Medium NA tegak
c. Jarum pentul/Paku kecil.
d. Alkohol dengan konsentrasi 40 %, 70 %, dan 96 %
e. Air steril
Petunjuk Praktikum Mikrobiologi
14
 Oleh: I N. Sujaya

f. Pinset

Cara kerja
a. Cairkan medium NA dalam penangas air dan tuangkan kedalam cawan petri. Biarkan
membeku pada suku kamar.
b. Rendam jarum pentul atau paku dalam larutan alkohol diatas selama 10 menit.
c. Cuci jarum pentul dengan air steril dan letakkan pada permukaan medium dalam
cawan petri.
d. Inkubasi pada suhu 28 - 30 oC selama 24-48 jam.
e. Bandingkan pertumbuhan mikroba pada sekitar jarum pentul. Larutan mana yang
paling efektif.
f. Lakukan hal yang sama dengan menggunakan formalin 4 %, lisol dan karbol.

B. Sterilisasi dengan sabun

Alat dan bahan
a. Cawan petri steril
b. Medium NA tegak
c. Sabun dengan berbagai Merek dagang.

Cara kerja
a. Cairkan 2 tabung medium NA tegak dalam penangas air dan tuangkan ke dalam dua
cawan petri steril
b. Apuskan jari tangan saudara yang belum dicuci pada permukaan medium pada cawan
petri pertama.
c. Cuci jari tangan saudara dengan sabun merk tertentu sebersih mungkin dan biarkan
kering dengan sendirinya (jangan di keringkan dengan lap). Setelah kering, apuskan
jari saudara pada permukaan medium dalam cawan petri kedua.
d. Inkubasi kedua cawan petri tersebut selama 24-48 jam pada suhu 28-30 oC.
e. Bandingkan pertumbuhan mikroba pada kedua cawan petri tersebut.

3.4. Sterilisasi dengan membrane filter

Bahan-bahan yang tidak boleh dipanaskan, seperti serum dan beberapa macam gula
tertentu dapat disterilkan dengan menggunakan membran filter. Dalam bidang
mikrobiologi, alat penyaring yang paling banyak dipergunakan adalah filter berkerfield,
filter chamberland, filter seilz, dll. Filter-filter ini terbuat dari polimer khusus dengan
diameter 0,45 mikron, sehingga dapat menahan bakteri yang terkandung dalam sample.
Dalam praktikum ini saudara akan menggunakan membran yang terbuat dari polisulfon,
yang diproduksi oleh Millipore.
Alat dan bahan
a. Polisulfon membran dengan diameter 0,22 mikron (hidrofilik)
b. Satu set alat percobaan membran lengkap dengan regulator gas.
c. Cawan petri
d. Botol McCartney
e. Gun pipet lengkap dengan tipsnya
f. Medium NA tegak
g. Air tercemar
Petunjuk Praktikum Mikrobiologi
15
 Oleh: I N. Sujaya

Cara kerja
a. Cairkan medium NA dalam penangas air dan biarkan pada temperatur 40 oC.
b. Saringlah sejulah air yang sudah tercemar (air kali) dengan menggunakan membran
polisulfon.
c. Pipet sebanyak 1 ml. Air hasil saringan ini dan tempatkan ke dalam cawan petri
d. Sebagai kontrol, pipet 1 ml air yang belum disaring dan tempatkan pada cawan petri
kedua.
e. Tuangkan masing-masing satu tabung medium NA (suhu 40 oC) ke dalam masing-
masing cawan petri yang sudah berisi sampel air.
f. Goyang kedua cawan sedemikian rupa sehingga sampel menjadi homogen dengan
medium, dan biarkan membeku.
g. Inkubasi kedua cawan petri tersebut pada suhu 20-30 oC selama 24-48 jam.
h. Amati kedua cawan petri !!. Kesimpulan apa yang dapat anda ambil dari percobaan ini
?

Petunjuk Praktikum Mikrobiologi

16
 Oleh: I N. Sujaya

PRAKTIKUM
ENUMERASI DAN ISOLASI 4
Perhitungan jumlah mikroba (enumerasi) yang terkandung di dalam sampel dapat
dilakukan dengan berbagai cara, antara lain: metode pengenceran, metoda perhitungan
langsung dalam ruang hitung (hemasitometer), Metode membran filter, metode berat
kering dan volume sel, metode MPN, dll. Pada praktikum ini, saudara akan belajar
menentukan jumlah sel yang terdapat dalam suatu sample dengan menggunakan metoda
pengenceran dan metoda penghitungan langsung dengan menggunakan alat
haemasitometer (Improved New Bauwer).

4.1 Metoda pengenceran

Metoda pengenceran ini menggunakan suatu seri pengenceran dari sampel yang
kemudian ditanam pada medium. Setelah diinkubasi, koloni yang tumbuh dapat dihitung
dengan asumsi bahwa satu koloni yang tumbuh berasal dari satu sel. Dengan demikian,
maka jumlah sel pada sample asal dapat dihitung dengan cara mengalikan jumlah koloni
yang tumbuh dengan faktor pengencernya. Pengenceran biasanya dinyatakan dengan
pangkat negatif, misalnya 10-5 untuk pengenceran 1 : 100.000. Dengan menggunakan
metoda ini kita dapat menghitung jumlah total mikroba yang terdapat dalam sample air
atau sample tanah.

Alat dan bahan

a. Sampel air da tanah
b. media NA
c. Botol steril
d. Cawan petri
e. Air steril dalam tabung reaksi
f. Pipet ukur

Cara kerja
a. Ambil sampel air secara aseptik dengan menggunakan botol steril.
b. Cairkan medium NA dalam penangas air dan dinginkan sampai suhu 45 oC.
c. Tandai 6 cawan petri dengan 10-1, 10-2,…10-6.
d. Kocok sampel air sampai homogen dan ambil secara aseptik sebanyak 1 ml, kemudian
dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang telah berisi 9 ml air steril untuk mendapatkan
faktor pengenceran sebesar 10 kali (10-1).
e. Kocok tabung reaksi ini dengan baik, dan ambil air di dalamnya secara aseptik
sebanyak 1 ml, dan masukkan ke dalam cawan petri yang bertanda 10-1. Dari tabung
ini juga, ambil sebanyak 1 ml sampel dan masukkan ke dalam tabung reaksi kedua
yang telah berisi 9 ml air steril untuk memperoleh faktor pengenceran sebesar 100 kali
(10-2).
Petunjuk Praktikum Mikrobiologi
17
 Oleh: I N. Sujaya

f. Tuangkan medium NA ke dalam cawan petri yang bertanda 10-1 yang telah berisi 1 ml
air sampel, lalu digoyang sampai homogen.
g. Ambil sebanyak 1 ml sampel dari tabung reaksi kedua dan masukkan kedalam cawan
petri kedua (10-2). Dari tabung ini juga, ambil 1 ml sampel dan masukkan ke dalam
tabung reaksi ketiga yang telah berisi 9 ml. air steril untuk memperoleh faktor
pengenceran sebesar 1000 kali (10-3).
h. Ulangi pekerjaan ini sampai pada faktor pengenceran 1.000.000 kali (10-6).
i. Untuk menghitung total mikroba dalam sampel tanah, prosedur yang dipakai persis
sama dengan diatas, tetapi banyaknya sample yang harus ditimbang adalah 1 gram
sample padat atau 1 ml sample cair (Perhatikan lampiran !!!!).
j. Inkubasi semua cawan yang telah ditanami dengan sample yang berisi mikroba pada
temperature 25 oC selama 1 – 7 hari.
k. Lakukan penghitungan koloni yang tumbuh pada semua cawan Petri yang jumlah
koloninya berkisar antara 30 – 300 koloni.
l. Jumlah sel mikroba yang terdapat pada sample dihitung dengan cara mengalikan
jumlah koloni yang tumbuh pada medium dengan factor pengenceran.

