TUGAS MAKALAH BIOMOL

“ELEKTROFORESIS GEL AGAROSA DAN

AMPLIFIKASI DNA DENGAN REAL TIME PCR ”

Dosen : Nurminha, S.Pd.,M.Sc

Pembimbing : Wimba widagdho dinutanayo,S.ST,M.Sc
Disusun Oleh:
1. Wulan Ratnasari 1713353004
2. Egia Vaneha Laina 1713353021
3. Ilu Sulfihat Parawansa 1713353008
4. Noventa Silia Putri 1713353022
5. M.Merayu Sukma 1713353039
6. Dwi Prahesti 1713353049
7. Khansa Yoan Abesha 1713353042
8. Fitria Intan Sari 1713353018
9. Melda Lestari 1713353037
10.Halimatuzzuhairoh 1713353013
11.Pungky Dian Pratiwi 1713353020
12. Al Ikhsan 1713353019

POLITEKNIK KESEHATAN TANJUNG KARANG

PRODI SARJANA TERAPAN TEKNOLOGI LABORATORIUM MEDIK
2019/2020
 PEMBAGIAN TUGAS KELOMPOK

Nama Mahasiswa NIM Tugas

Wulan Ratnasari 1713353004 Perhitungan
Egia Vaneha Laina 1713353021 Perhitungan
Ilu SulfihatParawansa 1713353008 Cara kerja
Noventa Silia Putri 1713353022 Dasar teori
M.Merayu Sukma 1713353039 Alat & Bahan
Dwi Prahesti 1713353049 Dasar teori
KhansaYoanAbesha 1713353042 Pemeriksaan & Tujuan
Fitria Intan Sari 1713353018 Cover & Kata
pengantar
Melda Lestari 1713353037 Editing
Halimatuzzuhairoh 1713353013 Editing
Pungky Dian Pratiwi 1713353020 Cara kerja
Al Ikhsan 1713353019 Metode & prinsip
 KATA PENGANTAR

Alhamdulillah, segala puji dan syukur bagi Allah SWT yang telah memberikan
kemampuan, kekuatan, serta keberkahan, baik waktu, tenaga, maupun pikiran kepada penulis
sehingga dapat menyelesaikan makalah yang berjudul “Aglutinasi Dan Netralisasi” tepat
pada waktunya.
Dalam makalah ini berisi tentang apa sebenarnya tujuan dan manfaat pemeriksaan
antigen – antibodi, dan bagaimana penerapan aglutinasi dan netralisasi pada pemeriksaan
virus, serta hal-hal yang perlu diperhatikan dalam pemeriksaan.
Dalam penyusunan makalah ini, penulis banyak mendapat tantangan dan hambatan
akan tetapi dengan bantuan dari berbagai pihak tantangan itu bisa teratasi. Oleh karena itu,
penulis mengucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada dosen kami atas
pengarahan dan kemudahan yang telah diberikan kepada penulis dalam pengerjaan makalah
ini.
Penulis menyadari bahwa masih banyak kekurangan pada penulisan makalah ini.
Maka dari itu, saran dan kritik yang membangun sangat penulis harapkan dari pembaca
sekalian. Penulis berharap semoga makalah ini dapat bermanfaat bagi siapa saja yang
membacanya.

Bandar Lampung, 22 Mei 2020

Penulis
 DAFTAR ISI
HALAMAN JUDUL...............................................................................................................
KATA PENGANTAR.............................................................................................................
DAFTAR ISI
1. ELEKTROFORESIS GEL AGAR ROSA..........................................................................
1.1 NAMA PEMERIKSAAN DAN TUJUAN.....................................................
1.2 METODE DAN PRINSIP...............................................................................
1.3 DASAR TEORI...............................................................................................
1.4 ALAT DAN BAHAN......................................................................................
1.5 CARA KERJA.................................................................................................
1.6 PERHITUNGAN.............................................................................................
1.7 DAFTAR PUSTAKA......................................................................................

2. AMPLIFIKASI DNA DENGAN REAL TIME PCR.........................................................

2.1 NAMA PEMERIKSAAN DAN TUJUAN......................................................
2.2 METODE DAN PRINSIP...............................................................................
2.3 DASAR TEORI...............................................................................................
2.4 ALAT DAN BAHAN......................................................................................
2.5 CARA KERJA.................................................................................................
2.6 PERHITUNGAN.............................................................................................
2.7 DAFTAR PUSTAKA......................................................................................
 1. ELEKTROFORESIS-GEL AGAROSA

1.1 Nama pemeriksaan dan Tujuan

A. Nama Periksaan
Penggunaan Elektroforesis Gel Adarosa Pada Pemriksaan.
B. Tujuan
1. Memahami dan melakukan teknik pemisahan senyawa dengan metode elektroforesis.
2. Mengetahui cara mengukur fragmen DNA.
3. Mengetahui molekul protein bermigrasi pada medium padat/gel yang direndam
dengan suatu larutan penyangga di bawah pengaruh medan listrik.
4. Dapatmembandingkan gen homolog darispesies yang berbeda.
5. Menganalisa fragmen DNA yang diamplifikasi melalui PCR.
6. Mengetahui teknik paling baik yang dibuat dan secara rutin digunakan di
laboratorium klinis untuk analisis protein dan DNA pada berbagai cairan biologis.
7. Mengetahui aktivitas gen selama perkembangan berbagai tipe sel organisme atau
aktivitas gen sebelum dan sesudah diberi perlakuan tertentu.
8. Konsentrasi yang rendah pada gel agarosa memberikan resolusi yang lebih baik
untuk fragmen besar.
9. Mengetahui letak DNA pada gel dapat dilihat melalui pewarnaan gel dengan
senyawa etidium bromida.
10. Cara yang paling akurat untuk menentukan ukuran fragmen-fragmen melalui
hubungan matematik antara kecepatan migrasi dan ukuran pasangan basa.
11. Mengetahui langkah-langkah DNA yang dapat diisolasi dari setiap bagian makhluk
hidup yang mengandung nukleus/inti sel.

