TINJAUAN PUSTAKA

ISOLASI

A. Ekstraksi

Ekstraksi merupakan teknik pemisahan suatu campuran berdasarkan perbedaan kelarutan zat
dalam suatu pelarut tertentu (Harborne, 1987). Pelarut yang digunakan untuk mengekstraksi
suatu bahan diharapkan mengikuti prinsip "like disolved like", guna memaksimalkan hasil zat
yang diinginkan dan meminimalkan ekstraksi zat yang tidak diinginkan. Pelarut dengan titik
didih rendah lebih mudah digunakan karena lebih mudah menguap. Metanol (MeOH), etanol
(EtOH), aseton, kloroform (CHCl3), diklorometana (DCM), etil asetat (EtOAc), dan n-
heksana menguap relatif cepat, sedangkan air dan butanol lebih sulit dihilangkan. Selain itu
metanol (MeOH) atau etanol (EtOH) dapat menonaktifkan enzim yang ada (Sarker et.al.,
2006).
Maserasi adalah metode umum untuk ekstraksi yang banyak digunakan. Pelarut ditambahkan
pada sampel dalam wadah sehingga tercapai kesetimbangan antara konsentrasi zat terlarut di
dalam bahan tanaman dan konsentrasi zat terlarut di dalam pelarut. Pada kondisi
kesetimbangan ini, ekstraksi pada dasarnya berhenti. Filtrat diambil dan diganti dengan
pelarut baru dengan setiap penambahan pelarut, bahan tanaman harus dibiarkan dimaserasi
selama 24 jam. Pengalaman menunjukkan bahwa setelah tiga perubahan pelarut, sejumlah zat
didalam bahan tanaman hampir sepenuhnya terekstrak (Sarker et.al., 2006).

B. Kromatografi

Kromatografi adalah teknik pemisahan berdasarkan kemampuan distribusi zat diantara dua
fasa; fasa diam dan fasa gerak (Harborne, 1987). Fasa diam berupa zat berpori seperti silika,
alumina dan selulosa yang dapat ditempelkan pada lapisan tipis (plat atau kaca) atau dibuat
dalam bentuk kolom. Fasa gerak merupakan campuran pelarut berdasarkan kekuatan
polaritas yang pada umumnya diukur dari nilai konstanta dielektrik (Tabel II.2). Sebuah
konstanta dielektrik yang besar menunjukkan pelarut polar dengan kemampuan yang tinggi
untuk mengelusi, sedangkan konstanta dielektrik yang kecil menunjukkan pelarut nonpolar
dengan kemampuan lebih rendah untuk mengelusi komponen dari fasa diam. Perbedaan
kekuatan adsorbsi oleh fasa diam terhadap tiap-tiap zat dalam campuran, menyebabkan
pemisahan berdasarkan perbedaan kelarutan terhadap fasa gerak. Pemilihan fasa diam dan
fasa gerak merupakan point penting dalam melakukan pemisahan dengan teknik kromatografi
(Tabel II.3).
Tabel II.2. Nilai Kontanta Dielektrik Pelarut (Sarker et.al., 2006)
Kontanta
Kontanta
No Pelarut No Pelarut Dielektrik
Dielektrik (20oC)
(20oC)
1. Pentana 1,8 9. Etil Asetat 6,0
2. Heksana 1,9 10. Asam Asetat 6,2
3. Sikloheksana 2,0 11. Diklorometan 9,1
4. Benzen 2,3 12. Piridin 12,3
5. Toluen 2,4 13. Aseton 20,7
6. Dietil eter 4,3 14. Metanol 32,6
7. Dimetil sulfoksida 4,7 15. Asetonitril 37,5
8. Kloroform 4,8 16. Air 78,5