Petunjuk Praktikum Mikrobiologi

18
 Oleh: I N. Sujaya

Metode pengencera

1 ml 1 ml 1 ml 1 ml

Contoh 9 ml 9 ml 9 ml 9 ml
bahan cair (10-1) (10-2) (10-3) (10-4)

Gambar 4-1. Cara menyebarkan (spreading) sample di cawan petri

4.2 Penghitungan total mikroba secara langsung dengan mikroskop

Keunggulan metoda ini adalah dapat menghitung total sel, baik yang masih hidup
maupun yang telah mati. Disamping itu, waktu yang diperlukan jauh lebih singkat. Salah
satu cara yang umum dilakukan adalah perhitungan langsung dibawah mikroskop dimana
volume tertentu dari suatu suspensisampel disebarkan pada suatu area pada kaca objek.
Dengan menghitung jumlah mikroba pada luas tertentu yang diketahui dan
mengalikannya dengan faktor tertentu, maka bisa dihitung jumlah mikroba yang terdapat
dalam sample asal. Pada perhitungan langsung ini kita dapat menggunakan ruang hitung
(counting chamber), seperti haemacytometer dengan kedalaman 0,1 mm.

Petunjuk Praktikum Mikrobiologi

19
 Oleh: I N. Sujaya

Alat dan bahan

a. Suspensi yeast
b. haemacytometer
c. mikroskop

Cara kerja
a. Tutup ruang hitung dengan kaca penutup, dan ambil suspensi yeast dengan pipet halus.
b. Teteskan suspensi ini pada pinggir kaca penutup, sehingga suspensi ini akan mengalir
kebawah kaca penutup dan mengisi ruang hitung.
c. Amati dibawah mikroskop dan hitung jumlah sel di dalam 5 kotak besar (dengan
masing masing kotak terdiri atas 16 kotak kecil).
d. Tentukan jumlah sel/ml sampel dengan menggunakan rumus berikut :

X = n x 25 x 10 x 103, dimana n adalah rata-rata sel yang terhitung pada setiap kotak

Catatan:
Luas 25 kotak besar pada alat hemasitometer adalah 1 mm2
Kedalaman ruang hitung adalah 0.1 mm
Jumlah sel per mm3 dalam alat hitung tersebut adalah n x 25 x 10, dimana n adalah rata-
rata jumlah sel dalam setiap kotak dari 25 kotak yang terdapat pada ruang hitung.
Bila sample diencerkan sebelum dilakukan penghitungan, maka fator pengenceran ini
juga harus diperhitungkan. Sebagai contoh, bila sample diencerkan sebesar 10-2 atau 100
kali, maka hasil yang diperoleh dari rumus diatas harus dikalikan dengan 102 atau 100.

Petunjuk Praktikum Mikrobiologi

20
 Oleh: I N. Sujaya

PRAKTIKUM
BIAKAN MURNI 5
5.1. Pendahuluan
Untuk memepelajari karakteristik mikrooragnisme, langkah awal yang harus dilakukan
adalah mengisolasi mikrooragnisme dari sumbernya. Salah satu cara mengisolasi
mikroorganisme dari campuran mikroorganisme adalahd neagn teknik penggoresan
(streak plate techniques) (Gambar..). Atau mikrooragnisme bisa pula diisolasi dari media
agar yang sudah disebar setelah melakukan penghitungan jumlah mikroorganisme
menggunakan agar tuang. Dalam melakukan isolasi, diperlukan suatu teknik aseptik
sehingga mikrooragnisme yang kita dapatkna tidak tercemar (kontaminsa) olehg
mikroorganisme lainnya. Dan untuk langkah ini dfalam teknik dasar mikroobiologi
biasanya dilakukan dnegan pemurnian isolat dengan beberapa kali penggoresan yang
berulang (re-streaking) dengan cara yang sama seperti di bawah ini.

5.2. Isolasi mikroba

Alat dan bahan
a. Cawan petri
b. Medium NA
c. Medium NA miring

Cara kerja
a. Cairkan media NA tegak dalam penangas air dan tuangkan ke dalam cawan petri steril.
b. Setelah beku, pilihlah koloni-koloni yang tumbuh pada cawan hitung dalam
enumerasi, yang menurut saudara menarik. Lakukan “streak for single colony” pada
media steril dalam cawan petri yang telah beku.
c. Inkubasi selama 24 jam.
d. Isolasi koloni yang tumbuh dan tanam pada medium agar miring. Biakan ini akan
dipakai pada praktikum selanjutnya.

Petunjuk Praktikum Mikrobiologi

21
 Oleh: I N. Sujaya

Gambar 5-B. Ambil koloni Gambar 5-C. Lakukan penggoresan.

tunggal. Setiap memulai goresan baru, jarum
ose harus dipanaskan.

Gambar 5-A. Pilih koloni

yang mudah diambil
secara random dari cawan
Petri.

Petunjuk Praktikum Mikrobiologi

22
 Oleh: I N. Sujaya

PRAKTIKUM
PEWARNAAN SEL BAKTERI 6
6.1. Pendahuluan
Pengenalan bentuk mikroba (morfologi), kecuali mikroalgae harus dilakukan pewarnaan
terlebih dahulu agar dapat diamati dengan jelas. Tujuan pewarnaan adalah:
1. Mempermudah pengamatan bentuk sel mikroorganisme (khususnya bakteri).
2. Memperjelas ukuran jasad
3. Dapat mengamati struktur luar dan struktur dalam dari sel mikroba.
4. Melihat reaksi jasad terhadap pewarna yang diberikan, sehingga sifat fisik, kimia dari
jasad dapat diketahui. Dengan demikian, kita dapat menggunakan pewarnaan sebagai
salah satu cara untuk klasifikasi bakteria. Berhasil atau tidaknya pewarnaan sangat
ditentukan oleh waktu pemberian warna dan umur biakan yang diwarnai (Umur biakan
yang baik adalah 24 jam).