1.2 Metode dan Prinsip

A. Metode
(Elektroforesis melalui gel agarosa) yang digunakan untuk memisahkan protein,
DNA,RNA.
B. Prinsip
Prinsip kerja elektroforesis gel dimulai saat molekul yang bermuatan listrik
ditempatkan pada medium berisi tenaga listrik.  Molekul yang digunakan dalam
praktikum elektroforesis adalah molekul DNA yang bermuatan negatif.  Molekul akan
bermigrasi menuju kutub positif atau kutub negatif berdasarkan muatan yang terkandung
di dalamnya.  Molekul-molekul yang bermuatan negatif (anion) akan bergerak menuju
kutub positif (anoda), sedangkan molekul-molekul yang bermuatan positif (kation) akan
bergerak menuju kutub negatif (katoda) DNA memiliki muatan negatif karena
mengandung gugus O. Oleh karena itu, arah migrasi DNA adalah dari kutub negatif ke
kutub positif (Kusuma,2010)
1.3 Dasar Teori
Elektroforesis merupakan suatu metode pemisahan molekul yang menggunakan
medan listrik (elektro) sebagai penggerak molekul dari matriks penyangga berpori (foresis).
Metode ini sangat umum digunakan untuk memisahkan molekul yang bermuatan atau dibuat
bermuatan (Fatchiyah, 2011). Teknik ini dapat digunakan untuk memanfaatkan muatan listrik
yang ada pada molekul misalnya DNA yang bersifat negatif. Molekul yang dapat dipisahkan
antara lain DNA, RNA, atau protein. Jika suatu molekul yang bermuatan negatif dilewatkan
melalui suatu medium, misalnya gel agarosa, kemudian dialiri aurs listrik dari satu kutub ke
kutub yang berlawanan muatannya, maka molekul tersebut akan bergerak dari kutub negatif
ke kutub positif (Yuwono, T., 2005).
Elektroforesis gel agarosa adalah teknik paling baik yang pernah dibuat dan secara
rutin digunakan di laboratorium klinis untuk analisis protein dan DNA pada berbagai cairan
biologis (serum, urin, CSF). Teknik ini merupakan teknik yang menggunakan prinsip
elektroforesis zona. Seperti yang diketahui, molekul protein bermigrasi pada medium
padat/gel yang direndam dengan suatu larutan penyangga di bawah pengaruh medan listrik.
Migrasi ini tergantung pada muatan listrik, titik isoelektrik bersih dan massa molekul protein
(Jean and Francois G., 2010).
Elektroforesis DNA umumnya menggunakan metode elektroforesis gel agarosa.
Elektroforesis DNA dilakukan misalnya untuk menganalisis fragmen-fragmen DNA hasil
pemotongan dengan enzim restriksi. Fragmen molekul DNA yang telah dipotong-potong
dapat ditentukan ukurannya dengan cara membuat gel agarosa, yaitu bahan semi-padat
berupa polisakarida yang diekstraksi dari rumput laut. Gel agarosa dibuat dengan
melarutkannya dalam suatu buffer. Agar dapat larut dengan baik, pelarutannya dibantu
dengan pemanasan hingga gel agarosa dalam keadaan cair sehingga mudah dituang ke atas
lempeng, dan sebelum mendingin dibuat sumuran dengan menggunakan perspex menyerupai
sisir yang ditancapkan pada salah satu ujung gel yang masih cair. Sehingga ketika gel
memadat, terbentuklah sumuran-sumuran kecil. Kedalam sumuran inilah nantinya molekul
DNA dimasukkan (Yuwono, T., 2005).
 Agarosa merupakan polisakarida yang terdiri dari unit agarobiosa. Konsentrasi
agarosa yang biasa digunakan antara 1-3%. Ukuran pori gel bergantung pada konsentrasi
agarose, semakin tinggi konsentrasi agarosa maka semakin kecil ukuran pori. Sebaliknya,
semakin rendah konsentrasi agarosa maka semakin besar ukuran pori. Agarosa juga
mengandung sulfat, semakin rendah konsentrasi sulfat maka semakin murni agarosa.
Keuntungan menggunakan agarosa adalah agarosa leleh pada suhu yang rendah (62-65°)
(Wilson & Walker, 2010).
Elektroforesis dibedakan menjadi 2 tipe yakni elektroforesis vertikal dan horizontal.
Elektroforesis vertikal digunakan untuk analisis pita DNA dan protein. Elektroforesis
horizontal digunakan untuk analisis pita DNA dan RNA (Westermeier, 2005). Elektroforesis
vertikal umumnya dilakukan menggunakan gel akrilamida, sedangkan elektroforesis vertikal
dilakukan menggunakan gel agarose (Maftuchah dkk., 2014). Ada tiga jenis gel yang dapat
digunakan dalam elektroforesis dna yaitu gel poliakrilamida denaturasi, gel alkalin agarosa
dan gel agarose formaldehid (Davis dkk., 1994). Gel agarose adalah suatu bahan semi padat
berupa polisakarida yang diekstraksi dari rumput laut. Penggunaan gel agarose dilakukan
dengan melarutkannya menggunakan buffer, yang dibantu melalui pemanasan (Yuwono,
2008). Karakteristik gel agarose yang umumnya digunakan adalah ukuran pori 150 nm
dengan konsentrasi 1% (Westemeier, 2005).
Laju migrasi DNA dapat dipengaruhi oleh 2 faktor yakni ukuran molekul DNA dan
konsentrasi agarose (Ardhana, 2011). Tris-Acetate-EDTA (TAE) buffer merupakan larutan
buffer sebagai pelarut gel agorose dalam proses elektroforesis. TAE buffer berfungsi sebagai
penghantar listrik sehingga fragmen DNA dapat bermigrasi di dalam gel agarose.
Penyimpanan optimum TAE buffer ini pada suhu 4-25oC (Ardhana, 2011).
Red safe DNA gel stain merupakan alternatif pewarna gel agarose pengganti
penggunaan pewarna ethidium bromide yang dapat digunakan untuk DNA atau RNA. dengan
penyimpanan suhu ruang. Pewarna 22 red safe memiliki tingkat sensitivitas yang tinggi
seperti ethidium bromide, namun pewarna ini tidak bersifat karsinogenik (Intron
Biotechnology, 2017). Molekul DNA yang berukuran kecil akan lebih mudah melalui matriks
dibandingkan dengan molekul DNA yang berukuran besar, sehingga molekul DNA yang
berukuran kecil memiliki laju migrasi yang lebih cepat. Konsentrasi agarose digunakan untuk
menentukan besarnya matriks yang dapat memisahkan fragmen DNA. Semakin rendah
konsentrasi agarose yang digunakan, maka akan semakin rendah matriks gel agarose, dan
fragmen DNA akan terpisah semakin jauh. Penggunaan konsentrasi agarose dalam
menentukan ukuran molekul DNA yang akan dipisahkan, dapat dilihat pada Tabel 2
(Ardhana, 2011).

Tabel 1. Konsentrasi Agarose dan Ukuran Molekul DNA (Ardhana, 2011).

N Konsentrasi Gel Agarose Efisiensi range pemisahan

o (%) pada DNA liner (kb)

1. 0,3 60 – 5

2. 0,6 20 – 1

3. 0,7 10 – 0,8

4. 0,9 7 – 0,5

5. 1,2 6 – 0,4

6. 1,5 4 – 0,2

7. 2,0 3 – 0,1

Manfaat elektroforesis gel antara lain:

a. Untuk mengetahui ukuran fragmen DNA dari produk PCR
b. Memisahkan produk DNA dari hasil digesti yang berbeda ukuran, lalu dapat
disequencing
c. Untuk pemurnian atau purifikasi DNA. 
Elektroforesis dapat diaplikasikan untuk berbagai macam kegiatan, antara lain:
a. Membandingkan gen homolog dari spesies yang berbeda
b. Mengetahui susunan sekuens berbagai genom, DNA finger printing
c. Mengetahui ada atau tidaknya gen-gen penyebab kelainan genetik atau penyakit
tertentu
d. Mendeteksi lokasi dan jumlah mRNA dalam sel atau jaringan tertentu
e. Mengetahui aktivitas gen selama perkembangan berbagai tipe sel organisme atau
aktivitas gen sebelum dan sesudah diberi perlakuan tertentu
f. Mempelajari evolusi di tingkat molecular
g. Mengetahui variasi genetik dalam populasi natural di alam
h. Menentukan atau mengidentifikasi berat molekul fragmen DNA, RNA, protein dan
aktivitas enzimatik
i. Menganalisa fragmen DNA yang diamplifikasi melalui PCR
 j. Mengidentifikasi persamaan dan perbedaan genetik antar individu
k. Menentukan jumlah fragmen DNA yang diklon dalam rekombinan plasmid DNA
(Russell, 1994; Fairbanks and Andersen, 1999).

Kekurangan elektroforesis gel yaitu:

Pada deteksi atau identifikasi amplikon. Penggunaan elektroforesis gel ini dirasakan
kurang efisien karena lama pengerjaannya dan terbatasnya jumlah sampel yang dapat
diperiksa. Disamping itu, kadang kadang hasil PCR dalam gel muncul pita yang tidak
berbentuk (ghost atau smeary bands) atau pita yang terlampau banyak sehingga hasilnya sulit
diinterpretasikan (Tarigan, 2011).
 Gambar. Tahapan Elektroforesis.
A) Pemasangan sisir pada cetakan gel agarosa
B) Menuangkan larutan agarosa yang cair setelah pemanasan
C) setelah permukaan gel padat, sisir diangkat
D) setelah ditambahkan dengan larutan TBE, masukkan DNA sampel pada setiap
sumuran
E) menghidupkan mesin elektroforesis dengan waktu, set voltase dan arah migrasi
yang telah ditetapkan
F) hasil dari elektroforesis
G) hasil elektroforesis setelah diamati dengan UV illuminator (Sumber: Hartwell, et.
al., 2011)

Gel poliakrilamid dibentuk dari polimer akrilamid CH2=CH-C(O=)-NH2 dengan

suatu cross-linking agent yaitu N, N’-methylene bisakrilamid atau CH2=CH-C(=O)-NH-
CH2-NHC(=O)CH=CH2. Polimerisasi ini dikatalis oleh amonium persulfat atau riboflavin
yang dapat menghasilkan radikal bebas (Gambar 5). Pembentukan radikal bebas dari
amonium persulfat dikatalis oleh N, N, N’,N’,-tetramethyl-ethylenediamine (TEMED),
sedangkan radikal bebas dari riboflavin terbentuk dengan bantuan cahaya.

Konsentrasi gel akrilamid yang rendah memiliki ukuran pori yang besar sedangkan
konsentrasi gel akrilamid yang tinggi memiliki ukuran pori yang kecil. Konsentrasi gel
akrilamid yang rendah juga digunakan untuk pemisahan DNA (Wilson & Walker, 2010).
 Molekul DNA mempunyai muatan listrik negatif, sehingga bila ditempatkan pada
medan listrik akan berminggrasi menuju kutub positif. Tetapi kebanyak molekul DMA
mempunyai bentuk dan muatan listrik yang hampir sama sehingga fragmen-fragmen dengan
ukuran yang berbeda tidak terpisahkan olek elektroforesis biasa.Tetapi ukuran molekul DNA
merupakan suatu faktor pemisahan jika elektroforesis dikerjakan dalam suatu gel. Gel yang
dibuat dari agarosa, poliakrilamid atau campuran keduanya akan membentuk kerangka pori-
pori yang kompleks untuk dilewati molekul DNA menuju elektroda positif. Makin kecil
molekul DNA makin cepat migrasinya melwati gel, sehingga molekul DNA akan terpisah
berdasarkn ukurannya. ( Sambrook, et al, dalam T.Milanda 1994)
Gel agarosa dan poloakrilamid dapat dibuat dengan berbagai bentuk, ukuran,
porositas serta dijalankan dalam berbagai konfigurasi. Kemampuan pemisahan gel agarosa
lebih rendah dibanding gel poliakrilamid tetapi penangananya lebih mudah. Selain itu DNA
yang berukuran sekitar 2 pb sampai 50 kb dapat dipisahkan dalam berbagai konsentrasi gel
agarosa. ( Sambrook, et al, dalam T.Milanda 1994)
Ada tiga jenis gel yang dapat digunakan dalam elektroforesis DNA, yaitu:
1. Gel poliakrilamida denaturasi, berfungsi untuk memurnikan penanda oligonukleotida dan
menganalisis hasil ekstensi primer.
2. Gel alkalin agarosa, berfungsi untuk memisahkan rantai DNA yang berukuran besar.
3. Gel agarose formaldehid denaturasi, berfungsi untuk menyediakan sistem elektroforesis
yang digunakan untuk fraksi RNA pada ukuran standar(Davis dkk. 1994).

