OLEH :
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SETIA BUDI SURAKARTA
2020
PENDAHULUAN
Tumbuhan mengandung beberapa senyawa aktif seperti alkaloid, steroid, tanin,
glikosida, minyak atsiri, minyak tetap, resin, fenol, dan flavonoid yang disimpan di
bagian yang berbeda. Tumbuhan yang berbeda memiliki pola metabolisme yang
beragam; Namun, beberapa ekstrak tanaman sering menunjukkan aktivitas yang sama,
sebagai contoh keluarga tumbuhan yang berbeda,dapat memberikan efek antidepresi.
Ketika mencari obat alam yang efektif dan komponen kosmetik, tumbuhan yang
berbeda perlu diperhitungkan, itu mungkin perlu untuk menentukan ekstrak tanaman
mana yang lebih kaya senyawa aktif tertentu yang menunjukkan sifat yang paling
diinginkan;aspek lain membutuhkan quality control (QC)/kontrol kualitas dengan
monitoring kandungan senyawa terpilih didalam produk akhir. Mengenai pilihan material
tumbuhan, seleksi awal isi dari senyawa terpilih mungkin dapat membantu. Juga harus
dipertimbangkan bahwa aktivitas beberapa flavonoid dapat bervariasi berdasarkan
faktor-faktor selain dari pola substitusi. Terjadinya pusat stereogenik dalam beberapa
molekul menghasilkan kebutuhan untuk memverifikasi aktivitas biologis enansiomer dan
untuk menentukan konten masing-masing dalam bahan tanaman langsung digunakan
oleh manusia atau dalam produk turunan bahan tanaman. Metabolisme dan sifat
enansiomer dari senyawa yang sama mungkin berbeda; oleh karena itu, penelitian
tentang topik ini masih dilakukan. Golongan senyawa ini mengandung antioksidan yang
kuat dan satu yang paling merusak radikal bebas atau oksidasi penyakit degeneratif,
memiliki mekanisme yang luas, mungkin senyawa tersebut dapat mencegah penyakit
dan mendukung terapi tersebut. Beberapa senyawa memperlihatkan kemampuan
tersebut, misalnya kuersetin dan glikosida rutin,kaempferol, naringenin dan glikosida
naringin dan narirutin dan hesperetin, dan glikosida hesperidin dan neohesperidin.
Beberapa senyawa juga mempunyai aktivitas menarik lainnya seperti, antiinflamasi,
anthelmintikum, sedative, dan aktivitas antidepresan, yang telah dijelaskan untuk
komponen hypericum.
Selama penentuan kromatografi flavonoid yang dipilih dalam sampel tanaman, di mana
mereka bersama-sama terjadi dengan senyawa lain, langkah penting dari prosedur
analitik adalah pemisahan dan pemurnian sampel yang sesuai, yang mengurangi
gangguan matriks.
METODE PEMISAHAN
Ekstraksi adalah pemisahan bagian tanaman yang aktif secara medis menggunakan
prosedur selektif dan standar. Ini adalah langkah pertama yang penting dalam analisis
tanaman obat, karena itu perlu untuk mengekstraksi komponen kimia yang diinginkan
dari bahan tanaman untuk pemisahan lebih lanjut dan karakterisasi. Ada beberapa
metode ekstraksi untuk pemisahan produk alami dari tanaman yang ada. Metode
metode ini dapat disebut konvensional (telah lama digunakan) dan modern
(dikembangkan baru-baru ini). Teknik konvensional adalah yang menggunakan pelarut
organik atau air dan dilakukan secara umum pada tekanan atmosfer sedangkan teknik
modern menggunakan tekanan dan atau suhu yang meningkat. Untuk prosedur
ekstraksi, pelarut seperti air, etanol, kloroform, diklorometana, heksana, etil asetat,
methanol dll paling sering digunakan. Metode ekstraksi konvensional umumnya
menggunakan pelarut organik dan membutuhkan volume besar pelarut dan waktu
ekstraksi yang lama. Metode ekstraksi modern juga telah diterapkan dalam ekstraksi
produk alami dan mereka menawarkan beberapa keuntungan seperti konsumsi pelarut
organik yang lebih rendah, waktu ekstraksi yang lebih pendek dan meningkatkan hasil
ekstraksi.
