PENGANTAR KROMATOGRAFI

Kusuma Hendrajaya
Ririn Sumiyani
 Pendahuluan

•
Pemisahan Zat warna oleh Tswett
 Definisi Kromatografi (1)
• Kromatografi merupakan teknik pemisahan yg
paling umum dibidang farmasi krn dpt dpk 3
fungsi sekaligus:
• Kualitatif, Kuantitatif dan Preparatif.
• Menurut IUPAC ( International Union of Pure
and Applied Chemistry) thn 1993:
• Kromatografi adlh metode pemisahan scr fisika
yg mana komponen2 yg akan dipisahkan terbagi
diantara 2 fase, yaitu fase diam dan fase gerak
yg bergerak pd arah tertentu.
Definisi Kromatografi (2)
Klasifikasi kromatografi berdasarkan fase diam,
fase gerak dan support material (1)
Klasifikasi berdasarkan prinsip pemisahan (2)
Klasifikasi berdasarkan fase gerak & fase diam (3a)
Klasifikasi berdasarkan fase gerak & fase diam (3b)
Kromatografi berdasarkan asas terjadinya
proses pemisahan (1)
Kromatografi berdasarkan asas terjadinya
proses pemisahan (2)
 1. Kromatografi adsorpsi (a)
Adsorpsi  penyerapan pd
permukaan # absorbsi
penyerapn keseluruhan.
Adsorpsi melibatkan
interaksi2 elektrostatik: ik.
Hidrogen, penarikn dipol2,
& penarikn yg diinduksi
dipol. Solut bersaing dgn
fs gerak untk berikatan dgn
sisi polar pd permukaan
adsorpben
 1. Kromatografi adsorpsi (b)
• Fs diam (adsorpben yg banyak digunakn adlh silika
gel. Permukn silika gel t.d. gugus Si-O-Si or gugus
Silanol (Si-OH) yg bersif asam & polar  mampu
membentk ik. Hidrogen dgn solut2 yg agk polar smp
sgt polar.
• Air dr atmosfir yg diserap permukaan silika gel dpt
menutup sisi aktifnya,diatasi dgn memanaskn pd
suhu 105°C.
• Solut mkn polar- mkn kuat tertahan ke dlm
adsorben silika gel. Solut2 polar terut. yg dpt
membentk ik.Hidrogen terikat kuat pd adsorben-
 butuh fs gerak yg cukup polar untk mengelusinya.
 1. Kromatografi adsorpsi (c)
• Adsorben yg sering digunakan:
Nama Senyawa Urutan Polaritas
Alumina Paling polar
Karbon aktif (Charcoal)
Silika gel
Magnesium silikat
Selulosa
Resin2 polimetrik Paling non Polar
Stiren/difenil benzen)

Urutan Polaritas solut2 organik: Alkana < alkena <

aromatis < eter < ester < keton & aldehid < tiol <
amin & amida < alkohol < fenol < asam2 organik
Adsorpben dan Aplikasinya
Adsorption Energy Solutes & Solven
Strength
 Polaritas
• Ada beberapa parameter kepolaran a.l:
• 1. Momen dipol.
• 2. Index Polaritas.
• 3. Deret Eluotropik.
• 4. Konstanta dielektrik.
• 5. Elektronegativitas.
• 6. Sifat asam/basa.
Polar Functional group
 2. Kromatografi partisi
Partisi merupkn proses
sorpsi yg analog dgn
ekstraksi pelarut. Fs diam
cair diikatkan pd lapisan
tipis yg inert. Krn fs diam
diikatkan pd padatan
pendukung , mk msh
diperdebatkan apkh proses
sorpsinya merupakan
partisi murni or partisi yg
dimodifikasi, krn adsorpsi jg
mungkin terjadi
 3. Kromatografi penukar ion (a)
Pertukaran ion merupkn
proses dmn solut2 ion pd fs
gerak dpt bertukar dgn ion2
yg bermuatan sama yg terikat
scr kimiawi pd fs diam.
Pertukaran Anion:
X- + R+Y-  Y- + R+X-
Pertukaran Kation:
X+ + R+Y-  R+ + X+Y-
R= resin / polimerik
X- & X+ = solut anion & kation
 3. Kromatografi penukar ion (b)
• Pd kromatogrfi penukar anion, ion cuplikn X- akn
berkompetisi dgn ion fs gerak Y- terhadp bag
ionik pd penukar ion R,& penukar kation cuplikan
X- akn brkompetisi dgn kation fs gerak Y-.
• Pemisahan pertukaran ion sederhana didasarkn pd
perbedn kekuatn interaksi ion terlarut dgn resin.
• Jk ion terlarut berinteraksi scr lemah dgn resin
krn adanya ion pd fase gerak, mk ion terlarut akan
keluar terlebih dahulu.
• Jk ion trlarut brinteraksi scr kuat dgn resin dr
pd ion fase gerak, mk ion trlarut keluar
belakangan
 4. Kromatografi eksklusi
Eksklusi berbeda dgn
mekanisme yg lain, yaitu
pd eksklusi tdk ada
interaksi spesifik antara
solut dan fs
diampemisahan
brdasarkn pd ukuran
molekul dr fs diam.
Krom jenis ini dipengaruhi
oleh bentuk struktur dan
ukuran molekul
Berdasarkan bentuk fase diam (1)
Berdasarkan bentuk fase diam (2)
Jenis kromatografi berdasar fase gerak
Migrasi dan Retensi solut
 Volume Retensi