Gel agarosa digunakan untuk memisahkan fragmen DNA yang lebih besar (lebih dari
200 bp) dan gel poliakrilamida digunakan untuk fragmen kecil (kurang dari 200 bp). Jarak
antara dua fragmen DNA yang berbeda ukuran dapat ditentukan berdasarkan konsentrasi
matriks agarose. Mobilitas/pergerakan DNA relatif tergantung pada faktor-faktor tertentu,
terutama pada konsentrasi agarosa dalam gel, kekuatan arus yang digunakan, kekuatan ionik
dari larutan buffer, dan konformasi fragmen DNA itu sendiri. Molekul DNA bermigrasi
melalui pori-pori kecil yang terbentuk dalam padatan gel agarosa. Secara umum, molekul
yang lebih kecil bergerak lebih cepat dan bermigrasi lebih jauh dari molekul kecil karena
memiliki gesekan yang lebih rendah saat bergerak menuju elektroda positif. Konsentrasi yang
rendah pada gel agarosa memberikan resolusi yang lebih baik untuk fragmen besar, dengan
memberikan pemisahan yang lebih besar antara band yang secara ukuran tidak terlalu jauh
berbeda. Konsentrasi gel yang lebih tinggi, di sisi lain, dapat mengurangi kecepatan migrasi
fragmen panjang yang sementara itu dapat memfasilitasi pemisahan yang lebih baik pada
fragmen DNA kecil (Lee & Bahaman, 2010).

Namun, fragmen yang lebih besar dapat bermigrasi secara lebih cepat daripada
fragmen yang lebih kecil, karena tegangan pada gel yang ditingkatkan. Selain itu, DNA
memiliki muatan yang konsisten untuk rasio massa, sehingga ukuran molekul DNA
merupakan faktor utama yang mempengaruhi migrasi melalui matriks gel. Terlepas dari
kenyataan bahwa penerapan tegangan tinggi dapat meningkatkan kecepatan migrasi fragmen
DNA, tetapi juga dapat menurunkan resolusi pemisahan (di atas sekitar 5 sampai 8 V/cm).
Untuk alasan itu, resolusi terbaik dari fragmen yang lebih besar dari 2 kb dicapai dengan
menerapkan tidak lebih dari 5 V/cm pada gel (Lee & Bahaman, 2010).

Elektroforesis gel memiliki beberapa komponen yang terdiri dari: 

 Gambar.komponen penting elektroforesis gel agarosa
1. Alatnya (tank): di alat ini bakal ada gelnya, tempat buat colok kabel-kabelnya, sama
nanti tempat ini bakal keisi buffer.
2. Power supply: alat ini sebagai sumber pemberi listrik yang bakal ngatur berapa lama
kita mau melakukan elektroforesis, sama voltase yang mau dipakai.
3. Gel: Gel ini bisa terbuat dari Agarose atau bahan lainnya. Agarose yang biasa dipakai
bisa diatur besar-kecil porinya, dengan menentukan konsentrasi. Biasanya 1% tapi kalau
makin kecil, maka resolusi pemisahannya semakin baik.
4. Buffer TAE: tersusun atas Tris, EDTA dan acetic acid. Makanya bau asem. Fungsi
buffer ini untuk menjaga kondisi pH, serta karena ada ion-ionnya tentu memungkinkan
adany aliran listrik. EDTA berfungsi untuk mengikat Ca2+ yang menjadi kofaktor bagi
enzim nuclease. Jadi enzim nuclease jadi tidak aktif dan tidak berpotensi merusak sampel
kita.
5. Loading Dye. Jadi sebelum kita masukin DNA kita di well, butuh suatu komponen
yang namanya Loading Dye (LD). LD ini menngandung pemberat berupa senyawa yang
memiliki massa jenis tinggi, supaya pas kita masukin DNA ke dalam sumur, DNAnya
bisa tenggelam di sumur, gak ngapung ke mana-mana. Di LD juga ada pewarna. Yang
perlu diperhatikan adalah, pewarna ini tidak menempel dan mewarnai DNA. Karena
DNA gak berwarna, kita harus tau kapan mematikan alat elektroforesis kalo gak nanti
udah kebablasan, makanya si LD memberika tanda warna biru yang menandakan dia
udah gerak sampai mana. Sekali lagi, warna LD bukan warna DNA-nya.
6. Gel-Red. Nah, gel-red adalah senyawa interkalator DNA yang mengikat pada basa
nitrogen DNA. Ketika diberi sinar UV di mesin illuminator, maka gel-red yang mengikat
DNA ini bisa berpendar jadi warna merah. Gel-Red juga ditambahkan sebelum masukkin
DNA ke well.
Setelah diberikan penyinaran UV, maka akan berubah menjadi berwarna. Akan tetapi
loading Dye tidak berwarna .
 Gambar DNA dengan Gel Red setelah penyinaran UV

Letak DNA pada gel dapat dilihat melalui pewarnaan gel dengan senyawa etidium
bromida. Pewarnaan ini menghasilkan pita-pita yang yang paling tidak mengandung 1-10 ng
DNA, yang dapat dideteksi dibawah cahaya UV.
Etidium bromida, merupakan zat warna berfluoresensi yang dapat terikat diantara
pasangan basa dan membuat molekul DNA lebih kaku. Ikatan yang terbentuk akan
meningkatkan intensitas fluoresensi dari zat warna bebasnya. ( Sambrook, et al, dalam
T.Milanda 1994).
Elektroforesis gel akan memisahkan molekul DNA dengan ukuran yang berbeda,
yaitu molekul yang paling kecil akan melewati jarak yang paling besar menuju elektroda
positif. Jika ada beberapa fragmen DNA dengan ukuran berbeda, maka tampak rangkaian
pita-pita pada gel. Ukuran DNA hasil elektroforesis gel dapat diperkirakan dengan
menggunakan marka DNA yang telah diketahui ukurannya
Cara yang paling akurat untuk menentukan ukuran fragmen-fragmen tersebut adalah
melalu hubungan matematik antara kecepatan migrasi dan ukuran pasangan basa.
Persamaanya adalah sebagai berikut :
Log pb = bx + a
Dimana x adalah jarak migrasi, pb adalah jumlah pasangan basa, a serta b adalah
konstanta yang tergantung pada kondisi elektroforesis. ( Sambrook, et al, dalam T.Milanda
1994)
DNA dapat diisolasi dari setiap bagian makhluk hidup yang mengandung nukleus/inti
sel, dengan langkah-langkah berikut :
1. Pengumpulan/panen sel-sel (cell harvest)
2. Pemecahan sel-sel (cell lysis)
3. Pencernaan protein agar asam nukleat dilepaskan (protein digestion)
 4. Pengendapan DNA (DNA precipitation)
(Nita Andriani Lubis dan Fery Prawira Gurusinga,2013)
Setiap sel manusia mengandung banyak protein sebagai protein sitoplasmik, dan
protein membran. Protein ini dapat diisolasi dengan teknik sentrifugasi dan teknik biokimia
umum yang lain untuk dianalisis.
Agarosa merupakan polisakarida turunan yang didapat dari alga merah. Gel Agarosa
dapat digunakan untuk memisahkan DNA berukuran lebih dari 100 bp, sedangkan untuk
memisahkan DNA dengan ukuran lebih pendek dapat digunakan gel poliakrilamid. Gel
agarosa merupakan fase diam dalam pemisahan framen DNA dan muatan listrik sebagai fase
geraknya. (Nita Andriani Lubis dan Fery Prawira Gurusinga,2013)
Hasil DNA elektroforesis agarosa dapat dilihat migrasi elektroforesis DNA melalui
gel agarosa dipengaruhi oleh faktor ukuran dan konformasi molekul DNA, konsentrasi
agarosa, arus listrik dan temperature. Etidium bromida sebagai pewarna fluorecent digunakan
untuk alat identifikasi dan mengukur semi-kualitatif fragmen DNA yang terseparasi dalam
gel. Etidium bromida ini akan terikat diantara dua untai ganda DNA, sehingga band/pita
DNA dalam gel agarosa akan berpedar, karena pewarna ini mengandung zat fluorecent.
Etidium bromida dapat diberikan pada setiap sampel yang akan dimasukkan kesumuran gel
atau dicampurkan ke gel agarosa sebelum gel dicetak dalam cetakan gel, intensitas fluorecent
dapat diukur dengan menggunakan DNA marker standar, sehingga dapat diperkiralan
kuantitas DNAnya. (Nita Andriani Lubis dan Fery Prawira Gurusinga,2013)

1.4 Alat & Bahan

ALAT
 Satu set alat elektroforesis
 Mikropipet dan tip
 Gel Doc
 Power Supply
 Parafilm
 Erlenmayer
 Selotip