6.2 Berbagai macam metoda pewarnaan

6.2.1 Pewarnaan langsung dengan pewarna basa
Umumnya zat pewarna merupakan garam-garam yang dibangun oleh ion-ion yang
bermuatan positif atau negatif, dimana salah satu ion-ion tersebut berwarna. Kalau suatu
sel bakteri yang dinding selnya bermuatan relatif negatif bersatu dengan ion yang
bermuatan positif dari suatu pewarna, maka menyebabkan sel bakteri tersebut terwarnai.
Zat pewarna dapat dikelompokkan menjadi dua group, yaitu zat pewarna yang
bersifat basa dan zat pewarna yang bersifat asam. Kalau ion positif dari zat pewarna yang
mengandung warna tersebut, maka pewarna tersebut adalah pewarna basa. Dan bila warna
tersebut berada pada ion yang bermuatan negatif, maka pewarna tersebut adalah pewarna
asam.
Alat dan bahan
a. Kultur bakteri yang diiolasi dalam praktikum sebelumnya dan beberapa biakan murni.
b. Pewarna Metilene blue
c. Pewarna kristal violet.
d. Karbol fuhsin
e. Kaca objek bersih dan kaca penutup.

Cara kerja.
a. Letakkan sebuah kaca objek yang bebas lemak diatas meja kerja.
b. Teteskan setetes air ditengah-tengah kaca objek tersebut.
c. Dengan menggunakan jarum Ose yang telah dipijarkan, ambil sedikit biakan bakteri
yang saudara isolasi pada praktikum sebelumnya atau dari biakan murni bakteri yang
disediakan oleh asisten saudara.

Petunjuk Praktikum Mikrobiologi

23
 Oleh: I N. Sujaya

d. Buat apusan bakteri pada air yang diletakkan pada kaca objek dengan cara menggesek-
gesekan jarum ose yang berisi biakan bakteri, sehingga didapatkan suatu campuran
yang tipis dan merata.
e. Fiksasi diatas api bunsen dengan jarak sekitar 30 Cm. Dari nyala api. Dalam
memfiksasi ini jangan terlalu panas karena dapat merusak bentuk sel.
f. Teteskan salah satu larutan pewarna yang disediakan oleh asisten pada sediaan yang
telah difiksasi. Pewarna Metilene blu akan mewarnai sel dalam 30 - 60 detik, Kristak
violet dalam 10 detik, dan Karbol fuhsin dalam 5 detik.
g. Cuci dengan air mengalir.
h. Keringkan sediaan dengan meletakkannya diantara kertas saring.
i. Amati dengan mikroskop dengan menggunakan lensa objektive dengan perbesaran 100
kali, dan minyak imersi.
j. Catat dan gambar bentuk sel dan warna sel mikroorganisme yang saudara lihat.

Pertanyaan :
1. Apakah kultur yang saudara isolasi merupakan kultur murni, mengapa ?
2. Apa maksud memfiksasi sediaan ?.

6.2.2. Pewarnaan negatif atau pewarnaan tak langsung

Salah satu pewarna asam adalah nigrosin atau tinta cina. Karena daya mewarnai pada zat
ini berada pada ion negatif dan tidak bereaksi dengan ion negatif lainnya dari sel bakteri,
maka pewarna ini tidak mewarnai sel. Dalam hal ini, yang terwarnai adalah lingkungan
sekitar sel. Dengan cara ini saudara sudah dapat mengamati bentuk-bentuk sel bakteri dan
juga ukurannya dengan jelas.

Alat dan bahan

a. Kultur bakteri hasil isolasi atau kultur yang disediakan oleh asisten.
b. Cairan nigrosin atau tinta cina
c. Kaca objek bebas lemak.

Cara kerja
a. Teteskan sati tetes cairan nigosin atau tinta cina pada pinggir ujung kaca objek.
b. Dengan menggunakan jarum Ose yang telah dipijarkan, ambil sedikit biakan bakteri
dan suspensikan pada tetesan nigrosin pada permukaan kaca objek.
c. Ratakan suspensi bakteri dalam nigrosin pada permukaan kaca objek ini dengan
menggunakan kaca objek lain.
d. Biarkan kering pada suhu kamar, dan amati dengan mikroskop (perbesaran lensa
objektif 100 x), dan pakai minyak imersi.
e. Gambar bentuk bakteri yang saudara lihat.

Cara-cara pewarnaan berikut merupakan teknik pewarnaan diferensial, sebagai

salah satu cara dalam mengklasifikasi bakteri.

6.2.3. Pewarnaan Gram

Pewarnaan Gram merupakan pewarnaan yang sangat umum dalam bidang
bakteriologi. Dengan pewarnaan ini, kelompok bakteri dapat dibedakan menjadi dua,
Petunjuk Praktikum Mikrobiologi
24
 Oleh: I N. Sujaya

yaitu kelompok bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif . Ada banyak modifikasi
dari teknik pewarnaan ini, namun semua teknik tersebut berdasarkan pada prinsip yang
sama, yaitu :
1. Mewarnai mikroorganisme dengan pewarna dasar, yaitu dengan kristal violet atau
gentian violet.
2. Fiksasi warna, yaitu untuk menguatkan perlekatan warna dasar, misalnya dilakukan
dengan garam iodin (modifikasi larutan lugol).
3. Pencucian atau penghapusan warna dasar dengan alkohol, aseton, atau campuran
alkohol dengan aseton.
4. Pewarnaan kembali dengan pewarna pembanding atau kontras yang berbeda dengan
pewarna dasar, yaitu untuk mewarnai sel-sel yang telah hilang warnanya oleh
penghapusan warna. Misalnya dalam hal ini dipakai safranin atau karbol fuhsin..

Bakeri yang setelah diwarnai dengan pewarna dasar warnanya tidak terhapus oleh
alkohol akan berwarna violet karena terwarnai oleh kristal violet, dan tidak lagi menyerap
pewarna kontras. Kelompok bakteri yang mempunyai sifat ini dikelompokkan menjadi
bakteri Gram positif. Sedangkan, kelompok bakteri yang telah diwarnai dengan pewarna
dasar dan warnanya terhapus setelah diperlakukan dengan alkohol, akan menyerap
pewarna safranin atau karbol fuhsin yang dipakai sebagai pewarna kontras, sehingga
dalam preparat akan terlihat warna merah(warna safranin atau karbol fuhsin). Kelompok
bakteri yang demikian disebut dengan bakteri Gram negatif.

Alat dan bahan

a. Kultur muda bakteri yang diisolasi atau yang disediakan oleh asisten.
b. Larutan kristal violet
c. Larutan garam iodin.
d. Alkohol 95 %.
e. Larutan safranin
f. Kaca objek

Cara kerja
a. Buat apusabn bakteri pada kaca objek kering dan bersih.
b. Fiksasi diatas nyala api bunsen atau di udara.
c. Warnai dengan larutan kristal violet selama 1 - 1,5 menit.
d. Cuci dengan air suling.
e. Tetesi dengan larutan garam iodin, dan biarkan selama 1 menit.
f. Cuci dengan larutan alkohol 95 % sampai warnanya terhapus, biasanya selama 0,5
menit (30 detik).
g. Cuci dengan air.
h. Warnai dengan safranin atau karbol fuhsin selama 2 menit.
i. Cuci dengan air, dan buang kelebihan air dengan menggunakan kertas hisap, tanpa
menggosok sediaan.
j. Keringkan diudara atau diatas nyala api bunsen.
k. Amati dibawah mikroskop dengan perbesaran 1000 kali. (ingat pakai minyak imersi).
l. Catat pengamatan saudara.