Jk fase diamnya zat padat VS bisa dirubah menjadi luas permukaan /

area adsorpsi atau dg kapasitas penukar ion

Persamaan VR = VM + D Vs merupakan
persamaan funddamental pd Kromatografi kolom
krn berhubungan dgn Volume retensi solut terhdp
perbandingan distribusinya.
 Retensi Relatif / Selektivitas (α)
• Nilai α, menunjukkan seberapa baik system
kromatografi dapat memisahkan 2
puncak/komponen
• TR & VR kurang tepat utk dibandingkan karena
tergantung dari cara pembuatan kolom &
kondisi percobaan
• Digunakan α, untuk menghilangkan pengaruh
variable operasional, yaitu perbandingan waktu
retensi analit dengan waktu retensi standar
(pelarut) pada kolom & percobaan yg sama.
 Tinggi Pelat (HETP)
• Hight equivalent of a theoretical
plate
• Panjang kolom yang dibutuhkan untuk
terjadinya 1x kesetimbangan
analit/solute pada fase diam & fase
gerak.
• Semakin kecil HETP semakin efisien
kolom dalam pemisahan analit.
Pada kenyataan H lebih besar drpd
teori, disebabkan 3 factor:
1. Efek perbedaan jarak (eddy
diffusion)
• Perbedaan jarak yang dilalui oleh molekul yang satu dengan
yang lain disebabkan perbedaan bentuk, ukuran partikel-
partikel pengisi kolom, cara pengisian kolom, dan diameter
dari kolom. Perbedaan ini mengakibatkan perbedaan waktu
keluarnya molekul-molekul dari kolom. Untuk memperkecil
efek ini, digunakan partikel-partikel kecil yang serba sama
tetapi tidak menyebabkan penurunan tekanan dalam kolom
terlalu tinggi, diameter kolom yang kecil, pengepakan yang
mampat dan serba sama tanpa memecahkan partikel-partikel
pengisi kolom tersebut.
2. Difusi molekul sepanjang kolom
Molekul-molekul cenderung untuk berdifusi dari daerah yang
konsentrasinya tinggi ke daerah yang konsentrasiya rendah.
Akibatnya, waktu melintasi kolom, molekul-molekul akan
menyebar (berdifusi) ke belakang dan ke depan.

3. Efek ketidaksinambungan
Aliran yang terus-menerus dari fase gerak menyebabkan
penyimpangan dari keseimbangan dimana Cs/Cm selalu lebih
kecil dari K pada tepi zona yang didepan dan selalu lebih besar
pada tepi zona yang di belakang seperti terlihat pada gambar di
atas (c). Pada partition chromatography, efek ini makin nyata
bila kekentalan fase diam makin tinggi.
 Pelat Teori (N)
• Jumlah pelat teori berhubungan
dengan panjang HETP, semakin kecil
panjang HETP maka jumlah pelat
teori akan semakin banyak, efisiensi
pemisahan kolom semakin baik &
sebaliknya.
• N = L/H
L= panjang kolom
 Resolusi (R)
• Merupakan ukuran apakah suatu
senywa terpisah secara baik atau
tidak dengan senyawa lain.
• Rji = resolusi analit I & j
• trj = waktu retensi analit j
• tri = waktu retensi analit I
• σtj = lebar puncak bawah analit j
• σti = lebar puncak bawah analit i
Nilai α berubah kecil, R berubah signifikan
Bentuk Kromatogram
 Puncak Asimetri
• Adanya puncak asimetri dpt terjadi krn bbrp hal:
• 1. Ukuran (kadar) sampel terlalu besar, shg fs
gerak tdk mampu membawa sampel dgn sempurna
 terjadi tailing.
• 2. Interaksi kuat solut dgn fs diam dpt mnyebabkn
solut sukar terelusi - dpt mnyebabkn
terbentuknya tailing.
• 3. Adanya kontaminan dlm sampel dpt muncul
terlebih dahulu shg timbul fronting ( puncak
mendahului).
 TERIMA KASIH