BAHAN
 DNA Marker
 Produk DNA
 Ethidium Bromide (EtBr)
 TBE
 Gel Agarose
 Loading Buffer (Loading dye)
 Buffer Tri-Asetat-EDTA (TAE)
 Aquadest
1.5 Cara Kerja

1. pertama-tama membuat 250 mL larutan TBE 1x dengan cara mencampurkan 5 mL

TBE 50x ke dalam 245 mL akuades.
2. Selanjutnya pembuatan gel agarosa 1% dengan menimbang agarosa 0,2 gram
untuk dilarutkan ke dalam 20 mL larutan TBE 1x dan dididihkan hingga larut
sempurna.
3. Kemudian baki elektroforesis disiapkan, tiap ujung baki dilekatkan selotip
(pastikan tidak ada lubang pada masing-masing ujung baki).
4. Sisir elektroforesis dipasang pada salah satu ujung baki dengan posisi hamper
menyentuh dasar baki.
5. Suhu larutan agarosa diperiksa dengan cara menempelkan Erlenmeyer ke tangan
(jika suhunya sudah turun sekitar 60ºC, larutan agarosa dituang ke dalam baki
elektroforesis dan dibiarkan hingga memadat).
6. Lalu sisir diambil dengan hati-hati dan selotip dilepaskan dari ujung-ujung baki.
Baki yang telah berisi gel agarosa dimasukkan ke dalam tangka elektroforesis
yang telah diisi dengan sisa larutan TBE 1x (gel terendam seluruhnya dalam TBE).
7. Sekitar 5 cm kertas parafilm disiapkan di dekat tangki elektroforesis. Setelah itu
10 µL sampel DNA sampel dan 2 µL loading dye 6x ke dalam sumuran gel dengan
mencampurkan kedua bahan tersebut terlebih dahulu secara merata pada kertas
parafilm.
8. Catatan mengenai nomor sumuran dibuat dan jenis sampel DNA yang dimasukkan.
Kabel dari sumber arus dihubungkan ke tangki elektroforesis (pastikan kabel yang
tersambungkan ke kutub negatif berada di dekat sumuran, sedangkan kabel yang
tersambung ke kutub positif berada jauh dari sumuran, jika tidak posisi baki/gel
diubah kearah sebaliknya).
9. Selanjutnya sumber arus dinyalakan, voltase dan waktu running diatur hingga 2
diperoleh angka 70 V dan 20 menit, lalu elektroforesis dijalankan (dilakukan
running) dengan cara menekan tombol run pada sumber arus.
10. Elektroforesis akan berhenti apabila waktu
sudah habis, sumber arus dimatikan dan baki
diangkat dari tangka elektroforesis. Dengan
menggunakan sarung tangan, gel agarosa
dimasukkan ke dalam larutan EtBr selama 2
menit. Kemudian gel dikeluarkan dan diletakkan
di atas UV transiluminator dan dinyalakan 1
alatnya, lalu amati pita-pita DNA yang
tervisualisasi.

Perhatian:
Jangan menyentuh gel/buffer dalain tangki
elektrotoresis bila sumber arus sedang
menyala. Keterangan gambar:
3
1. Gel agarosa
2. Sumuran
3. Marker
1.6 Perhitungan

Pada Prinsipnya, Elektroforesis gel agarosa adalah metode yang biasa digunakan
untuk memisahkan protein, DNA atau RNA. Molekul asam nukleat adalah ukuran yang
dipisahkan oleh bantuan medan listrik tempat molekul bermuatan negatif bermigrasi ke kutub
anoda (positif). Aliran migrasi ditentukan oleh berat molekul. Molekul kecil bermigrasi lebih
cepat daripada molekul yang lebih besar. Selain pemisahan ukuran, fraksinasi asam nukleat
menggunakan elektroforesis gel agarosa dapat menjadi langkah awal untuk pemurnian DNA
untuk menghasilkan suatu pita. Pteknik Pemurnian DNA termasuk memotong "band" yang
diinginkan dari gen target dapat dilihat dengan transilluminator UV. (Magdeldin,2012)

Cara Pembacaan:
Garis DNA pada gel didefinisikan sebagai “Band” atau pita. Setiap band berisi
sejumlah besar fragmen DNA dengan ukuran yang sama yang semuanya telah bermigrasi ke
posisi yang sama. Sebuah fragmen DNA tunggal (atau bahkan sekelompok kecil fragmen
DNA) tidak akan terlihat dengan sendirinya pada gel.Dengan membandingkan band dalam
sampel dengan tangga DNA, kita dapat menentukan perkiraan ukurannya. (Khan Academy,
2016)
CONTOH. Pita terang pada gel ini kira-kira berukuran 700 pasangan basa (bp). Empat jalur
diberi nomor pada gel.

Dalam gel DNA, fragmen DNA terpanjang bermigrasi paling lambat melalui gel dan
tinggal paling dekat dengan sumur (di mana awalnya dimuat ke dalam gel). Fragmen DNA
terpendek bermigrasi paling cepat melalui gel dan mendapatkan yang paling dekat ke
ujungnya (jauh dari sumur).(Khan Academy,2016)
Pita yang mewakili fragmen terpanjang akan paling dekat dengan bagian atas gel.
Band ini ditemukan di jalur 1.Demikian pula, pita yang mewakili fragmen terpendek akan
paling dekat dengan bagian bawah gel. Band ini ditemukan di jalur 2.Pembacaan dapat
menggunakan tangga DNA (di jalur paling kiri) untuk mencari tahu jalur mana yang
mengandung banddengan ukuran tertentu. Jika kita melacak band 1500 bp, maka tangga
DNA yang tepat adalah di jalur 3. (Khan Academy,2016)

CONTOH LAIN

Jurnal : Deteksi dan Penentuan Virus Dengue dari Spsesimen Klinik di Rumah Sakit
Kota Medan dengan Menggunakan Metode Reverse Transcriptase Polymerase Chain
Reaction (RT-PCR)

Gel dipersiapkan dengan menggunakan 50ml 1XTAE buffer, 2% agarose gel dan 5µl
SYBER safe-TM gel staining. Sebanyak 1µl amplifikat hasil PCR yang telah dicampur
dengan 4µl blue juice 2x.. Elektroforesis dijalankan dari kutub negatif ke positif dengan
tegangan 80-100 V, selama 40 menit. Gel dilihat dengan iluminator UV (Vilber Lourmat),
dan hasilnya difoto dengan kamera polaroid. Virus DEN-1 akan terbaca dengan adanya pita
DNA berukuran 482 bp DEN-2 berukuran 119 bp, DEN-3 berukuran 290 bp dan DEN-4
berukuran 398 bp (Kusumawati,dkk, 2009)

Gambar di bawah ini menunjukkan hasil kontrol positif virus DEN-1, DEN-2, DEN3 dan
DEN-4 sebagai berik
Keterangan:
a. Lajur1 :kontrol (+) DEN-2 119 bp
b. Lajur 2: kontrol (+) DEN-3 290 bp
c. Lajur 3: kontrol (+) DEN-4 398 bp
d. Lajur 4: kontrol (+) DEN-1 482 bp
e. Lajur 5: Marker 100 bp DNA ladder

Gambar dibawah ini menunjukkan hasil RT-PCR penderita akut DD/DBD sebagai berikut:

Keterangan:
a. Lajur 1: Marker 100 bp DNA ladder
b. Lajur 2: Kontrol negatif
c. Lajur 3: Kontrol positif Den-1 (482 bp)
d. Lajur 4: Kontrol positif Den-1(482 bp)
e. Lajur 5: Sampel no 40, positif DEN-1 (482 bp)
f. Lajur 6: Sampel no 79, positif DEN-1 (482 bp)
g. Lajur 7: Kontrol positif DEN-2 (119 bp)
h. Lajur 8 sampai 14: Sampel no 2,9,10,11,12,13,14 positif DEN-2 (119 bp)

Dari seratus sampel serum didapatkan adanya hasil positif virus Dengue serotype 2
dan Dengue serotype 1 yang ditandai dengan dijumpainya pita DNA dengan ukuran hasil
amplifikasi sebesar 119 bp (dengue-2) dan 482 bp (dengue-1) sedangkan untuk virus Dengue
serotype 3 dan 4 yang ditandai dengan pita DNA dengan ukuran hasil amplifikasi sebesar
290 bp (dengue-3) dan 389 bp (dengue-4), tidak ada dijumpai dari hasil deteksi dengan teknik
RT-PCR dalam penelitian ini. (Kusumawati,dkk, 2009)
1.7 Daftar pustaka :

1. Birren,B.. Green.E.D., Klapholz,S., Myers,R..H., Riethman.H. & Roskams.J. (1999)

Genome Analysis. a Laboratory Manual. Cold Spring Harbor LaboratoryPress, New York.
Appendix 2

2. Barker,K. (1998) At the Bench: a Laboratory Navigator. Cold Spring HarborLaboratory

Press. New York. Chapter 15.