Tabel II.3 Fasa Fiam dan Fasa Gerak dalam Kromatografi (Sarker et.al., 2006)
No Fasa Gerak Fasa Diam Keterangan
1. Heksan : Etil Asetat Silika Gel Sistem Pelarut Universal
2. Petrol : Dietil eter Silika Gel Sistem Pelarut untuk senyawa yang relatif
nonpolar. Sangat baik untuk pemisahan
terpenoid dan asam lemak.
3. Petrol : Kloroform Silika Gel Sangat berguna untuk pemisahan turunan
asam sinamat khususnya kumarin.
4. Toluen : Etil Asetat : Asam Silika Gel Dengan variasi 80:18:2 atau 60:38:2 – sangat
Asetat baik untuk pemisahan metabolit asam
5. Kloroform : Aseton Silika Gel Sistem Pelarut umum untuk pemisahan
senyawa dengan polaritas sedang.
6. Benzen : Aseton Silika Gel Digunakan untuk pemisahan senyawa
aromatik.
7. Butanol : Asam Asetat : Silika Gel Sistem pelarut polar untuk memisahkan
Air senyawa flavonoid dan senyawa glukosida.
8. Metanol : Air C18, Digunakan untuk pemisahan senyawa dengan
Polyamid, polaritas tinggi seperti gula dan glukosida.
Selulosa
9. Asetonitril : Air C18 Sistem pelarut universal untuk fasa terbalik

C. Thin Layer Chromatography (TLC)/ Kromatografi Lapis Tipis (KLT)

Pada KLT, proses elusi/ pengembangan diartikan sebagai proses migrasinya fasa gerak ke
arah atas menggunakan gaya kapilaritas. Proses ini mengakibatkan terjadinya pemisahan
dengan mekanisme yang melibatkan kelarutan relatif dari suatu zat antara fase diam dan fase
gerak. Zat yang lebih larut dalam fase gerak akan bermigrasi sampai ke tingkat yang lebih
besar daripada zat yang lebih larut atau yang lebih diserap oleh fase diam (Sarker et.al.,
2006).

Efektif visualisasi atau deteksi hasil pemisahan sangat penting dalam analisis KLT. Deteksi
UV melibatkan penggunaan senyawa aktif UV (indikator) yang dimasukkan ke dalam fasa
diam. Di bawah sinar UV gelombang pendek (254 nm), indikator (manganese-activated zinc
silicate) akan memancarkan cahaya hijau pucat. Di bawah sinar UV gelombang panjang (366
nm), indikator akan memancarkan cahaya ungu pucat. Senyawa yang menyerap cahaya baik
di 254 atau 366 nm akan muncul sebagai spot gelap. Senyawa yang tidak menyerap sinar UV
pada 254 atau 366 nm tidak akan terlihat dan perlu dilakukan deteksi semprot (CeSO 4)
(Sarker et.al., 2006). Parameter dasar yang digunakan untuk karakterisasi posisi dari daerah
sampel dalam suatu kromatogram KLT adalah retardation factor (Rf). Nilai Rf
menggambarkan perbandingan antara jarak migrasi sampel dengan migrasi pelarut. Kondisi
batas untuk nilai Rf adalah 0 < Rf < 1. Jika Rf = 0, noda tidak bergerak dari titik awal,
sedangkan jika nilai Rf = 1, noda tidak ditahan oleh fasa diam dan bergerak ke atas bersama
pelarut (Williamson, 1989).

D. Vacuum Liquid Chromatography (VLC)/ Kromatografi Vakum Cair (KVC)

Cara kerja menggunakan metode ini adalah dengan melarutkan sedikit sampel lalu
diimpregnasi dengan silika impreg kemudian dimasukkan kolom yang sudah disiapkan dan
dielusi dengan pelarut yang ditentukan perbandingan kepolarannya. Aliran fasa gerak yang
melewati kolom pada metode KVC ditingkatkan dengan cara menambahkan pompa vakum
dari bawah kolom sehingga pelarut tertarik kuat kebawah dan mudah untuk melewati kolom.
Metode ini lebih efektif digunakan untuk memisahkan bahan dalam jumlah yang besar dan
waktu yang dibutuhkan dalam proses pemisahan relatif lebih cepat (Gritter et.al., 1991). Hasil
pemisahan dianalisis menggunakan KLT dan dilakukan penggabungan berdasarkan harga Rf
spot noda yang nampak pada kromatogram.

