Hari/tanggal :

Judul pemeriksaan : Anti-HIV 1/2

Metode : Sandwich ELISA

Tujuan : Untuk mendeteksi antibodi HIV-1 dan HIV-2 dalam serum

dan plasma

Prinsip : Human anti-HIV 1 / 2 didasarkan pada teknik sandwich ELISA dari

generasi ke-3. Sumur mikrotiter telah dilapisi dengan antigen rekombinan (rAg) khusus
untuk HIV-1 (gp120, gp 41, p24, p17) dan HIV-2 (gp36), kemudian tambahkan konjugat
yang telah terikat oleh Horesadish Peroksidase (HRP). Selama inkubasi antibodi
spesifik HIV (anti-HIV-Ab: anti-HIV IgG, IgM, IgA) hadir dalam spesimen pasien dan
kontrol positif, mengikat kedua antigen rekombinan yang bergerak dan konjugat
mengakibatkan terbentuknya kompleks antigen-antibodi. Setelah langkah pencucian
guna menghilangkan adanya komponen berlebih, ditambahkan TMB/ Substrat. Warna
biru yang terbentuk berubah menjadi kuning setelah reaksi dihentikan. Intensitas warna
berbanding lurus dengan konsentrasi anti-HIV dalam spesimen.

Absorbansi kontrol dan spesimen ditentukan dengan menggunakan lempeng pembaca

ELISA atau sistem ELISA otomatis (seperti HUMAN’s HumaReader atau ELISYS line)
pada 450 nm. Hasil untuk sampel pasien diperoleh dari perbandingan dengan nilai cut-
off berdasarkan kontrol negatif.

Alat dan bahan :

 Alat :
1.Strip mikrotiter
2.Well
3.Strip perekat
4.Wadah larutan konjugat, larutan pencuci, substrat dan larutan penghenti
reaksi
 Bahan :
1. Sampel serum
2. Konjugat dan pengencer konjugat
3. Kontrol negatif
4. Kontrol positif
5. Larutan pencuci
6. Reagen Substrat A dan B
7. Larutan penghenti reaksi
8. Tissue
Prosedur Kerja :

 Prosedur pencucian
1. Dibuka strip perekat, buang isi well ke dalam 5% larutan natrium hipoklorit
dan tambahkan larutan pencuci ke masing-masing well, buang setelah
40-60 detik. Ulangi pencucian 7 kali.
2. Dalam alat pencuci otomatis dengan isi larutan pencuci. Selanjutnya cuci
strip 8 kali. Pastikan alat pencuci mengisi semua well sepenuhnya dan
buang setelah 40-60 detik. (Sisa cairan: <15 ul)
3. Setelah pencucian, buang cairan yang tersisa dengan cara tapping plate
di atas tissue.

 Skema pemipetan

Reagen dan spesimen harus berada pada suhu kamar sebelum digunakan.

Well (µl)
A1/C1 D1/E1 F1…
Langkah 1 (NC) (PC) (Sampel)
Konjugat 60 60 60
NC (Triplo) 30 - -
PC (Duplo) - 30 -
Sampel - - 30
Campurkan dengan hati-hati (larutan tampak berubah warna)
Tutup Strip Mikrotiter dengan strip perekat
Inkubasi selama 90 menit pada suhu 37 0C
Cuci 8 kali seperti yang sudah dijelaskan (lihat prosedur pencucian 1-3)
Larutan pencuci 350 350 350
Langkah 2
Substrat 100 100 100
Tutup Strip Mikrotiter dengan strip perekat
Inkubasi selama 30 menit pada suhu 18-25 0C (Larutan substrat di inkubasi dalam
tempat gelap. Larutan substrat memulai reaksi kinetik, yang diakhiri oleh larutan
penghenti)
Larutan penghenti 100 100 100
Campurkan dengan hati-hati
Absorban diukur segera dalam waktu 30 menit pada panjang gelombang 450 nm.
Setelah reaksi berakhir, gunakan panjang gelombang referensi yaitu 620 nm (jika
tersedia).
Perhitungan :

Absorbans Cut-Off
NC: NC:
A = -0,060 A = -0,069
B = -0,054 MNC= 0,061 (valid) B = -0,061 MNC= 0,062 (valid)
C = -0,068 C= -0,067

PC: PC:
D = 1,323 D = 1,384
E = 1,326 E = 1,395
MPC= 1,325 (valid) MPC= 1,389 (valid)

Sampel: Sampel:
F = 1,291 (reaktif/ positif) F = 1,371 (reaktif/positif)
G = -0,081 (non-reaktif/negatif) G = -0,076 (non-reaktif/negatif)
H = 1,276 (reaktif/positif) H = 1,362 (reaktif/positif)

COV= MNC+0,1 COV= 0,037

COV= 0,061+0,1= 0,161
COV X 0,9= 0,161 X 0,9= 0,145

Interpretasi hasil :
 MNC ≤ 0,100
 MPC ≥ 0,600

Hasil Interpretasi
A450 (spesimen) ≤ COC X 0,9 Non-reaktif
A450 (spesimen) ≥ COV Reaktif
COV X 0,9 ≤ A450 (spesimen) ≤ COV Grey zone

Kesimpulan : Berdasarkan pemeriksaan yang telah dilakukan dapat dinyatakan

bahwa sampel F dan H menunjukkan hasil Positif terhadap anti-HIV, sedangkan sampel
G menunjukkan hasil negatif.