3. Sambrook,J.. Fritsch.E.F. Maniatis,T. (1989) Molecular Cloning. a LaboratoryManual,

Book 1. Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York, hal. 6.1 - 6. 15

4. KhanAcademy.2016.GelElectrophoresis.
5. https://www.khanacademy.org/science/biology/biotech-dna-technology/dna-sequencing-
pcr-electrophoresis/a/gel-electrophoresis. Diambil pada 20 Mei 2020 (22.00

6. Kusumawati, dkk. 2009. Deteksi dan Penentuan Virus Dengue dari Spsesimen Klinik
di Rumah Sakit Kota Medan dengan Menggunakan Metode Reverse Transcriptase
Polymerase Chain Reaction (RT-PCR). Sumatera Utara : Fakultas Kedokteran Universitas
Sumatera Utara.

7. Kusuma, Sri Agung Fitri. 2010. Makalah PCR. Fakultas Farmasi, Universitas Padjajaran
Jatinangor.
8. Lubis, Nita Andriani, dkk. 2013. Laporan Praktikum ISOLASI DNA MANUSIA
(EPITELIA MULUT DAN DARAH) DAN TEKNIK PCR,DAN ISOLASI PROTEIN DAN
DARAH, ELEKTROFORESIS AGAROSE DAN SDS PAGE
 2. Amplifikasi DNA dengan Real Time PCR (qPCR)

2.1 Nama Pemeriksaan dan Tujuan

A. Nama Pemeriksaan

Amplifikasi DNA dengan Real Time PCR (qPCR)

B. Tujuan

1. Mengetahui DNA virus dan DNA mitokondrian\ molekul lingkar.

2. Polymerase Chain reaction (PCR) adalah teknik amplifikasi sekuens DNA target
spesifik secara in vitro.
3. Mengetahui komponen yang di butuhkan dalam PCR.
4. Dapat mengetahui cara amplifikasi PCR pada tahap denaturasi.
5. Mengetahui tahap molekul DNA yang terjadinya pemisahan untai ganda DNA
menjadi untai DNA tunggal.
6. Mengetahui aplifikasi dan penggunaan qPCR
7. Analisis menggunakan Real time PCR memiliki sensitivitas tinggi dan lebih spesifik
untuk produk PCR.

2.2 Metode dan Prinsip

A. Metode

Real time PCR (Polymerase Chain Reaction)

B. Prinsip
Prinsip umum reaksi Real time PCR adalah DNA yang telah diamplifikasi dihitung setelah
diakumulasikan dalam reaksi secara real time sesudah setiap siklus amplifikasi selesai.
Sehingga tidak membutuhkan tahap elektroforesis dengan gel agarosa dan ethidiumbromide
(EtBr) yang merupakan senyawa karsinogenik.
Terdapat 2 metode kuantifikasi yang umum digunakan antara lain :
1. Menggunakan zat pewarna fluoresensi yang akan terinterkalasi dengan DNA rantai
ganda (dsDNA) misalnya SyBr Green,
2. Probe (penanda) yang berasal dari hasil modifikasi DNA oligonukleotida yang a
kan berpendar (flourensensi) ketika terhibridisasi dengan DNA komplemen. 
Yang dihasilkan.prinsip Real Time PCR (qPCR) PCR adalah suatu molekul perbanyakan
DNA secara enzimatik sehingga DNA yang diperoleh dapat digunakan untuk analisis
penelitian. DNA yang jumlahnya sangat sedikit juga dapat dikarakterisasi dengan metode ini.
 Prinsip Real Time PCR (qPCR)
(Gibson, U.E.M., Heid, CA & Williams, M.P. 1996)

1.3 Dasar Teori

Deoxyribonucleic Acid (DNA)
Ada tiga struktur DNA yang dikenal selama ini. Struktur-struktur DNA tersebut adalah
sebagai berikut :
1. Struktur Primer
DNA tersusun dari monomer-monomer nukleotida. Setiap nukleotida terdiri dari satu
basa nitrogen berupa senyawa purin atau pirimidin, satu gula pentosa berupa 2’-deoksi-D-
ribosa dalam bentuk furanosa, dan satu molekul fosfat. Penulisan urutan basa dimulai dari
kiri ujung 5’ bebas (tidak terikat nukleotida lain) menuju ujung dengan gugus 3’hidroksil
bebas atau dengan arah 5’  3’ ( Darnell, et al., dalam T.Milanda,1994).
2. Struktur sekunder
Salah satu sifat biokimia DNA yang menentukan fungsinya sebagai pembawa
informasi genetik adalah komposisi basa penyusun. Pada tahun 1949-1953, Edwin
Chargaff menggunakan metode kromatografi untuk pemisahan dan analis kuantitatif
keempat basa DNA, yang diisolasi dari berbagai organisme. Kesimpulan yang diambil
dari data yang terkumpul adalah sebagai berikut :
a. Komposisi basa DNA bervariasi antara spesies yang satu dengan spesies yang lain.
b. Sampel DNA yang diisolasi dari berbagai jaringan pada spesies yang sama mempunyai
komposisi basa yang sama.
c. Komposisi DNA pada suatu spesies tidak berubah oleh perubahan usia, keadaan nutrisi
maupun perubahan lingkungan.
d. Hampir semua DNA yang teliti mempunyai jumlah residu adenin yang sama dengan
jumlah residu timin (A=T) dan jumlah residu guanin yang sama dengan jumlah residu
sitosin (G=C) maka A+G = C+T yang disebut aturan Chargaff
DNA yang diekstraksi dari spesies-spesies dengan hubungan kekerabatan yang dekat
mempunyai komposisi basa yang hampir sama. ( Darnell, et al., dalam T.Milanda,1994).
3. Struktur Tersier
Kebanyakan DNA virus dan DNA mitokondrian merupakan molekul lingkar.
Konformasi ini terjadi karena kedua untai polinukleutida membentuk struktur tertutup
yang tidak berujung. Molekul DNA lingkar tertutup yang diisolasi dari bakteri, virus dan
mitokondria seringkali berbentuk superkoil, selain itu DNA dapat berbentuk molekul
linear dengan ujung rantai yang bebas. ( Darnell, et al., dalam T.Milanda,1994).
Polymerase Chain Reaction (PCR)
Polymerase Chain reaction (PCR) adalah teknik amplifikasi sekuens DNA target
spesifik secara in vitro. PCR berdasarkan pada aktivitas DNA polimerase. Amplifikasi PCR
dapat mengubah sedikit molekul asam nukleat target spesifik menjadi mikrogram DNA
(Degen et al., 2006). Prinsip kerja PCR adalah reaksi berulang yang dilakukan oleh
polimerase yaitu enzim yang mampu merangkai DNA building block menjadi untai
molekular yang panjang.Selain itu dibutuhkan pula nukleotida yang mengandung empat basa
nitrogen dan primer (Turner, 2003).
Komponen yang dibutuhkan dalam PCR adalah primer forward dan primer reverse,
DNA template, dNTP4 (A, T, G, C), MgSO4, 10x Taq buffer, Taq DNA polymerase, SDW
(Sterilized Distillate Water). Primer merupakan dua oligonukleotida yang akan mengapit dan
menetapkan sekuens target yang akan diamplifikasi. Primer akan menghibridisasi untai DNA
yang berlawanan untuk menyediakan titik inisiasi sintesis untai DNA yang baru dan reaksi ini
dikatalisis oleh Taq DNA Polimerase. Menurut Degen et al., (2006), sintesis PCR melibatkan
tiga tahap, antara lain denaturasi, annealing, dan ekstensi. PCR adalah suatu teknik yang
melibatkan beberapa tahap yang berulang (siklus) dan pada setiap siklus terjadi duplikasi
jumlah target DNA untai ganda. Untai ganda DNA templat (unamplified DNA) dipisahkan
dengan denaturasi termal dan kemudian didinginkan hingga mencapai suatusuhu tertentu
untuk memberikan waktu pada primer menempel (anneal primers) pada daerah tertentu dari
target DNA. Polimerase DNA digunakan untuk memperpanjang primer (extend primers)
degnan adanya dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dan dTTP) dan buffer yang sesuai. Umumnya
keadaan ini dilakukan antara 20-40 siklus. Target DNA yang diinginkan (short “target”
product) akan meningkat secara eksponensial setelah siklus keempat dan DNA non-target
(long product) akan meningkat secara linier (Newton and Graham, 1994).
Penggunaan PCR memiliki kelebihan yaitu dalam ketepatan setiap proses dalam
tahapan amplifikasi, amplifikasi dapat dilakukan secara manual tanpa mesin termocycle
tetapi akan memudahkan dalam penelitian menggunakan mesin PCR lebih cepat dan hasil
akan sesuai dengan yang di inginkan, akan tetapi membutuhkan pengaturan waktu optimasi
yang sesuai dengan sampel yang digunakan agar tidak merusak sampel yang kita masukkan.
Tahap yang menentukan keberhasilan teknik PCR adalah tahap denaturasi yang merupakan
awal dari amplifikasi, jika tidak terjadi denaturasi makan proses selanjutkan akan mengalami
kesalahan, baik kesalahan penempelan primer sampai kesalahan amplifikasi targer yang
diinginkan.