Berikut ini macam –macam cara ekstraksi konvensional dan modern :
1. Maserasi
Dalam proses ini, bagian-bagian tanaman padat ditempatkan dalam wadah
bertutup dengan seluruh pelarut dan dibiarkan berdiri selama periode di minimal
3 hari (3 - 7 hari), kemudian disaring (melalui saringan / jaring), marc ditekan dan
cairangabungan diklarifikasi (dibersihkan dengan filtrasi) atau dengan dekantasi.
2. Perkolasi
Perkolasi adalah prosedur yang paling sering digunakan untuk mengekstrak
bahan aktif dalam persiapan tincture dan ekstrak cairan. Bahan tanaman diambil
dalam tabung perkolasi dicolokkan dengan kapas atau dilengkapi dengan filter
dan stopcock. Pelarut ditambahkan ke dalam bahan tanaman yang dibiarkan
berdiri selama kurang lebih 4 jam dalam wadah yang tertutup rapat, setelah itu
massa dikemas dan bagian atas cerek penapis ditutup. Seluruh sistem disimpan
selama 24 jam pada suhu kamar dan pelarut bersama dengan bahan yang
diekstraksi dikumpulkan dengan membuka sumbat di bawah dan cairan
campuran diklarifikasi dengan penyaringan atau dengan berdiri diikuti dengan
decanting.
3. Digesti
Digesti adalah bentuk maserasi di mana pemanasan lemah (40 o-60o C)
diterapkan
selama proses ekstraksi. Ini digunakan ketika simplisia tidak tahan pemanasan.
Proses dapat dimodifikasi dengan mencampur bahan dengan pelarut
menggunakan pengaduk magnetik, pengaduk mekanik atau dengan mengocok
sesekali dengan tangan. Setelah 8 hingga 12 jam, ekstrak disaring dan pelarut
segar ditambahkan dan proses diulang sampai semua produk yang diinginkan
diekstraksi.
4. Infusi
Dalam proses ekstraksi ini, bahan tanaman dimaserasi untuk waktu yang singkat
dengan air dingin atau air mendidih. Ini adalah larutan encer dari komponen yang
mudah larut dari serbuk simplisia.
5. Dekokta
Dalam proses ini, bahan tanaman bubuk direbus dalam volume air tertentu untuk
waktu yang ditentukan; kemudian didinginkan dan disaring atau disaring.
Prosedur ini cocok untuk mengekstraksi konstituen yang larut dalam air dan
stabil terhadap panas. Proses ini biasanya digunakan dalam persiapan ekstrak
Ayurvedic yang disebut ―quath” atau ―kawat”. Rasio awal obat mentah untuk
air ditetapkan, misalnya 1: 4 atau 1:16; volume kemudian diturunkan ke
seperempat ke volume aslinya dengan mendidih selama prosedur ekstraksi.
Kemudian, itu ekstrak pekat disaring dan digunakan seperti itu atau diproses
lebih lanjut.
6. Reflux
Dalam proses ekstraksi panas ini, bahan tersebut diperlakukan dengan pelarut
mendidih. Uap pelarut didaur ulang oleh kondensor yang dipasang di atas
wadah, lebih disukai labu alas bulat. Ini tidak dapat digunakan untuk ekstraksi
produk alami termolabil.
7. Tincture
Ini adalah ekstrak bahan nabati dalam alkohol. Biasanya bahan tanaman (segar)
dan etil alkohol diambil dengan perbandingan 1: 5. Karena kandungan
alkoholnya, tincture dapat disimpan pada suhu kamar tanpa terurai.
9. Ekstraksi sohxlet
Dinamai setelah after Franz Ritter von Soxhlet ', seorang ahli kimia pertanian
Jerman, ini adalah metode terbaik untuk ekstraksi padat kontinyu dengan pelarut
panas. Peralatan Soxhlet adalah unit refluks kaca khusus yang terutama
digunakan untuk ekstraksi pelarut organik. Bahan padat bubuk ditempatkan
dalam bidal yang terbuat dari kertas saring dan ditempatkan di dalam alat
soxhlet. Peralatan dipasang pada labu alas bulat (RB) yang berisi pelarut dan
kondensor refleks. Pelarut dalam labu RB dididihkan dengan lembut, uapnya
melewati tabung samping, dikondensasi oleh kondensor dan jatuh ke bidal yang
mengandung bahan dan perlahan mengisi soxhlet. Ketika pelarut mencapai
bagian atas tabung
yang melekat itu menyedot ke dalam labu, sehingga menghilangkan bagian dari
zat, yang telah diekstraksi.