Petunjuk Praktikum Mikrobiologi

25
 Oleh: I N. Sujaya

Gambar 6-1. Zat warna umum yang digunakan dalam pewarnaan Gram

Langkah kerja

Langkah Lama Keterangan

1. Krital violet 60 detil Zat warna utama
2. Cuci dnegan air Cuci sedikit saja
3. Gram lar. Yod 60 detik Sebagai Mordant, membantu zat warna mebentuk kompleks
(Lar Mordan) (terikat kuat) dengan bagian bermuatan dalam didinding sel,
plasma membran dan sitoplasma.
4. Cuci dnegan air Cuci dengan
saksama
5. Alkohol 95% 10 detik Pencuci zat warna, kompleks yod-kristal violet kompleks.
Karena bakteri Gram negatif mempunyai didning sel lebih
tipis dari Gram positif maka kompleks yod-kristal violet
akan tercuci dnegan cepat
6. Cuci dnegan air Cuci dengan
saksama
7. Safranin 60 detik Zat warna sekunder. Fungsi safranin adalah sebagai zat
warna pengkonter dari warna vbakteri Gram, negatif yang
tercuci karena penambahan alkohol. Bakteri Gram positif
hanya sedikit mengikat safranin karena bagian bermuatan
sudah diikat oleh kristal violet.
8. Cuci dnegan air Bilas sebentar
saja
9. Keringkan Dengan tissue
kering

Petunjuk Praktikum Mikrobiologi

26
 Oleh: I N. Sujaya

C
N-asetil muramat

N-asetil muramat

..... peptida pendek

___ jembatan peptida

B
Gambar 6-A: Komponen dinding sel bakteri Gram
positif; (6-B): Gram negatif; 6-C: lapisan
peptidoglikan

6.4.Pewarnan tahan asam

Pewarnaan tahan asam adalah pewarnaan yang dapat mengukur ketahanan sel yang telah
diwarnai terhadap pencucian dengan asam. Ketahan-asaman dari bakteri dan
aktinomicetes tertentu berhubungan dengan banyaknya lapisan lemak. Sebagai pewarna
dasar adalah karbol fuhsin panas, dan pencucinya adalah alkohol asam. Setelah itu,
sediaan diberi warna pembanding. Pewarnaan ini terutama digunakan untuk diagnosa dan
studi penyakit-penyakit yang disebabkan oleh species-species tahan asam seperti
penyebab TBC dan lepra.

Petunjuk Praktikum Mikrobiologi

27
 Oleh: I N. Sujaya

Alat dan bahan

a. Biakan Mycobacterium dan E. coli
b. Larutan karbol fuhsin.
c. Larutan alkohol asam (64 ml HCl dalam 1000 ml larutan ethanol 95 %)
d. Larutan metilen blue.
e. Penangas air dengan platform
f. Kaca objek

Cara kerja
a. Buat apusan dari mycobacterium dan E. coli pada kaca objek dan fiksasi.
b. Tempatkan sediaan pada plat kawat diatas penangas air.
c. Letakkan sepotong kertas isap pada apusan dan basahi dengan pewarna karbol fuhsin,
dan jaga jangan sampai apusan menjadi kering dengan terus memberi pewarna.
Hindari pemberian zar warna berlebih. Lakukan hal ini selama 5 - 10 menit.
d. Cuci dengan air.
e. Cuci dengan alkohol asam selama 10 - 30 detik.
f. Warnai dengan metilen blue selama 30 detik tanpa pemanasan.
g. Cuci dengan air dan keringkan.
h. Amati dengan mikroskop dengan perbesaran 1000 kali. (ingat minyak imersi). Bakteri
yang tahan asam akan berwarna merah dan yang tidak tahan asam akan terwarna biru.

6.4.1. Pewarnaan struktur

Untuk mewarnai bagian-bagian dari sel, maka diperlukan teknik pewarnaan khusus,
antara lain : pewarnaan endospora dan pewarnaan kapsula.
6.4.2. Pewarnaan endospora
Species-species Bacillus dan Clostridium dapat menghasilkan endospora yang
bersifat resistan, yang bisa hidup dalam waktu lama meskipun dalam keadaan lingkungan
yang kurang baik, seperti panas dan adanya zat kimia yang toksik.Endospora tahan
terhadap pewarnaan, dan sekali terwarnai akan tahan cuci. Ada beberapa metoda yang
dapat dipakai untuk mewarnai endospora, yaitu metoda Dorner dan metoda Schaefer dan
Fulton.

A. Metoda Dorner
Alat dan bahan
a. Air suling.
b. Bakteri Bacillus cereus dan Clostridium sporogenes.
c. Karbol fuhsin
d. Nigrosin

Cara kerja
a. Letakkan 5 tetes air suling dalam masing-masing 1 tabung reaksi dan buat suspensi
yang pekat dari B. cereus dan Cl. Sporogenes.
b. Berikan dalam jumlah yang sama karbol fuhsin dalam suspensi-suspensi tersebut.
c. Letakkan dalam penangas air selama 10 menit.
d. Buat pewarnaan nigrosin.
Petunjuk Praktikum Mikrobiologi
28
 Oleh: I N. Sujaya

e. Amati dengan mikroskop dan catat hasilnya.

B. Metoda Schaeffer dan Fulton

Alat dan bahan
a. Biakan B. cereus dan Cl. sporogenes
b. Malakit hijau
c. Larutan safranin.

Cara kerja
a. Buat apusan bakteri B. cereus dan Cl. sporogenes dan fiksasi.
b. Warnai dengan malakit hijau diatas ram kawat diatas penangas air selama 5 menit.
(dilapisi dengan kertas hisap).
c. Cuci dengan air suling.
d. Warnai dengan safranin selama 30 detik.
e. Cuci dengan air dan keringkan.
f. Amati dengan mikroskop, catat dan gambar hasilnya. Endospora akan terwarna hijau
dan bagian lain dari sel akan berwarna merah muda.

6.4.3. Pewarnaan kapsula

Fungsi pewarnaan ini adalah untuk melihat apakah bakteri yang diamati berkapsul atau
tidak.
Alat dan bahan
a. Biakan bakteri Alkaligenes viscous, atau Aerobacter aerogenes pada susu atau agar
b. Asam asetet glacial
c. Karbol fuhsin
d. CuSO4 20 %
e. Larutan kristal violet 1 %
f. Larutan garam fisiologis
g. Gelas tutup

Cara kerja (Metoda Welch)

a. Letakkan 5-6 loop biakan dalam susu pada kaca objek.
b. Tutup dengan asam asetat glacial, dan biarkan tidak lebih dari 10 detik.
c. Cuci dengan menuangkan karbol fuhsin, dan biarkan pewarna mengalir.
d. Cuci karbol fuhsin dengan larutan garam fisiologis ; jangan gunakan air.
e. Tutup dengan kaca penutup, dan amati dengan mikroskop dengan perbesaran 1000 kali
(ingat memakai minyak imersi). Kapsula akan berwarna merah muda dan sel berwarna
merah tua.