E. Centrifugal Preparative Thin Layer Chromatography (CPTLC)

Prinsip CPTLC sama seperti kromatografi kolom namun dengan aliran fasa gerak yang
dipercepat oleh gaya sentrifugal. Kromatografi ini menggunakan rotor miring dalam ruang
tertutup, sedangkan fasa diam berupa pelat kaca terlapisi silika gel. Pelat dipasang pada
motor listrik dan diputar pada kecepatan 800 rpm. Sampel dan fasa gerak dimasukkan ke
bagian tengah pelat sehingga mengalir dan merambat melalui fasa diam karena gaya
sentrifugal. Proses elusi dimonitor dengan lampu UV. Hasilnya berupa pita lingkaran yang
terputar keluar melalui tepi plat dan ditampung ke dalam botol fraksi (Hostettmann et.al.,
1995).
METODE

Isolasi (Sarker et.al., 2006)

1. Ekstraksi (Maserasi, Evaporasi)
Sampel ditimbang dan dimasukkan dalam wadah kaca. Pelarut ditambahkan pada sampel dan
didiamkan selama 24 jam. Filtrat diambil dan diganti dengan pelarut baru dengan setiap
penambahan pelarut, dan dibiarkan dimaserasi selama 24 jam hingga tiga perubahan pelarut.
Filtrat dipekatkan pada tekanan rendah menggunakan rotary evaporator dengan suhu water
bath di bawah 40oC.

2. Thin Layer Chromatography (TLC)/ Kromatografi Lapis Tipis (KLT)

Sebanyak 0,1gram ekstrak dilarutkan hingga homogen dengan pelarut yang sesuai. Fasa
diam/ Plat KLT dipotong sepanjang 5 cm dengan lebar 0,5 cm dan diberi garis menggunakan
pensil setinggi 0,75 cm dari bawah plat dan 0,25 cm dari atas plat. Pada garis bawah plat
ditotolkan larutan ekstrak menggunakan pipa kapiler. Plat tersebut dimasukkan dalam wadah
(chamber) yang telah terisi dengan fasa gerak selanjutnya wadah ditutup dengan rapat. Fasa
gerak dibuat dari berbagai campuran pelarut dengan perbandingan tertentu dan dibiarkan
beberapa saat hingga benar-benar jenuh (tercampur dengan baik). Volume fasa gerak dibuat
sedemikian rupa agar totolan pada plat KLT tidak terendam didalamnya. Fasa gerak
dibiarkan bermigrasi ke arah atas hingga mencapai garis atas plat KLT (proses elusi)
(Gambar III.2). Plat KLT hasil elusi diambil dari wadah dan dideteksi pemisahan spot
senyawanya menggunakan sinar UV dan penampak noda CeSO4.

Gambar III.2 Peralatan dan Prosedur KLT (Sarker et.al., 2006)

3. Vacuum Liquid Chromatography (VLC)/ Kromatografi Vakum Cair (KVC)

Fasa diam yang digunakan dalam KVC adalah silika gel 60 GF254 (E. Merck). Fasa diam ini
ditimbang dengan berat 20-40 kali berat sampel yang akan dipisahkan (tinggi kolom dibuat
±5 cm). Pembuatan kolom pemisahan dilakukan dengan menuang fase diam kering ke dalam
kolom kaca dan digetar sehingga fasa diam menjadi padat. Vakum digunakan untuk
mendapatkan kekompakan kemasan kolom yang optimal. Fase diam kemudian dibasahi
menggunakan pelarut n-heksan yang mengalir melewati kolom hingga sampai pada labu
penampung (Gambar III.3).

