Makalah Kuliah

Pengembangan Agen Antimikroba Secara Etnofarmakologi

Diselesaikan Untuk Memenuhi Tugas Topik Mata Kuliah Etnofarmasi 19202

Dosen Pengampu:

apt. Bawon Triatmoko, S.Farm., M.Sc

Kelompok 3 :

Abim Syaifullah (172210101013)

Tazkiyatul Fithriyah (172210101014)

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS JEMBER

JUNI 2020
 ii

Daftar Isi

Sampul............................................................................................................................................i

Daftar Isi.........................................................................................................................................ii

Ringkasan.......................................................................................................................................3

A. Tinjauan Umum Uji Standard Antimikroba.............................................................................4

1. Metode Difusi...................................................................................................................6
2. Metode Dilusi (Pengenceran)...........................................................................................9
3. Metode Bio-autograph.....................................................................................................10
B. Skrining Antibakteri................................................................................................................13
1. Panel Organisme Uji.........................................................................................................13
2. Medium Pertumbuhan.....................................................................................................16
3. Inokulum..........................................................................................................................18

Daftar Pustaka................................................................................................................................20
 3

Ringkasan

Aktivitas antimikroba dari ekstrak alami dan senyawa murni dapat dideteksi dengan
mengamati respons pertumbuhan berbagai mikroorganisme terhadap sampel yang ditempatkan
bersentuhan dengannya. Metode uji antibakteri dan antijamur diklasifikasikan menjadi tiga
kelompok utama, yaitu metode difusi, dilusi, dan bioteknologi.

Adapun beberapa teknik difusi yaitu Teknik difusi paper disc (difusi cakram). Pengujian ini
digunakan untuk menetapkan kurva respons dosis untuk strain bakteri tertentu terhadap senyawa
atau ekstrak yang diberikan. Teknik agar baik. Dan Penilaian kritis uji difusi agar untuk aktivitas
antibakteri.

Bio-autografi adalah teknik yang berguna untuk menentukan senyawa bioaktif dengan
aktivitas antimikroba dari ekstrak tumbuhan. Metode bioautografi TLC menggabungkan
pemisahan kromatografi dan penentuan aktivitas in situ yang memfasilitasi lokalisasi dan isolasi
target-diarahkan dari konstituen aktif dalam campuran.

Selain parameter-parameter yang harus diperhatikan dalam pengembangan antimikroba,

diperlukan skrining terhadap agen agen yang dianggap bisa menjadi antimikroba. Untuk melajujan
skrining produk alam seperti: ekstrak mentah, fraksi kromatografi, senyawa murni, atau aktivitas
antimikroba, diperlukan sistem pengujian yang baik, ideal , simpel, cepat, efisien, sensitif, aman,
mudah direproduksi, dan tidak terlalu mahal dengan hasil yang semaksimal mungkin. Ada
beberapa hal dan komponen yang harus diperhatikan dalam skrining antimikroba, antara lain
panel organisme uji, medium pertumbuhan, dan inokulum.

Pilihan dari organisme uji tergantung tujuan spesifik dari penelitian yang dilakukan pada
skrining primer, strain referensi yang sensitif terhadap obat lebih suka digunakan dan seharusnya
merepresentasikan perbedaan kelas dari spesies yang patogen.
 4

A. Tinjuauan Umum Standard Uji Antimikroba

Antimikroba adalah zat-zat kimia yang didapatkan oleh fungi dan bakteri, zat tersebut
memiliki sebuah kemampuan untuk mematikan atau menghambat pertumbuhan kuman.
Antimikroba sebaiknya tidak menyebabkan resistensi pada kuman ataupun mikroba.
Dalam memilih mikroorganisme yang dipilih harus dipilih secara memadai dan jumlah
strain dari organisme uji harus disebutkan. Tes dapat dilakukan dengan strain pengumpul,
tetapi pengujian lebih lanjut dengan patogen terisolasi akan menarik dalam kasus ekstrak
aktif atau senyawa.
Aktivitas antimikroba dari ekstrak alami dan senyawa murni dapat dideteksi dengan
mengamati respons pertumbuhan berbagai mikroorganisme terhadap sampel yang
ditempatkan bersentuhan dengannya. Beberapa metode untuk mendeteksi aktivitas
tersedia, tetapi karena mereka tidak sama sensitifnya atau tidak berdasarkan pada prinsip
yang sama, hasilnya akan sangat dipengaruhi oleh metode tersebut.
Sistem uji antimikroba idealnya sederhana, cepat, dapat direproduksi, murah dan
memaksimalkan throughput sampel untuk mengatasi berbagai jumlah ekstrak dan fraksi
(Hostettman dkk., 1997). CLSI telah membakukan metode dilusi agar untuk penentuan
kuantitatif antibiotik. Metode pengenceran kaldu untuk penentuan penghambatan juga
direkomendasikan oleh CLSI, menggunakan prinsip yang berbeda untuk menilai
pertumbuhan mikroba atau penghambatannya.
Beberapa metode saat ini tersedia untuk mendeteksi aktivitas antimikroba mereka
dan karena tidak semua dari mereka didasarkan pada prinsip yang sama, hasil yang
diperoleh dipengaruhi tidak hanya oleh metode yang dipilih, tetapi juga oleh
mikroorganisme yang digunakan, dan oleh metode ekstraksi atau tingkat kelarutan
masing-masing senyawa uji.
Minimum inhibitory concentration, Salah satu tes paling sederhana yang tersedia
adalah yang digunakan untuk menemukan Minimum inhibitory concentration suatu
senyawa atau ekstrak. Ekstrak atau senyawa tanaman, dimasukkan ke dalam media
pertumbuhan berbasis agar yang sesuai, pada konsentrasi yang diketahui dilarutkan
secara seri dalam pengenceran dua kali lipat. Pelat agar dituangkan pada masing-masing
konsentrasi, dengan volume agar yang tetap untuk setiap lempeng. Piring kontrol juga
harus dituang, termasuk satu set piring yang menggabungkan kontrol positif, set kedua
untuk bahan pembawa saja, dan sepertiga dari agar saja. Set pertama dari kontrol
menunjukkan bahwa pengujian sebenarnya bekerja, yang kedua bahwa pelarut pembawa
tidak mengganggu pertumbuhan mikroba, dan yang ketiga bahwa bakteri dapat tumbuh
di bawah kondisi eksperimental.
 5