12. Expression
Ekspresi, juga disebut sebagai pengepresan dingin, adalah metode ekstraksi
khusus untuk minyak atsiri jeruk. Pada zaman dulu, ekspresi dilakukan dalam
bentuk spon pressing, yang secara harfiah dilakukan dengan tangan. Pelepasan
minyak dalam proses ini diserap oleh spons dan pulih kembali dengan memeras
spons. Dilaporkan bahwa minyak yang diproduksi dengan cara ini mengandung
lebih banyak karakter bau buah daripada minyak yang diproduksi dengan
metode lain.
13. Enfluerage
Teknik ini digunakan untuk ekstraksi wewangian halus dari bunga. Kelopak
bunga tersebar di atas lapisan lemak halus yang mengambil bau bunga dan
lemak jenuh diperlakukan dengan pelarut, biasanya alkohol dimana komponen
harum larut. Lemak residu yang dilarutkan dalam alkohol dapat dihilangkan
dengan mendinginkan ekstrak alkohol sampai 20 oC, ketika lemak terpisah.
Alkohol diuapkan di bawah tekanan tereduksi dan minyak murni diperoleh.
2. KROMATOGRAFI KOLOM
Kromatografi kolom adalah teknik paling efektif yang digunakan dalam
pemisahan ekstrak tanaman mentah ke dalam nya komponen dalam bentuk
murni. Ini adalah persiapan metode kromatografi dan fase diam (silika gel)
dikemas dalam kolom dan kemudian fase gerak (eluen) dilewatkan melalui
kolom setelah memuat ekstrak di bagian atas fase diam. Fase gerak
membawa produk-produk alami yang ada dalam campuran dengan laju yang
berbeda berdasarkan afinitasnya dengan fase diam dan bergerak. Senyawa
yang terpisah dapat dikumpulkan bersama dengan fase gerak.
PENENTUAN STRUKTUR
Penentuan struktur produk alami menggunakan data dari berbagai teknik
spektroskopi seperti UV-Visible, Infrared (IR), Nuclear Magnetic Resonance
(NMR) dan Mass spectroscopy. Prinsip dasar spektroskopi adalah
melewatkan radiasi elektromagnetik melalui senyawa organik yang menyerap
sebagian radiasi, tetapi tidak semua. Dengan mengukur jumlah penyerapan
radiasi elektromagnetik, spektrum dapat dihasilkan. Spektrum spesifik untuk
ikatan tertentu dalam suatu senyawa. Tergantung pada spektrum ini, Struktur
senyawa alami dapat diidentifikasi. Para ilmuwan terutama menggunakan
spektrum yang dihasilkan dari tiga atau empat wilayah Ultraviolet (UV),
Visible, Infrared (IR), Frekuensi radio (FTIR), dan berkas elektron untuk
klarifikasi struktural.
1. UV-VIS
Spektroskopi UV-VIS dapat dilakukan untuk analisis kualitatif dan untuk
identifikasi kelas senyawa tertentu dalam campuran murni dan biologis.
Lebih disukai, spektroskopi UV-terlihat dapat digunakan untuk analisis
kuantitatif karena molekul aromatik adalah kromofor yang kuat dalam
kisaran UV. Alam senyawa dapat ditentukan dengan menggunakan
spektroskopi UV-VIS. Bahkan, spektro-scopic UV-Vis teknik yang
ditemukan kurang selektif dan memberikan informasi tentang komposisi
total konten polifenol. Teknik ini tidak memakan waktu, dan menyajikan
pengurangan biaya dibandingkan dengan teknik lain.
4. Spektroskopi massa
Spektrometri massa adalah teknik analitik yang kuat untuk identifikasi
senyawa yang tidak diketahui, kuantifikasi senyawa yang diketahui dan
untuk menjelaskan struktur dan sifat kimia molekul. Melalui spektrum MS,
berat molekul sampel dapat ditentukan. Metode ini banyak digunakan
untuk
penjelasan struktural senyawa organik, untuk peptida atau oligonukleotida
pengurutan dan pemantauan keberadaan senyawa yang sebelumnya
menjadi ciri dalam campuran kompleks dengan spesifisitas tinggi dengan
mendefinisikan berat molekul dan fragmen diagnostik molekul secara
bersamaan.