Ekstrak sebanyak 25 gram diimpregnasi dengan silika gel G60 sebanyak 2 kali berat sampel.
Selanjutnya sampel terinpregnasi dimasukkan di atas fasa diam secara merata (berikan batas
menggunakan kertas saring) dan siap dialiri menggunakan fasa gerak. Fasa gerak/ eluen
dibuat dari campuran pelarut yang memiliki pemisahan terbaik dari hasil analisis KLT. Fasa
gerak/eluen ini kemudian dituang ke dalam kolom sehingga mengalir melewati sampel dan
fasa diam. Pompa vakum digunakan untuk mempercepat proses pemisahan sehingga
diperoleh eluat didalam labu penampung yang diambil setiap 100 mL. Proses ini dilakukan
secara berulang dengan meningkatkan kepolaran fasa gerak, sehingga diharapkan seluruh
senyawa berhasil diperoleh dan membentuk beberapa kelompok senyawa.

Gambar III.3 Peralatan dan Prosedur KVC (Sarker et.al., 2006)

Kelompok-kelompok senyawa atau biasa disebut sebagai fraksi-fraksi yang diperoleh dari
hasil KVC dipekatkan menggunakan rotary evaporator dan dianalisis hasil pemisahannya
menggunakan KLT. Berdasarkan kromatogram hasil UV dan penampak noda, dilakukan
penggabungan fraksi yang memiliki kesamaan nilai Rf pada spot senyawanya. Fraksi-fraksi
senyawa ini selanjutnya dapat dipisahkan dan dimurnikan lebih lanjut menggunakan
Centrifugal Preparative Thin Layer Chromatography.

4. Centrifugal Preparative Thin Layer Chromatography (CPTLC)

Pembuatan Plat

Silika (Kieselgel 60 PF254 containing gypsum Merck Art 7749) sebagai fasa diam ditimbang
65 gram untuk plat 2 mm dan 100 gram untuk ketebalan 4 mm ditambahkan air suling 100
mL untuk ketebalan 2 mm dan 190 mL untuk ketebalan 4 mm didalam wadah yang memiliki
tutup. Selanjutnya dikocok selama 1 menit secara menyeluruh hingga homogen. Campuran
yang dihasilkan dituangkan ke rotor sampai ke tepi dan diketuk dengan lembut untuk
menghilangkan gelembung udara dan untuk memastikan lapisan tersebar merata. Plat
dikeringkan pada suhu kamar selama 30 menit dan dikeringkan di oven pada 50 oC selama 12
jam. Plat yang dihasilkan kemudian dikerok sesuai ketebalan yang diperlukan dan disimpan
dalam oven pada 50oC sebelum digunakan.

Proses Pemisahan

Proses pemisahan CPTLC dimulai dari pemasangan pelat kaca dalam alat, kemudian
dikencangkan dengan baut yang telah disediakan. Nyalakan listrik untuk menggerakkan
motor penggerak pelat dan alirkan n-heksan sampai kira-kira di tengah-tengah pelat.
Masukkan sampel (yang sudah dilarutkan dengan volume sekitar 1 pipet) tetes demi tetes
secara kontinu sampai semua sampel habis. Selanjutnya buka penutupnya sehingga pelarut
menguap semua dan alirkan kembali n–heksana sampai kira-kira di tengah-tengah pelat.
Elusi dengan eluen sambil dipantau menggunakan lampu UV. Tampung eluat yang keluar ke
dalam botol penampung dan teruskan proses elusi sampai semua pita yang terbentuk dalam
pelat kaca terelusi semua. Akhiri pengerjaan ini dengan mencuci pelat menggunakan
metanol. Deteksi atau uji eluat yang keluar dengan KLT dan gabungkan fraksi-fraksi yang
mempunyai Rf yang sama. Proses pemisahan diulang hingga diperoleh senyawa metabolit
sekunder.
Gambar III.4 Pemisahan senyawa pada CPTLC (Sarker et.al., 2006)