Pemeriksaan Dengue IgM

Hari/Tanggal : Selasa,8 November 2016

Tujuan : Untuk mendeteksi adanya antibodi dengue IgM pada serum seseorang

Metode : ELISA

Prinsip : Dengue IgM ELISA didasarkan pada teknik sandwich ELISA, strip
mikrotiter sebagai fase padat dilapisi dengan Dengue-antigen (DEN-Ag),
antibodi spesifik yang sesuai (DEN-IgM-Ab) dalam spesimen pasien atau
kontrol mengikat antigen pada fase padat. , komponen yang tidak terikat
dicuci, anti-IgM konjugat (antibodi anti-IgM manusia, peroksidase
terkonjugasi) ditambahkan, yang mengikat secara khusus antibodi kelas
IgM mengakibatkan pembentukan imun komplek yang khas. pencucian
dilakukan untuk membuang kelebihan konjugat,TMB/substrat ditambahkan
Warna biru yang terbentuk akan berubah menjadi kuning setelah reaksi
berhenti. Intensitas warna berbanding lurus dengan konsentrasi DEN-IgM-
Ab dalam spesimen

Alat :
 Strip Mikrotiter
 Mikropipet & Tip
 Multichanel pipet
 Rak tabung
 Tisu
 Wadah Limbah
 Strip perekat
 Alumunum foil

Bahan :
 Kontrol positif dengue IgM
 Kontrol Negatif dengue IgM
 Buffer Pengencer
 Anti-IgM conjugate
 Larutan Pencuci
 Reagen Substrat
 Stopping solution

Sampel : Serum
Cara Kerja :
1. Reagen dan spesimen disiapkan dan harus pada suhu ruang sebelum digunakan
2. Lakukan Persiapan Sampel : Larutkan serum pasien 1 + 100 dengan DIL misalnya 10
µl serum + 1 ml DIL , campurkan semua. Untuk kontrol reagen sudah siap digunakan
3. Dimasukkan masung-masing 100 µl NC ke dalam well B1 dan C1 untuk duplo
4. Dimasukkan masing-masing 100 µl PC ke dalam well D1 dan E1 untuk duplo
5. Sampel yang sudah diencerkan dimasukan kedalam well F1 sebanyak 100 µl, jika ada
lebih dari satu sampel masukan ke well selanjutnya setelah F1 (missal : G1,H1)
6. Strip mikrotiter ditutup dengan strip perekat.
7. Kemudian di inkubasi selama 60 menit pada suhu 37⁰C
8. Setelah di inkubasi cuci 3 kali dengan cara sebagai berikut :
 Lepaskan strip perekat.Hisap keluar semua isi ke dalam 5% larutan sodium
hipoklorit dan tambahkan WASH pada masing-masing sumur,hisap semua setelah
30 detik waktu merendam dan ulangi mencuci dua kali.
 Dalam hal ini, pencuci otomatis diisi dengan WASH kemudian cuci strip sebanyak
3 kali. pastikan pencuci mengisi semua sumur sepenuhnya dan hisap semua dengan
efisien setelah 30 detik (tersisa cairan : <15 µl)
 setelah pencucian, keluarkan cairan yang tersisa dengan menekan lempeng secara
terbalik di atas kertas tisu.
9. Larutan pencuci yang ditambahkan sebanyak 300 µl.
10. Setelah pencucian selesai, konjugat ditambahkan pada tiap well kecuali pada well A1
(Blank).
11. Strip mikrotiter ditutup dengan strip perekat
12. Kemudian di inkubasi selama 30 menit pada suhu 37⁰C
13. Cuci kembali dengan cara yang sudah dijelaskan
14. Setelah pencucian selesai,tambahkan substrat ke semua well masing masing sebanyak
100 µl
15. Kemudian tutup dengan alumunium foil dan inkubasi selama 15 menit pada suhu 17-
25⁰C
16. Setelah itu tambahkan Stopping solution sebanyak 100 µl
17. Baca absorban pada panajng gelombang 450 nm sesegera mungkin atau dalam waktu
30 menit setelah berakhirnya reaksi, gunakan panjang gelombang referensi dari 630-
690 nm jika tersedia.

Uji coba dianggap valid apabila memenuhi kriteria sebagai berikut:

1. Substrat blank di dalam well A1 < 0.100
2. MNC  0.300
3. PC: nilai absorbans sama atau lebih besar dari nilai cutt off

Cut-off value (COV) = MNC + 0.35

Interpretasi Hasil :
Sampel dianggap POSITIF jika nilai absorbans lebih tinggi dari 10% di atas nilai cut-off.
Sampel dengan nilai absorbansi 10% di atas atau di bawah cut-off tidak dapat dianggap
sebagai positif atau negatif dengan jelas – ZONA ABU-ABU.
Sampel dianggap NEGATIF jika nilai absorbansi lebih rendah dari 10% di bawah nilai cut-
off.
A450 (pasien) ≥COV + 10% : anti-DEN-IgM-Ab-positif
A450 (pasien) ≤ COV – 10% :anti-DEN-IgM-Ab-negatif

Hasil Pemeriksaan :

Well :

A  Blanko
B
C Negatif Control (NC)
D
E Positif Control (PC)
F
G Sampel 1,2,3
H

Perhitungan :
-0.101 < 0.100  valid
0.257+0.929
MNC =
2
= 0.196
= 0.196 ≤ 0.300  Valid

COV = 0.196 + 0.35

= 0.546

PC1 = 0.929 ≥ 0.546  Valid

PC2 = 0.947 ≥ 0.546  Valid

Hasil :
10 % COV : 0.0546
+ 10% COV : 0.546 + 0.0546 = 0.6006  Abs. ≥ 0.6006 (Positif)
− 10% COV : 0.546 – 0.0546 = 0.4914  Abs. ≤ 0.4914 (Negatif)

Absorbans sampel 1 : 0.421 ≤ 0.4914  Negatif

Absorbans sampel 2 : 0.096 ≤ 0.4914  Negatif
Absorbans sampel 3 : 0.092 ≤ 0.0914  Negatif

Kesimpulan : Berdasarkan hasil pemeriksaan antibodi dengue IgM pasien pada sampel 1,2,
dan 3 menunjukan hasil negatif dan hasil yang didapatkan dinyatakan valid.