PEMBAHASAN
Pada jurnal yang saya baca ini, disebutkan bahwa isolasi senyawa
polifenol dalam tanaman yang masih bercampur dengan senyawa lain,
menggunakan ekstraksi fase padat (SPE), langkah penting dari prosedur
analitik adalah pemisahan dan pemurnian sampel yang sesuai, yang
mengurangi gangguan matriks. Untuk ekstraksi fase padat (SPE)
senyawa polifenol dari ekstrak tanaman sebelum di analisis kromatografi,
menggunakan octadecyl sorben, atau kadang-kadang sorben polimer
sorben yang dipilih ini adalah sorben yang relatif serbaguna yang, pada
pH sampel yang sesuai, umumnya dapat memberikan penemuan kembali
yang baik untuk spektrum luas senyawa polifenol. Namun demikian,
sejumlah besar senyawa yang diperoleh kembali, dapat menjadi
keuntungan dan kerugian dari sorben seperti itu karena coekstraksi
banyak senyawa yang tidak diinginkan dengan senyawa target,
menghasilkan banyak gangguan matriks dan pemurnian sampel yang
agak lemah. Beberapa penulis telah berusaha untuk memecahkan
masalah ini dengan menguji sorben yang dicetak secara molekuler, yang
tampaknya mengurangi ekstraksi simultan dari senyawa yang tidak
diinginkan; Namun, sorben ini juga ditemukan tidak selektif seperti yang
diharapkan. Dalam literatur ilmiah, beberapa karya dapat ditemukan
membandingkan beberapa sorben SPE untuk pemisahan polifenol. Ada
juga makalah yang menjelaskan perbandingan sorben untuk beberapa
senyawa target polifenol. Salah satunya menggambarkan perbandingan
empat berbeda. sorben (Amberlite XAD-2, Bond Elut C18, Oasis HLB dan
Waters Strata-X) untuk pemisahan rutin, quercetin, kaempferol dan
beberapa asam fenolik dari sampel madu dan dua sorben (Oasis HLB dan
Bond Elut Plexa) untuk pemisahan rutin, quercetin, hesperetin, hesperidin,
neohesperidin, naringenin, chrysin dan beberapa asam fenolik dari
sampel Lycium barbarum L. Perbandingan lain dilakukan untuk chrysin
dan empat lainnya flavones diekstraksi dari Scutellaria L. dengan empat
sorben berbeda (Bakerbond C18, Bakerbond Phenyl, SDB-1 dan Oasis
HLB) Dua sorben SPE ( fi pertama, Lichrolut C18 dan, kedua, Oasis HLB)
secara berurutan digunakan untuk pemisahan quercetin, kaempferol,
rutin, naringenin, hesperidin dan beberapa senyawa polifenol lainnya,
yang bukan subjek penelitian. Dalam sebagian besar makalah yang
dijelaskan, deteksi spektrofotometri digunakan dalam metode
kromatografi; Namun, metode yang digunakan untuk sampel tanaman
biasanya memiliki waktu analisis lebih lama dari 30 menit. Dalam tulisan
ini, hasil pemisahan simultan dari sembilan dipilih flavonoids (dan IS) dari
sampel tanaman dengan hanya satu sorben (Bond Elut Plexa) disajikan.
Hasil penelitian
tentang pemisahan sembilan senyawa dengan 16 sorben yang diuji
berbeda dan perbandingan eluen yang digunakan untuk 8 sorben terbaik
juga dijelaskan. Prosedur yang dikembangkan dapat digunakan oleh para
peneliti yang tertarik pada satu atau beberapa analit yang dijelaskan.
Tujuan lain dari pekerjaan ini adalah untuk mengembangkan metode yang
efektif untuk penentuan serentak sembilan yang dipilih fl avonoid dan
rasio enansiomerik aglikon kiral dalam ekstrak bahan tanaman kering dari
Menthae piperitae, Hypericum perforatum dan Salvia dari ficinalis dan
produk mereka yang tersedia secara komersial. Prosedur SPE yang dipilih
dengan metode kromatografi yang diusulkan dapat menjadi alat yang
berguna untuk perbandingan bahan tanaman dan QC bahan tanaman.