Cara kerja (Metoda Anthony)

a. Buat apusan sebagai berikut : Kalau digunakan kultur susu, sebarkan satu loop pada
kaca objek dan biarkan kering. Kalau digunakan kaldu dextrosa, atau kultur agar,
letakkan setetes serum pada kaca objek dan suspensikan kultur ke dalamnya, dan
sebarkan sehingga membentuk lapisan tipis dan biarkan kering diudara.
b. Warnai dengan kristal violet 1 % selama 2 menit dan jangan dipanaskan.
Petunjuk Praktikum Mikrobiologi
29
 Oleh: I N. Sujaya

c. Cuci dengan larutan CuSO4 20 %.

d. Keringkan dan amati dengan mikroskop dengan perbesaran 1000 kali dengan minyak
imersi.

Petunjuk Praktikum Mikrobiologi

30
 Oleh: I N. Sujaya

PRAKTIKUM
PENGARUH LINGKUNGAN TERHADAP
PERTUMBUHAN MIKROBA
7
7.1 Pendahuluan
Kehidupan mikroorganisme sangat tergantung dan dipengaruhi oleh keadaan lingkungan-
nya. Ada tida faktor lingkungan yang sangat mempengaruhi aktivitas mikroorganisme ini,
yaitu :
1. Faktor fisis, misalnya suhu, pH, tekanan osmosis, kandungan oksigen,dan lain-lain.
2. Faktor kimia, misalnya senyawa racun dan senyawa kimia lainnya sebagai bahan
makanan.
3. Faktor biologis, misalnya interaksi dengan mikroorganisme lain.

Reaksi mikroorganisme ini terhadap lingkungannya sangat penting untuk diketahui

sebab sangat menunjang proses-proses lainnya, misalnya dalam mengontrol adanya
mikroba penyebab penyakit atau dalam proses pembuatan dan pengawetan makanan.
Faktor lingkungan yang dapat mempengaruhi kehidupan mikroorganisme tersebut dapat
digolongkan sebagai faktor intrinsik, seperti pH, kadar air, cahaya dan suhu, dan faktor
ekstrinsik, seperti zat metabolit toksik, sumber karbon dan lain-lain.

7.2. Pengaruh suhu

Suhu yang cocok untuk pertumbuhan mikroorganisme sangat bervariasi. Pertumbuhan
mikroorganisme akan berlangsung sangat baik pada suhu optimumnya. Suhu optimum ini
biasanya sesuai dengan suhu habitat asalnya, misalnya pada suhu 37 oC untuk bakteri
pathogen pada hewan. Kita dapat membedakan mikroorganisme menjadi 3 kelompok
berdasarkan pada suhu optimum pertumbuhannya, yaitu :
a. Psikrofilik : mikroorganisme yang hidup pada suhu rendah (5 - 30 oC).
b. Mesofilik : mikroorganisme yang hidup pada suhu moderat (25 - 40 oC).
c. Termofilik : mikroorganisme yang hidup pada suhu tinggi (45 - 65 oC)
Catatan: rentang temperature diatas tidak strik seperti itu, karena ada beberapa mikroba
yang dapat hidup pada rentang temperature yang sangat luas, sehingga terjadi banyak
overlapping.
Alat dan bahan
a. Medium kaldu nutrisi yang dilengkapi dengan tabung Durham.
b. Biakan E. coli, Pseudomonas sp., dan Sarcina lutea.
c. Incubator.

Cara kerja

Petunjuk Praktikum Mikrobiologi

31
 Oleh: I N. Sujaya

a. Tanam biakan diatas pada medium kaldu nutrisi.

b. Inkubasi pada suhu 5 oC, 20 oC, 40 oC, dan 65 oC.
c. Amati pertumbuhannya setelah 2-7 hari.
7.3. Pengaruh pH
Seperti halnya dengan suhu, pertumbuhan mikroorganisme juga sangat dipengaruhi oleh
pH lingkungannya.
Alat dan bahan
a. Medium kaldu nutrisi dengan pH yang berbeda (3, 5, 7, dan 9).
b. Biakan E. coli, Staphylococcus aureus, dan S. cerevisiae.

Cara kerja
a. Tanamkan masing-masing biakan pada medium yang pHnya berbeda.
b. Inkubasi pada suhu 30 oC.
c. Setelah 2 dan 7 hari, amati pertumbuhan tiap biakan.

7.4. Pengaruh cahaya

Mikroorganisme memberikan respons yang baik terhadap cahaya (ada yang positif
dan ada yang negatif). Bahkan perkecambahan pun dipengaruhi oleh cahaya.
5.3.1 Alat dan bahan
a. Medium NA tegak
b. Cawan petri steril
c. Biakan E. coli dalam bentuk suspensi (umur 24 jam).

Cara kerja
a. Pipet 1 ml suspensi biakan dan masukkan ke dalam cawan petri.
b. Cairkan medium NA dalam penangas air, dan setelah mencapai suhu 40 oC, masukkan
ke dalam cawan petri yang telah berisi suspensi biakan.
c. Goyangkan sampai merata, dan biarkan membeku.
d. Perlakuan terhadap biakan adalah sebagai berikut : Cawan pertama disinari dengan
cahata matahari selama 15-30 menit, cawan kedua disinari dengan cahaya lampu
selama 15-30 menit lalu dibungkus dengan kertas hitam, dan cawan ketiga tidak
disinari dan langsung ditutup dengan kertas hitam.
e. Inkubasi ketiga cawan petri pada suhu 37 oC
f. Amati pertumbuhan biakan pada ketiga cawan petri.

5.3.2 Alat dan bahan

a. Satu tabung reaksi yang besar.
b. Air suling
c. Kertas saring
d. Kertas hitam
e. Kotoran kuda

Cara kerja
a. Isi tabung reaksi dengan air suling sampai setinggi 10 Cm.

Petunjuk Praktikum Mikrobiologi

32
 Oleh: I N. Sujaya

b. Masukkan kertas saring sedemikian rupa sehingga ujungnya tercelup pada permukaan
air
c. Letakkan kotoran kuda pada permukaan kertas saring tadi.
d. Tutup tabung reaksi dengan kertas hitam, lalu kertasnya dilubangi tepat diatas
permukaan kotoran kuda, dengan ukuran lubang sekitar 5 x 5 mm.
e. Inkubasi pada suhu kamar pada tempat yang terkena sinar matahari.
f. Amati pertumbuhan jamur pada kotoran kuda dan perhatikan kearah mana
pertumbuhannya.