Teknik PCR dapat didayagunakan untuk memfasilitasi analisis gen walaupun

terkadang dimodifikasi dengan tambahan teknik molekular lainnya. Selain itu telah
dikembangkan banyak sekali aplikasi praktis, sebagai contoh teknik dan aplikasi PCR adalah
kloning hasil PCR, sekuensing hasil PCR, kajian evolusi molekular, deteksi mutasi, penyakit
genetik, kajian forensik, dan masih banyak lagi. Dengan demikian penemuan dan manfaat
teknik PCR ini berdampak sangat luas terhadap kemajuan sains dan teknologi secara umum
(Handoyo and Rudiretna, 2000)
 Gambar. Skema Proses PCR (Sumber: Passarge, Eberhard, 2007

Berikut adalah tiga tahap pengulangan yang penting dalam proses PCR yaitu :
1. Denaturasi
Pada tahap ini molekul DNA dipanaskan sampai suhu 94C yang menyebabkan
terjadinya pemisahan untai ganda DNA menjadi untai DNA tunggal. Untai DNA tunggal
inilah yang menjadi cetakan bagi untai DNA baru yang akan dibuat. ( Darnell, et al.,
dalam T.Milanda,1994).

Gambar 6. Untai DNA mengalami denaturasi (Innis M, et al., 1990)

2. Penempelan (Annealing)
Enzim Taqpolimerase dapat memulai pembentukan suatu untai DNA baru jika ada
seuntai DNA berukuran pendek (DNA yang mempunyai panjang sekitar 10 sampai 30
pasang basa) yang menempel pada untai DNA target yang telah terpisah. DNA yang
pendek ini disebut primer. Agar suatu primer dapat menempel dengan tepat pada target,
diperlukan suhu yang rendah sekitar 55C selama 30-60 detik. ( Darnell, et al., dalam
T.Milanda,1994).

Gambar 7. Penempelan primer dengan untau DNA yang telah (Innis M, et al., 1990)
Terdenaturasi
3. Pemanjangan ( Ekstension )
Setelah primer menempel pada untai DNA target, enzim DNA polimerase akan
memanjangan sekaligus membentuk DNA yang baru dari gabungan antara primer, DNA
cetakan dan nukleotida

Gambar 8. Perpanjangan DNA secara semi-konservatif ( (Innis M, et al., 1990)

Ketiga tahap diatas dilakukan pengulangan , maka untai DNA yang baru dibentuk
akan kembali mengalami proses denaturasi, penempelan, dan pemanjangan untai DNA yang
baru. Pengulangan proses PCR akan menghasilkan amplifikasi DNA cetakan baru secara
eksponensial ( Marks Dawn, et al., 2000)

Gambar 9 Proses amplifikasi DNA target (Innis M., et al., 1990)

Komponen-komponen untuk Reaksi PCR

Berikut adalah komponen yang diperlukan untuk reaksi PCR, yaitu :
a. DNA cetaka/DNA target
Merupakan keseluruhan DNA sampel yang didalamnya terkandung fragmen
DNA target.
b. Primer
Primer adalah suatu oligonukleotida yang memiliki 10 sampai 40 pb
(pb=pasangan basa) dan merupakan komplementer dari DNA target. Pemilihan primer
yang tidak sesuai dapat menyebabkan tidak terjadinya reaksi polimerasi antara gen
target dengan primer. Berikut adalah kriteria pemilihan, yaitu :
1. Panjang primer : 15-30 pb
 2. Kandungan GC sekitar 50%
3. Temperature penempelan kedua primer tidak jauh berbeda
4. Urutan nukelotida yang sama harus dihindari
5. Tidak boleh terjadi self dimmer,pair dimmer, atau hairpin

c. DNA polimerase
Merupakan enzim yang stabil dalam pemanasan dan umumnya digunakan
enzim TaqDNA polimerase (Taq = Thermus aquaticus ). Enzim ini tetap stabil
mengamplifikasikan DNA walaupun amplifikasi berjalan pada suhu mendekati titik
didih air
d. Buffer / Dapar
Buffer atau dapar yang digunakan umumnya mengandung MgCl2yang
mempengaruhi stabilitas dan kerja enzim polimerase.
e. dNTPS
dNTPS atau Deoxynukleotide Triphosphates merupakan suatu nukleotida
bebas yang berperan dalam perpanjangan primer melalui pembentukkan pasangan
basa dengan nukleotida dari DNA target. (Innis M. And Gelfand D inWhite Thomas,
1990)
Amplifikasi DNA Menggunakan Metode Reverse Transcription-Polymerase Chain
Reaction ( RT PCR)
Real Time PCR
Real time PCR atau quantitative real time PCR (qPCR) merupakan salah satu metode
PCR yang kini sudah banyak diaplikasikan dalam biologi molekuler. Pada metode qPCR,
peneliti tidak hanya dapat mendeteksi keberadaan suatu gen tertentu tetapi juga mengetahui
kuantitas gen target pada sampel hingga membandingkan ekspresi gen pada sampel.
Aplikasi dan penggunaan qPCR
Ada dua jenis qPCR yang sering digunakan dalam penelitian biologi molekuler yaitu
kuantifikasi absolut dan kuantifikasi relatif. Kuantifikasi absolut mengacu pada jenis analisis
dimana peneliti ingin mengetahui kuantitas atau banyaknya gen yang diteliti dalam sampel.
Sebagai contoh, peneliti ingin mencari tahu berapa copy number gen parasit yang terdapat di
sampel tumbuhan. Untuk mendapatkan jumlah absolut ini, peneliti diarahkan untuk membuat
kurva standar menggunakan sampel yang sudah diketahui jumlahnya terlebih dahulu lalu
kurva standar ini akan digunakan sebagai acuan untuk menghitung jumlah gen dalam sampel.
Sementara untuk kuantifikasi relatif lebih sering digunakan untuk menganalisis
perbedaan fold pada ekspresi gen tertentu antara kelompok perlakuan yang berbeda.
Misalnya, peneliti ingin mengetahui apakah ada perbedaan ekspresi gen yang berperan dalam
sintesis lemak pada kelompok yang rajin sarapan dan yang tidak pernah sarapan. Jenis qPCR
ini membutuhkan kontrol endogen atau sering disebut sebagai reference/housekeeping gene.
Analisis data pada kuantifikasi relatif akan bergantung dari CT value yang dihasilkan
oleh reference gene  dan gen target.
Pengunaan qPCR dalam ranah biologi molekuler dan life science lainnya
memungkinkan peneliti untuk memperoleh hasil yang akurat dan cepat. qPCR dapat menjadi
pertimbangan Anda terutama jika penelitian Anda ingin mengetahui jumlah gen target atau
membandingkan ekspresi gen antar perlakuan. (by Genetika,2020)
 Real Time PCR adalah teknik yang digunakan untuk memonitor progress reaksi PCR
pada waktu yang sama (Biosoft, 2007). RT-PCR juga dikenal sebagai quantitative
PCR (qPCR). Jumlah produk PCR (DNA, cDNA atau RNA) yang relatif sedikit, dapat
dihitung secara kuantitatif. Real Time PCR juga merupakan pengumpulan sinyal fluoresen
terus menerussatu atau lebih reaksi berantai polimerase pada berbagai siklus. Real Time PCR
kuantitatif adalah konversi sinyal fluoresens dari masing-masing reaksi menjadi nilai numerik
untuk setiap sampel. ( Tri Joko Raharjo,2018)

Prinsip kerjanya didasarkan pada deteksi fluoresensi yang diproduksi oleh molekul
reporter yang meningkat sejalan dengan berlangsungnya proses PCR. Hal ini terjadi karena
akumulasi produk PCR pada tiap siklus amplifikasi. Molekul reporter dengan fluoresensi
meliputi pewarna yang berikatan pada double-stranded DNA (menggunakan SYBR®Green
atau EvaGreen®Reagents ) atau menggunakan probe spesifik sekuens/sequence specific
probes (Molecular Beacons or TaqMan® Probes). (Fraga et al., 2008).

Gambar.1 Mesin Real Time PCR

Analisis menggunakan Real time PCR memiliki sensitivitas tinggi dan lebih spesifik
untuk produk PCR tertentu. Real time PCR juga meliputi Real Time-RT PCR dimana PCR
dilakukan secara Real Time menggunakan enzim Reverse Transcriptase secara langsung
pada waktu yang bersamaan. Real Time-RT PCR memiliki tambahan siklus Reverse
Transcription  yang memacu perubahan molekul DNA dari molekul RNA. Real Time-RT
PCR diperlukan karena RNA kurang stabil dibandingkan dengan DNA.(Fraga et al., 2008).
Gambar 2. Proses Real Time  PCR pada deteksi target non-spesifik (Fraga et al., 2008).