Instrumentasi dan reagen
Analisis kromatografi dilakukan dengan sistem kromatografi cair ultra high
performance (UHPLC) (Merck Hitachi, Jerman) yang terdiri dari pompa
(model L-2160U), detektor ultraviolet (UV) (model L-2400U), autosampler
(model L-2200), kompartemen kolom termostabil (model L-2350U) dan
modul degasser.
Analisis kromatografi konfirmasi dan kromatografi kiraldilakukan dengan
kromatografi cair kinerja tinggi ditambah dengan spektrometri massa
tandem (UHPLC-MS-MS) sistem, yang terdiri dari sistem Dionex UHPLC
(Dionex, Sunnyvale, CA) ditambah dengan API 4000Q TRAP detektor
spektrometer massa tandem dilengkapi dengan sumber ionisasi
electrospray (ESI) (Applied Biosystems) / MDS SCIEX, Foster City, CA).
Sistem Dionex UHPLC termasuk pompa UltiMate 3000 RS (Pemisahan
Cepat), autosampler UltiMate 3000 dan UltiMate 3000. kompartemen
kolom termostasi. Sistem dioperasikan dengan perangkat lunak Dionex
Chromeleon 6.8, dan data diperoleh dengan menggunakan perangkat
lunak Analyst v 1.4.
Standart flavonoid menggunakan rutin (RUT), narirutin (NRT), naringin
(NRI), hesperidin (HSD), neohesperidin (NHSD), quercetin (QUE),
naringenin (NAR), kaempferol (KAM), hesperetin (HST), dan chrysin
(CHS; digunakan sebagai standar internal (IS)) semua dibeli dari Sigma-
Aldrich (St. Louis, MO). Metanol, asetonitril kelas HPLC, air, tri fl asam
uoroacetic (TFA) dan asam format diperoleh dari Merck (Darmstadt,
Jerman). Asam hidroklorat berkadar analitik, metanol, dan asetonitril dibeli
dari POCH (Gliwice, Polandia).
Metode Pemisahan dilakukan dengan menggunakan kolom analitik
ZORBAX Eclipse Plus C18 RRHD (50 × 2.1mm, 1.8 μ m, Agilent
Technologies, USA) dengan kolom pelindung dari bahan yang sama di 40
° C. Fase gerak yang terdiri dari asetonitril (pelarut A) dan 0,05% TFA
dalam air (pelarut B) digunakan dalam mode elusi gradien. Program elusi
gradien
yang baru dikembangkan untuk tujuan pemisahan senyawa digunakan
sebagai berikut: 95% B (0,5 mL / menit) menurun hingga 40% B lebih dari
10,0 menit ( flavonoid tingkat kenaikan aliran ke 0,7 mL / mnt), turun
menjadi 0% B selama 2,0 menit (0,7 mL / mnt), bertahan pada 0% B untuk
2,0 mnt berikutnya (0,7 mL / mnt), meningkat menjadi B 0,1 mnt ( fl laju
aliran turun dari 0,7 mL / mnt ke 0,5 mL / mnt) dan bertahan pada 95% B
selama 2,9 mnt (0,5 mL / mnt) untuk penyeimbangan ulang. Total runtime
adalah 17 menit. Deteksi dilakukan dengan menggunakan detektor UV
panjang gelombang variabel di λ = 280 nm. Volume injeksi adalah 2 atau 5
μ L. Untuk MS / MS konfirmasi identitas analit, kondisi kromatografi yang
digunakan adalah sama dengan yang dijelaskan di atas untuk metode
deteksi UV. Pengecualian adalah modi fikasi asam, yang diubah menjadi
0,1% asam format dalam air dari 0,05% TFA. Untuk mendeteksi analit
individu, mode ionisasi negatif dengan dua pasangan pemantauan reaksi
ganda (MRM) digunakan untuk setiap senyawa.Parameter yang
tergantung pada sumber berikut digunakan: gas tirai (CUR) ditetapkan
pada 30 psi, gas disosiasi tabrakan berbantuan (CAD) ditetapkan pada
nilai sedang, tegangan ionisasi (ISV) ditetapkan pada - 4.500 V, suhu
sumber (TEM) ditetapkan pada 550 ° C, gas nebulizer (GS1) ditetapkan
pada 60 psi dan gas pemanas (GS2) ditetapkan pada 35 psi.