Petunjuk Praktikum Mikrobiologi

33
 Oleh: I N. Sujaya

PRAKTIKUM
TEKNIK DASAR BIOLOGI MOLEKULER 8
8.1. Isolasi kromosomal DNA

Pengetahuan dasar tenatng DNA merupakan salah satu prasyarat dalam melakukan lanjut
tenang biologi molecule. Isolasi DNA merupakan pekerjan dasar dalam teknik biologi
molekuler sebelum dilanjutkan pada hal hal teknis seperti karakterisasi mikroorganisme,
sekuen susunan basa basa dalam sebuah gen, melakukan tranformasi (memasukkan gen
tetentu) ke dalam vector (pembawa gen) dan selanjutnya cloning (memasukkan gen yang
sudah dibawa oleh vector) ke dalam organisme model (E. coli, B. subtilis, Arabidopsis, S.
cerevisciae, dll).
Ada berbagai metode untuk mengisolasi DNA dari mikrooranisme, hewan dan tanaman.
Dan secara umum bias dianggap bahwa metode isolasi dnegan fenol adalah yang paling
umum dipergunakan oleh para peneliti. Belakangan ini para ahli banyak menggunakan
KIT (reagen untuk mengisolasi DNA dalam bentuk paket pereaksi) terutama apabila kita
mengisolasi DNA dalam jumlah yang sedikit (hanya untuk keperluan PCR). Tetapi,
isolasi dnegan fenol masih relefan apabila DNA yang diperlukan dalam jumlah yang
relative banyak untuk analisis lanjutan. Oleh karena itu dalam manual untuk mengisolasoi
DNA dengan menggunakan fenol.

Bahan
1. Larutan fenol jenuh dalam buffer Tris-HCl pH 8.0
2. Buffer TEN (Tris-EDTA-NaCl)
3. Enzim lysozim
4. Buffer TE (Tris-EDTA) pH 7.5
5. Larutan SDS (sodium dedosil sulfat) 10%
6. Isoamyl alkohol
7. Kloroform
8. Ethanol 99% dingin
9. Ethanol 70%
10. Enzim RNAse
11. Air steril
12. Es batu
13. Kultur murni mikrooragnsime
14. Media yang sesuai

Alat
1. Sentrifuse (kalau ada yang ada pendinginnya, dnegan kecepatan bisa diatur 12,000
sampai 15,000).
2. Effendorf (tabung kecil)
Petunjuk Praktikum Mikrobiologi
34
 Oleh: I N. Sujaya

3. Pipetman 10, 200, 1000 mikro liter

4. Inkubator (waterbath)
5. Tabung falcon, tabung sntrifuse tahan fenol.

Cara kerja:
a. Tumbuhkan kultur dalam 100 ml medium cair yang sesuai
b. Panen sel dengan melakukan sentrifugasi pada 3,500 rpm selama 20-30 menit
c. Bilas masa sel dengan 100 ml larutan buffer TEN yang telah didinginkan di dalam
pecahan es
d. Suspensikan masa sel di dalam 12 ml larutan lizozim dengan kosentrasi 10 mg/l
dalam buffer TE dan inkubasikan dalam water bath suhu 37oC selama 1 jam
e. Tambahkan 6 ml larutan 100 g/l SDS 10% dan inkubasi kembali pada suhu 37oC
selama 1 jam
f. Tambahkan 9 ml larutan fenol jenuh (dalam buffer Tris-HCl , pH 8.0).
g. Tambahkan 9 ml larutan kloroform-isoamyl alkohol (24:1)
h. Suspensi disentrifuse dengan kecepatan 1,5000 rpm pada suhu 5oC selama 30 menit
i. Bagian atas supernatan diambil dan dimasukkan ke dalam tabung falcon (atau
sejenisnya, yang tahan terhadap fenol).
j. Tambahkan 2.5 kali volume alkohol 99% yang sudah didinginkan, biarkan 15 menit
dalam pecahan es
k. Sentrifuasi supensi pada 15,000 rpm selama 15 menit pada suhu 5oC, dan DNA akan
mengendap di dasar tabung
l. Buang supernatan dan suspensikan DNA pelet dengan menggunakan alkohol 70%,
dan disentrifuse kembali seperti langkah k.
m. Endapan DNA dikeringkan dengan menggunakan aspirator dan selanjutnya
disuspensikan dalam 100 mikroliter bufer TE, pH 7.5

DNA yang diisolasi dengan menggunakan metode ini hampir selalu disertai dengan RNA.
Karena RNA akan mengganggu reaksi PCR, maka disarankan untuk meghidrolisa RNA
ynag terdapat di dalam DNA dengan cara sbb:
 Lautkan DNA yang diisolasi dalam 100-120 mikro liter bufer TE pH 7.5 (atau pH
8.0)
 Tambahkan RNAse (Sigma, Co. ltd: konsentrasi akhir enzym dalam lautan): 50
mikro gr/l
 Lakukan ekstraksi fenol dan selanjutnya presipitasi dengan menggunakan alkohol
seperti langkah sebelumnya.
 DNA yang telah diisolasi disipan dalam bufer TE, suhu –20 atau –80oC

☻ Tips

Petunjuk Praktikum Mikrobiologi

35
 Oleh: I N. Sujaya

DNA bisa diisolasi dengan menggunakan skala yang lebih sedikit.

Umumnya kultur dibiakkan dalam 5 ml media cair dan DNA diisolasi dari 1
ml (bahkan 100 mikro liter) suspensi kultur dengan cara diatas. Buatlah
skala perbandingan sehingga konsentrasi pelarut yang digunakan sesuai.
Ekstraksi DNA dengan skala kecil (small scale) ini, akan memudahkan
apabila kita memepunyai banyak sampel yang akan dikerjakan. Disamping
itu, DNA hanya dibutuhkan dalam jumlah yang sangat sedikit untuk tujuan
PCR (mungkin seitar 10-100 piko gram) untuk satu kali reaksi PCR sudah
lebih dari cukup. Kecuali utnuk keperluan kloning atau hibridisasi
diperlukan jumlah DNA yang lebih banyak banyak (beberapa mikro gram).

8.2. Elektroforesis

Elektroforesis adalah teknik pemisahan DNA atau molekul biologis lainnya seperti
protein (emzim dll), dengan cara mengalirkan pada lempengan agar khusus pada larutan
elektrolit (buffer tertentu). Dalam teknik molekuler biologi yang beruhubungan dengan
DNA dan teknik yang melibatkan PCR, elektoforesis merupakan bagian terintegrasi yang
tidak bisa dihindari. Teknik ini bertujuan untuk: memastikan apakan DNA bisa terisolasi
dengan baik dan seberapa jauh kemurnian DNA yang diperoleh, dan yang lebih penting
lagi adalah setelah dilakukan pencetakan fragment DNA (PCR), apakah reaksi
amplifikasi berlangsung dengan baik, atau apakan besar (panjang) produk yang terbentuk
sudah sesuai dengan besarnya target gen, atau apakan primer yang digunakan cukup
spesifik pada reaksi PCR. Ini semua dilakukan dengan menganalisis pita yang muncul
pada gel setelah dilakukan elektroforesis.