Pada prosedur Real Time PCR, molekul reporter dengan fluoresensi (pada Gambar 2
ditunjukkan dengan bagian berwarna hijau) digunakan untuk memonitor proses PCR.
Fluoresensi akan dipendarkan oleh molekul sebagaimana terakumulasinya produk PCR pada
tiap siklus proses amplifikasi. Berdasar pada molekul yang digunakan untuk deteksi, teknik
Real Time PCR dapat dibedakan sebagai berikut:
1. Deteksi target non-spesifik menggunakan pewarnaan DNA
Pada Real Time PCR, pewarna DNA digunakan sebagai reporter fluoresensi untuk
memonitor reaksi Real Time PCR. Fluoresensi pada reporter akan terakumulasi seiring
dengan proses amplifikasi yang berlangsung. Pencatatan secara kuantitatif dilakukan dengan
menghitung pancaran fluresensi tiap siklus PCR. Hal tersebut mungkin untuk dilakukan guna
memonitor reaksi PCR selama fase eksponensial.  Jika grafik digambarkan antara log jumlah
awal template dan hubungan peningkatan fluoresensi reporter selama proses Real Time PCR,
maka akan didapatkan suatu garis hubungan yang menunjukkan kuantitas gen yang
diekspresikan.(Arya et al., 2005).  
2. Deteksi target spesifik
Deteksi target spesifik Real Time PCR dilakukan menggunakan beberapa probe
oligonucleotide yang dilabeli pada dua bagian reporter dengan label
(pewarna) fluoresensi/fluorescent dye dan pewarna quencher/ quencher dye. 
Kuantitas mRNA dalam sel merupakan parameter jumlah gen yang terekspresi. Untuk
menganalisa tingkat ekspresi gen, cDNA yang telah disintesis dari mRNA diuji secara
kuantitatif menggunakan real time PCR. Analisis hasil real time PCR dapat dilakukan
secara absolute quantification dan relative quantitation. Metode relative quantitation atau
yang dikenal juga dengan comparative threshold method menghilangkan kebutuhan akan
kurva standar yang digunakan dalam perhitungan absolute quantification dan menggunakan
perhitungan secara matematika untuk mengukur tingkat kuantitatif relatif ekspresi dari gen
target dengan menggunakan gen referensi dan kalibrator dari jaringan. (Arya et al., 2005).  
 Untuk mengetahui ekspresi suatu gen maka dibutuhkan gen referensi sebagai
pembanding internal (endogenous control) jumlah DNA agar tidak terjadi kesalahan
interpretasi akibat jumlah DNA yang berbeda. Gen referensi yang digunakan adalah gen yang
tidak terpengaruhi oleh lingkungan. Gen yang paling banyak digunakan adalah housekeeping
gene seperti actin dan gliseraldehida-3-fosfat-dehidrogenase (GAPDH) (Bustin, 2000).
Hasil real time PCR dengan metode comparative threshold meliputi nilai Cq dan
relative quantitation. Cq merupakan hasil fraksi jumlah siklus PCR dimana nilai reporter
fluoresensi lebih besar dari tingkat deteksi minimal mesin real time PCR sehingga amplicon
meningkat secara signifikan. Nilai Cq didapat dari jumlah siklus pada proses PCR yang
berpotongan dengan garis threshold. Threshold adalah garis yang menandai peningkatan
sinyal fluoresensi secara signifikan berdasarkan variabilitas baseline, namum posisi threshold
dapat diatur bebas pada setiap titik di fase eksponensial (Life TechnologiesTM, 2012). 
Secara teori, reaksi PCR menguat secara eksponensial, menggandakan setiap
siklus dan tumbuh selamanya. Sedangkan pada kenyataannya, reaktan untuk polymeration
terbatas. ( Tri Joko Raharjo,2018)
Theeresold Cycle (CT) / Ambang Siklus
Nilai mbang siklus atau CT adalah siklus di mana peningkatan signifikan dalam
DRnis pertama kali terdeteksi. Itu adalah parameter yang digunakan untuk kuantisasi.
Nilai CT 40 atau lebih berarti tidak ada amplifikasi dan tidak dapat dimasukkan dalam
perhitungan.( Tri Joko Raharjo,2018)

Titik di mana fluoresensi naik latar belakang lumayan di atas

 Pergeseran kiri ke kanan pada kurva adalah terkait dengan jumlah awal DNA,
Identifikasi nilai Cq (“Jumlah Siklus) posisi kurva, berdasarkan di mana mereka melewati
ambang batas. ( Tri Joko Raharjo,2018)
Cara Mengukur DNA :
Pewarna fluoresen non-spesifik:
1. Interkasi dengan dsDNA
2. SYBR hijau, EVAGREEN
Urutan primer primer & probe DNA:
oligonukleotida dilabeli dengan reporter neon
1. Hydrolisisprobe: TaqMan, Molekul Beacon, Scorpion
2. Hibridisasi probe: FRET
( Tri Joko Raharjo,2018)
Ethidium Bromide
+ = umum dan terkenal
- = beracun, tidak terlalu cerah

SYBR Green I
+ = Fluoresensi cerah
+ = Toksisitas rendah
Perbedaan Real Time PCR dan PCR biasa yaitu, dengan Real Time PCR deteksi produk
PCR dapat dihasilkan pada fase awal reaksi. PCR biasa hanya menggunakan Electrophoresis
gel untuk deteksi produk amplifikasi PCR pada fase akhir, tanpa mengetahui jumlah produk
PCR yang diekspresikan atau dihasilkan.(Fraga et al., 2008).

1.4 Alat & Bahan

ALAT
 Centrifugasi 
 PCR
 Eppendorf
 Mikropipet

BAHAN
 Sample DNA 
 Aquabides
 Buffer PCR

1.5 Cara Kerja

1. Sampel ditambah buffer dengan suhu 65oC selama 10 menit

2. ditambah precipitation buffer dalam es selama 5 menit
3. Sentrifuge selama 2 menit dengan kecepatan 12.000 rpm,
4. ditambah bindding buffer lalu sentrifugasi selama 1 menit dengan kecepatan 12.000
rpm,
5. ditambah washing buffer 1 dengan kecepatan 12.0001. Sampel ditambah buffer
dengan suhu 65oC selama 10 menit
6. menghangatkan elution buffer pada suhu 65oC,
7. inkubasi pada suhu 65oC dengan kecepatan 12.000 rpm.
8. setelah didapatkan larutan DNA selanjutnya dilakukan analisis60oC dengan
pengulangan sebanyak 40 siklus.

Gambar 1. Kurva kuas roti untuk target DNA babi dan vetebrata
Tabel 2. Hasil sampel menggunakan EasyFast Pig/Suidae detection &
quantificationkit
Flour Target Sampel Nilai
Cq
 FAM Pig Kontrol positif 33,31
FAM Pig Kontrol N/A
negatif
FAM Pig Kapsul N/A
FAM Pig Kuas roti 34,60
FAM Pig Day cream 38,23
FAM Pig Sabun 37,04
kecantikan
VIC Vertebra Kontrol positif 32,48
ta
VIC Vertebra Kontrol N/A
ta negatif
VIC Vertebra Kapsul 34,48
ta
VIC Vertebra Kuas roti 29,61
ta
VIC Vertebra Day cream 33,40
ta
VIC Vertebra Sabun 37,36
ta kecantikan
Keterangan : FAM merupakan DNA babi
VIC merupakan DNA Vetebrata

1.6 Perhitungan

Real Time – PCR

Pada prosedur Real Time PCR, molekul reporter dengan fluoresensi (ditunjukkan
dengan bagian berwarna hijau) digunakan untuk memonitor proses PCR. Fluoresensi akan
dipendarkan oleh molekul sebagaimana terakumulasinya produk PCR pada tiap siklus proses
amplifikasi.(Tamam, Badrut. 2016)
 Secara teori, reaksi PCR menguat secara eksponensial, menggandakan setiap siklus
dan tumbuh selamanya. Tetapi, pada kenyataannya reaktan untuk polimerasi terbatas.
(Tamam, Badrut. 2016)

Penentuan Nilai Ct
Threshold cycle atau nilai CT adalah siklus terjadinya peningkatan DRn yang
signifikan pertama kali terdeteksi. Ct adalah parameter yang digunakan untuk memulai
perhitungan deteksi DNA. Pada grafik, Nilai CT 40 atau lebih berarti tidak ada amplifikasi
dan tidak dapat dimasukkan dalam perhitungan. (Raharjo, Tri Joko. 2018)

Keterangan:
 Threshold cycle (Ct) merupakan nilai yang menunjukkan starting quantity.
 Baseline Threshold merupakan suatu garis batas yang dibuat untuk menentukan
starting quantity dari sampel.
 Titik pertemuan antara baseline threshold dengan data grafik amplifikasi disebut Ct
 Ct didefinisikan sebagai siklus ketika sampel berfluoresensi melebihi ambang batas
yang dipilih melewati garis thereshold.
 Cp adalah “Cycle Crossing Point”.
 Rn adalah sinyal reporter yang dinormalisasi
Sinyal reporter dinormalisasi ke fluoresensi dengan membagi fluoresensi menjadi
reporter dan fluoresensi referensi pasif, untuk mengkompensasi variasi kecil well-to-
well. ΔRn sebagai nilai fluoresensi untuk semua siklus yang terjadi.
(Raharjo, Tri Joko. 2018)
 CT

Idealnya, PCR akan mengamplikasi sesuai dengan rumus:

Keterangan :
Perbedaan 1 Ct = Perbedaan 2 kali lipat dalam jumlah templat awal
Perbedaan 3,3 Ct = Perbedaan 10 kali lipat dalam jumlah tempalt awal
Dapat diringkas dengan rumus 2n (n = siklus)
(Raharjo, Tri Joko. 2018)