Bahan
1. DNA hasil isolasi
2. Agarose 1%
3. Loading bufer (bufer yang dipergunakan pada saat memasukkan sample ke dalam
gel, biasanya berisi zat warna dan mengandung gliserol agar DNA tidak menyebar di
atas gel).
4. Bufer Tris-Asam asetat-EDTA (TAE: 1 kali strength)
5. Ethidium bromida (EtBr)

Alat

1. Elektroforesis set (chamber, sisir untuk membuat gel, cetakan gel, power supply).
2. Piperman 10 mikro liter dngan tip-nya
3. Sarung tangan
4. Transluminator (lampu uv)
5. Kamera

Cara kerja:
a. Siapkan gel agarose dalam bufer TAE, 1X strength (stok buffer TAE biasanya dibuat
dalam 50X strength). Untuk gel dengan ukuran standar, cukup dengan 50-75 ml
agarose (tebal agarose 75% dari panjann sisir yang digunakan).
Petunjuk Praktikum Mikrobiologi
36
 Oleh: I N. Sujaya

b. Panaskan agarose sampai larut, biasanya dilakukan dengan memanaskan berulangkali

dalam mikrowafe selama 2 menit sampai agarose larut dengan sempurna.
c. Cor agarose pada cetakan yang standar digunakan, dan biarkan sleama 20 menit
sampai beku secara sempurna.
d. Angakta sisir (untuk membuat sumur sample) kearah vertical secara perlahan-lahan.
e. Masukkan ke dalam chamber elektroforesis yang telah diisi dengan TAE buffer 1X,
dengan permukaan lautran buffer 2-3 mm diatas agar. Perhatikan jangan sampai ada
gelembung udara di bawah cetakan (tray) agarose karena akan menghambat aliran
listrik pada saat elektroforesis.
f. Pipet suspensi DNA (1-2 mikro liter), tergantung dari konsentrasi DNA. Biasanya
DNA yang didolasi dari 1.5 ml kulture cair, dan DNA akhir dilarutkan dalam 100
mikro liter buffer TE, diambil sebanyak 3-5 mikro liter menghasilkan pita DNA yang
bagus. Terlalu banyak DNA akan memberikan pita yang terlalu tebal dan terkadang
smear (fuzzy).
g. Teteskan di atas parafilm yang bersih dan selanjutnya ditambahkan dengan loading
buffe (agar DNA tidak menyebar di atas permukaan agar). Biasanya loading buffer
dibuat 6X strength, sehingga 1 mikro liter loading buffer ditambahkan dengan 5X
volume DNA.
h. Masukkan sampel secara vertikal tepat di dalam sumur gel. Lakukan hati-hati agar
sampel tidak menyebar diatas agarose.
i. Gunakan size standar (marker untuk menentukan panjang pita yang akan terbentuk).
Umumnya untuk DNA genom digunakan hinfIII digestion size standard, atau bisa
juga dengan menggunakan 1 kilobasa (1000 nukleotida) size standar dari BioRad.
Panjang DNA genom prokaryote (bakteri) umunya sekitar 2-3 Mega pasang basa.
j. Lakukan elektroforesis selama 30 menit (apabila konsentrasi agarose 1%: atau sekitar
45 menit untuk fragment PCR yang menggunakan 1.5 – 2% agarose).
k. Stop mesin elektroforesis, dan angat gel.
l. Rendam dalam larutan ethidium bromida (konsentrasi 5 mikro gr/ml) dalam buffer
1X TAE selama 10 menit.
m. Angkat gel dan rendam dalam akuades selama 10 menit (destaining, agar kelebihan
EtBr tercuci).
n. Pita yeng terbentuk bisa dilihat dibawah sinar uv. (trasliminator) dan slanjutnya di
foto.

 Perhatian
  EtBr bersifat karsinogenik. Oleh karena itu gunakan sarung tangan
apabila megambil gel, atau gel diambil dengan sendok plastik.
 Gel yang sudah dicat dengan EtBr jangan dibuang sembarangan.
Kumpulkan menjadi satu dalam wadah dan selanjutnya ditangani
dengan cara pemberian kaporit sebelum dibuang.

8.3. Polymerase chain reaction (PCR)

Pendahuluan

Petunjuk Praktikum Mikrobiologi

37
 Oleh: I N. Sujaya

Polimerase chain reactions (PCR) adalah suatu metode memperbanyak jumlah DNA atau
target gen yang diinginkan secara in vitro, melalui serangkaian reaksi enzymatis. Dalam
reaksi enzymatis ini diperlukan beberapa komponen:
1. DNA yang ingin diperbanyak (tenplate).
2. Primer (pencetak) yang umunya merupakan susunan nukleotida dengan panjang
maksimum 27 pasang basa (base pair).
3. dNTPS ( yang merupakan sumber nucleotide: A, C, G, T).
4. Buffers dan MgCl2 (agar reaksi bisa berjalan dengan optimal).
5. Enzyme polimerase tahan panas (thermostable enzyme) atau TaqPolymerase.
Secara umum, reaksi berjalan dalam beberapa tahapan dimana tahap awal dimulai dnegan
denaturasi DNA tenpale menjadi bentuk single strand, dan selanjutnya suhu diturunkan
secara cepat untuk memberikan kondisi terjadinya annealing (penempelan/hibridisasi
primer) pada bagian yang mempunyai susuanan basa basa yang komplemeter pada
tenplate yang secara bersamaan enzyme polimerase bekerja untuk menggabungkan
susunan basa-basa yang sesuai. Se telah itu terjadi reaksi ekstensi (elongation) dimana
perpanjangan reaksi pembentukan rantai DNA dengan sempurna. Jadi, karena setiap
double strand DNA akan dicetak menjadi 2 rantai single strand, maka setiap satu kali
siklus reaksi menghasilkan 2 rantai double strand dari satu rantai DNA tenplae (double
strand). Dengan kata lain bahwa akan terjadi 2n produk PCR (n adalah jumlah siklus
reaksi). Dengan metode ini akan dihasilkan DNA dalam jumlah yang sangat besar dari
sejumlah tenplate DNA yang sangat terbatas.

Bahan
PCR set (1-6) yang terdiri dari:
1. dNTPs mix: yang merupakan campuran masing masing 10 mM dATP, dCTP, dGTP,
dTTP)
2. MgCl2
3. PCR buffer II
4. Forward primer
5. Reverse primer
6. TaqPolymerase
7. DNA template
8. Air steril
9. Es batu
10. Elektroforesis set (lihat protokol 8.2)

Alat
1. Tabung PCR 200 mikro liter (atau PCR tertentu menggunakan 500 mikro liter)
2. Pipetman 0.5 – 10 mikro liter dan 10-200 mikroliter) dengan tip-nya
3. Mesin PCR

Cara kerja
Ke dalam tabung PCR (0.2 ml PCR tube) dimasukkan reagent sbb:
(sebaiknya DNA diamsukkan pada langkah terakhir sebelum penambahan akuades steril).