Sebagian besar perangkat lunak platform akan memplot kurva standar menggunakan
sumur yang ditunjuk atau Microsoft Excel® dapat digunakan untuk menggambar plot xy dan
jumlah templat log sebagai nilai x dan ambang batas siklus (Ct) sebagai nilai y. Linier yang
menyajikan kecocokan terbaik dihitung untuk kurva standar menggunakan metode kuadrat
terkecil dari regresi linier: (Dorak, Tevik. 2006)
y=mx+b
Keterangan
y = C,
m = slope,
x = log10template amount
b = y-intercept.
(Dorak, Tevik. 2006)

Penentuan nilai Rasio (sampel/kalibrator) terhadap nilai Cq

Untuk melihat seberapa besar ukuran DNA, dapat dilihat dengan pergeseran kiri-
kanan pada kurva. Cq (“Cycle Quantity”) mengidentifikasi posisi kurva, berdasarkan naiknya
kurva melewati ambang batas. Jumlah DNA dan Nilai Cq dapat dilihat dengan rumus:
Rasio(sampel/kalibrator) = 2DCq

Nilai relative quantitation dihitung berdasarkan satuan massa dengan rasio nilai Cq kalibrator
dengan Cq sampel dengan bentuk rumus:
Rasio(sampel/kalibrator) = ECq (kalibrator)-Cq (sampel)
E adalah nilai efisiensi amplifikasi yang menjelaskan berapa banyaknya target yang
diproduksi dalam setiap siklus PCR. Jika proses PCR efisien 100%, maka setiap siklus akan
memproduksi dua kali lipat hasil dari template semula. E bernilai 2 jika amplifikasi PCR
100% efisien (Bio-Rad, 2006). Jika E bernilai 2, maka perhitungannya menjadi sebagai
berikut:
Rasio(sampel/kalibrator) = 2Cq (kalibrator)-Cq (sampel) 
atau
Rasio(sampel/kalibrator) = 2DCq ; dimana DCq = Cq(kalibrator) – Cq(sampel)
(Tamam, Badrut. 2016)

Untuk menentukan rasio antara sampel dan kalibrator, digunakan rumus berikut ini:

(Tamam, Badrut. 2016)

CONTOH

Jurnal : Optimalisasi Real Time PCR untuk Diagnosis Filariasis Bancrofti pada Sediaan
Hapus Darah Tebal

Untuk running PCR 65 sampel penelitian ini dibagi dua, Running sampel yang
pertama sebanyak 45 sampel (26 sampel negatif dan 19 sampel positif dengan pemeriksaan
mikroskopis), memberikan hasil 24 negatif dan 21 positif terhadap infeksi
W.bancrofti.Kisaran nilai Ct terhadap pewarna SYBR Green pada running sampel pertama ini
adalah antara 16,97 sampai 29,79. Sementara itu running sampel sediaan yang kedua dengan
Real Time PCR sebanyak 18 sampel (12 sampel negatif dan 6 sampel positif dengan
pemeriksaan mikroskopis) menunjukkan hasil yang sama. Untuk kisaran nilai Ct pada
running sampel sediaan yang kedua ini adalah 19,47 sampai 21,93. (Rika Ferlianti, dkk.
2012)
 Status diagnosis sampel tersebut positif atau negatif ditentukan berdasarkan nilai Ct
yang diperoleh. Nilai Ct ditentukan terutama oleh jumlah template yang ada di awal reaksi
amplifikasi (BioRad, 2006). (Rika Ferlianti, dkk. 2012)
Kisaran nilai Ct untuk seluruh sampel adalah 16,97 – 29,79. Kisaran nilai Ct tersebut
menunjukkan adanya amplifikasi pada W. bancrofti. Pada sampel penelitian ini, nilai Ctyang
lebih dari 30 dinyatakan dengan N/A(Not Applicable). Not Applicable artinya sampel
yang diperiksa dinyatakan negatif terhadap infeksi W. bancrofti. (Rika Ferlianti, dkk. 2012)
Nilai Ct ditentukan terutama oleh jumlah cetakan yang ada di awal reaksi amplifikasi. Jika
jumlah cetakan pada awal reaksi tersedia banyak maka relatif sedikit siklus amplifikasi yang
dibutuhkan agar produk memberikan sinyal fluoresensi, sehingga reaksi ini akan memiliki
nilai Ct yang rendah. Sebaliknya jika yang tersedia sedikit, maka reaksi ini akan memiliki
nilai Ct yang tinggi (BioRad, 2006).(Rika Ferlianti, dkk. 2012)
1.7 Daftar Pustaka

1. G. W. David, Pharmaceutical Chemistry, Glasgow: Elsevier, 2011.

Kusuma,S.A.F.,2010.PCR.[Online]
Availableat:pustaka.unpad.ac.id/wp.../09/pustaka_unpad_pcr [Accessed 28 Oktober
2017].

2. BioRad 2006. Real Time PCR Application Guide. BioRad Laboratories, Inc, USA.

3. Rika Ferlianti, dkk. 2012. Optimalisasi Real Time PCR untuk Diagnosis Filariasis
Bancrofti pada Sediaan Hapus Darah Tebal. Jakarta : Magister Program of
Biomedical Science, Faculty of Medicine University of Indonesia.

4. Dorak, Tevik. 2006. Real-Time PCR. Newcastle-upon-Tyne, UK : School of Clinical

Medical Sciences (Child Health)Newcastle University

5. Raharjo, Tri Joko. 2018. Prinsip Real Time PCR. Yogyakarta : Universitas Gajah Mada

6. Tamam, Badrut. 2016. Pengertian dan Prinsip Kerja Real Time PCR.
7. https://www.generasibiologi.com/2016/03/real-time-pcr.html. Diambil pada 21 Mei 2020
(09.08)
8. Gibson, U.E.M., Heid, CA & Williams, M.P. (1996) A novel method for real ime
quantitative RT-PCR, Genom Research,6, 986-995

9. Raharjo, Tri Joko. 2018. Prinsip Real Time PCR. Universitas Gadjah Mada.

10. Integrated DNA Technologies. (2011). qPCR Application Guide; Experimental

Overview, Protocol, Troubleshooting.

11. National Center for Biotechnology Information. (2017, November 09). Retrieved January
21, 2020, from Polymerase Chain Reaction:

12. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/probe/docs/techpcr/

13. Tamam, Mh Badrud. 2016. Biolodi Molekuler : Pengertian dan Prinsip Kerja Real Time
PCR. Governing Board of Generasi Biologi Indonesia Foundation.

14. Brenner, S., Miller, J. H. 2001. Encyclopedia of Genetics. MRC Laboratory of Molecular
Biology, Hills Road, Cambridge. Academic Press

15. Campbell, A. Neil., et. al. 2008. Biologi Edisi 8, Jilid I. Penerbit Erlangga. Jakarta
Clark, D.P. & N.J. Pazdernik. 2009. Biotechnology Applying the Genetic
Revolution.Academic Press. New York

16. Degen, H., A. Deufel, D. Eisel, S. Grunewald-Janho, & J. Keesey. 2006. PCR

Application Manual. Third Edition. Roche Diagnotics GmbH, Mannheim. Germany

17. Dolphin, W. D. 2008. Biological investigations. New York : The McGraw-Hill

Companies, Inc.
18. Fatchiyah, Arumingtyas, E. L., Widyarti, S., Rahayu, S. 2011. Biologi Molekular, Prinsip
Dasar Analisis. Penerbit Erlangga. Jakarta
19. https://wilsongomarga.wixsite.com/belajarosnbiologi/single-post/2016/10/27/Membaca-
Hasil-Elektroforesis

20. Handoyo, D., Rudiretna, A. 2000. Prinsip Umum dan Pelaksanaan Polymerase Chain
Reaction (PCR). Pusat Studi Bioteknologi. Universitas Surabaya. Unitas, Vol. 9, No. 1, 17-29
Holme, D. J. & Hazel P. 1998. Analytical biochemistry .England : Pearson Education Limited

21. http://e-journal.uajy.ac.id/12537/3/BL013452.pdf

22. http://fatchiyah.lecture.ub.ac.id/files/2012/08/Praktikum-TABM-S1-Biologi-MIPA-
UB.pdf

23. Marks, D. B., Allan D. M., Colleen M. S. 2004. Basic Medical Biochemistry.

Newton, C.R. and A. Graham. 1994. PCR.  UK: Bios Scientific Publisher.

24. Passarge, E., 2007. Color Atlas of Genetics, 3rd edition Revised and Updated. Germany.
Institute of Human Genetics, University Hospital Essen. Thieme.

25. Reece, Richard J. 2004. Analysis of Genes and Genomes. John Wiley & Sons Ltd:
England.

26. Sumner, T. 2003. Chromosome Organization and Function. Blackwell Publishing.

27. Surzycki, S. 2000. Basic techniques in molecular biology. Germany : Springer-Verlag

Berlin Heidelberg

28. Switzer. 1999. Experimental biochemistry. Oxford : Blackwell Scientific Pub.

Wilson, K. & John M. W. 1994.Principles and Techniques of Practical Biochemistry.UK :
Cambridge University Press

29. Yuwono, T. 2005. Biologi Molekuler.  Jakarta. Erlangga

30.https://www.chem.purdue.edu/teacher/table_of_contents/Gel
%20Electrophoresis/DYE_ELEC.5.11.96.pdfF.