Petunjuk Praktikum Mikrobiologi

38
 Oleh: I N. Sujaya

① 5 l dNTPs yang merupakan campuran masing masing 10 mM dATP, dCTP, dGTP,

dTTP) (konsentrasi akhir 10 mM setiap dNTP).
② 3.5 l MgCl2 (75 mM)
③ 5 l PCR buffer II (10X PCR buffer)
④ 5 l forward primer 10 pmol
⑤ 5 l reverse primer 10 pmol
⑥ 0.25 l TaqPolymerase (5U/l )
⑦ 1 l DNA template (10-100 ng/ l)
⑧ Air steril (air bebas mineral (deionized water) lebih baik) sampai vol. akhir 50 l

Contoh primer:
1. Digunakan untuk identifikasi bakteri dan bakteri asam laktat (M13 adalah primer
universal).

Petunjuk Praktikum Mikrobiologi

39
 Oleh: I N. Sujaya

2. Untuk identifikasi Kapang dan khamir :

Internal transcribed spacer regions pada rDNA dan 18S rDNA
(White et al. 1990).

Nama Sekuen 5’ -3’ Target gen

ITS5F 5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’
ITS
ITS4R 5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’
NS1F 5’-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3’
NS2R 5’-GGCTGCTGGCACCAGACTTGC-3’
NS3F 5’-GCAAGTCTGGTGCCAGCAGCC-3’
18S rDNA
NS6R 5’-GCATCACAGACCTGTTATTGCCTC-3’
NS5F 5’-AACTTAAAGGAATTGACGGAAG-3’
NS8R 5’-TCCGCAGGTTCACCTACGGA-3’

95oC 95oC
2 mnt 3 mnt 72oC 72oC
2 mnt 7 mnt

50oC
30 dtk

5oC
30 kali siklus simpan

denaturase annealing elongation elongasi

Gambar 8-1. Skematik reaksi PCR untuk identifikasi bakteri dengan target 16S
rDNA gen. Kondisi PCR bisa berubah-ubah sesuai dengan kekhasan primer

Contoh kondisi PCR untuk ITS dan 18S rDNA

Pada total 50 μl volume reaksi mengandung:
① DNA genom 100 ng
② Primer forward 100 p mole
③ Primer reverse 100 p mole
④ 1 x PCR buffer II;
⑤ 10 mM setiap dNTPs;
⑥ 75 mM MgCl2;
⑦ 0.125 U TaqPolymerase
Catatan; campuran reaksi PCR sama dengan 16S rDNA, yang berbeda hanya primer.
Kondisi silkus PCR:
① pre-denaturasi pada suhu 95 oC selama 3 min
② Diikuti dnegan 35siklus:
a. Denaturasi selama 30 detik pada suhu 95 oC,
b. annealing selama 30 detik pada suhu 50 oC,
c. ekstensi (polimerasi) selama 2 menit pada suhu 72 oC
③ Perpanjangan tambahan pada akhir siklus selama 10 menit pada 72 oC
Setelah PCR dilakukan elektroforesis seperti pada 8.1

Petunjuk Praktikum Mikrobiologi

40
 Oleh: I N. Sujaya

DAFTAR PUSTAKA

1. Madigan, M.T., Martinko, J.M., Parker, J. Brock Biology of Microorganisms. 10 th

Ed. Perason Education Inc. Upper Saddle River, New Jersey (2003).

2. Lay, D.W. Analisis Mikroba di Laboratorium. Penerbit Raja Grafindo Persada,

Jakarta (1994).

3. Seely, H.W.Jr., dan VanDemark, P.J. Microbes in cation. A Laboratory Manual of

Microbiology. 3rd Ed. W.H. Freeman and Company. San Francisco (1981).

4. Hairy, J.B. Clinical Diagnostic and Management by Laboratory Method, 9ed, WB

Saunders, Co. (1989).

5. Colome, J.S., Kubinski, A.M., Cano, R.J., Grady, D.V. Laboratory Exercise in
Microbiology. West Pub. Comp., USA. (1986).

6. White, T.J., Bruns, T., Lee, S., Taylor, J. Amplification and Direct Sequencing of
Fungal Ribosomal RNA Genes for Phylogenetics. In PCR Protocols. A Guide to
Methods and Applications, ed. Innis, M.A., Gelfand, D.H., Sninsky, J.J. & White,
T.J. pp.315-322. San Diego: Academic Press, Inc. ISBN 0-12-372181-4 (1990).

7. Ausbel F., Brent, R., Kingston, R.E., Moore, D.D., Seidman, J.G., Smith, J.A.,
Struhl, K., Albright, L.M., Coen, D.M., Varki, A. Current Protocols in Molecular
Biology. Jhon Wiley & Son, Inc., USA (1997).

Petunjuk Praktikum Mikrobiologi

41
 Oleh: I N. Sujaya

APENDIK

Komposisi larutan dan bufer yang umum dipergunakan dalam teknik biologi
molekuler

1. EDTA (ethykenediamine tetraacetic Larutkan 186.1 g Na2EDTA 2H2O dalam 799 ml

acid) air. Atur pH sampai 8.0 dengan lar NaOH 10 M
(diperlukan sekitar 50 ml). Tambahkan air sampai
0.5 M (pH: 8) 1 lt
2. Ethidiumbromida (EtBr) 10 mg/ml Larutkan 0.2 g EtBr dalam 20 ml air, aduk dnegan
baik dan simpan pada suhu 5oC dalam botol gelap
(EtBr bersifat mutagen dan harus ditangani
dengan hati hati).
3. HCl, 1 M Campur 913.8 ml air dengan 86.2 HCl pekat
4. KCl, 1 M 74.6 KCl dalam 1 lt air
5. MgCl2, 1M 20.3 g MgCl2 6HO dalam 100 ml air
6. MgSO4, 1 M 24.6 g MgSO4 7H2O dalam 100 ml air
7. NaCl, 5 M 292 g NaCl dalam 1 lt air
8. NaOH, 10 M 400 g NaOh dalam 1 lt air
9. Posfat Buffer Saline (PBS); 10X stok, 8 g NaCl,
1 lt 2 g KCL,
11.5 g Na2HPO4 7H2O;
2 g KH2PO4
10. Tris EDTA (TE ) bufer 10 mM TrisCl, pH 7.4, 7.5 atau pH 8.0
1 mM EDTA, pH 8.0
11. Tris EDTA NaCl (TEN) bufer 40 ml TrisCl, pH 7.5
1 mM EDTA, pH 8.0
150 mM NaCl
(tahan disimpan sampai 6 bnl pada suhu kamar).
12. TrisMg (TM) bufer 100 mM TrisCl, pH 7.5
100 mM MgCl2
13. TrisSaline (TS) bufer 100 mM TrisCl, pH 7.5
0.85% NaCl

14. TAE (TrisAcetic acid EDTA), bufer 50X stok dalam 1 lt

untuk elektroforesis 242 g Tris base
57.1 ml asam asetat glasial
37.2 g Na2EDTA2H2O

15. Loading bufer 20% ficol

0.1 M EDTA, pH 8.0
1% Sodim dedocyl sulfat (SDS)
0.25% bromofenol blue
0.25% xylene cyanol

Petunjuk Praktikum Mikrobiologi

42