Piring dikeringkan sekitar 1 jam pada suhu kamar; ini untuk memungkinkan uap air
berlebih menguap. Mereka kemudian diinokulasi dengan 20 µl suspensi bakteri yang
mengandung 105 unit pembentuk koloni (CFU) ml-1. Sejumlah spesies bakteri yang
berbeda dapat diuji pada setiap lempeng. Jumlah unit pembentuk koloni dapat dengan
mudah ditentukan menggunakan hitungan pengenceran. Sejumlah kecil suspensi bakteri
diencerkan 104 kali dan disalut ke media pertumbuhan yang sesuai. Kultur diinkubasi, dan
jumlah koloni ditentukan setelah periode waktu yang tetap. Kurva kalibrasi disiapkan
untuk menunjukkan hubungan antara kerapatan optik dan jumlah unit pembentuk koloni
untuk spesies tertentu, pada usia kultur tertentu. Suspensi bakteri dari kepadatan optik
yang diberikan disiapkan untuk setiap pengujian yang dilakukan. Pertumbuhan diizinkan
untuk melanjutkan untuk periode waktu tertentu. Dengan bakteri patogen tanaman
biasanya 24, 36 atau 48 jam.
Konsentrasi terendah di mana bakteri tidak tumbuh diambil sebagai konsentrasi
penghambatan minimum. Nilai MIC dari potensi menarik terletak pada kisaran terendah
µg ml-1 seperti yang dicontohkan oleh senyawa fenolik yang ditunjukkan pada Tabel 1.

Tabel 1. Nilai MIC untuk isolasi senyawa fenolik dari Helichrysum Spp. (Cole, 1994)
Nilai MIC akan tergantung pada apakah bakteri gram positif atau gram negatif
digunakan, dan pada strain bakteri yang sedang digunakan. Biasanya, aktivitas melawan
bakteri gram negatif lebih menarik daripada aktivitas terhadap bakteri gram positif.
MIC menunjukkan konsentrasi senyawa uji terendah yang menghambat
pertumbuhan. Meskipun direproduksi dan menghasilkan nilai dinyatakan dalam expresse
µg / mL. Dalam bioassay difusi, MIC didefinisikan sebagai konsentrasi senyawa uji
terendah yang menyebabkan efek penghambatan yang terlihat, sementara dalam metode
pengenceran, MIC menunjukkan konsentrasi senyawa uji terendah yang benar-benar
menghambat pertumbuhan: sebenarnya, nilai-nilai ini tidak sebanding.
Pengukuran MIC telah digunakan secara luas untuk mengukur aktivitas antimikroba
dari minyak atsiri dan sejumlah variasi metode telah dipublikasikan. Prinsip pengujian
adalah bahwa organisme uji ditambahkan ke serangkaian pengenceran zat yang disiapkan
dalam media nutrisi padat atau cair, dan ada tidaknya pertumbuhan ditentukan setelah
 6

periode inkubasi. MIC dicatat sebagai konsentrasi agen terendah yang menghambat
pertumbuhan.
Metode uji antibakteri dan antijamur diklasifikasikan menjadi tiga kelompok utama,
yaitu metode difusi, dilusi, dan bioteknologi. Metode uji keempat dan yang akan datang
adalah uji konduksimetri, mendeteksi pertumbuhan mikroba sebagai perubahan
konduktivitas listrik atau impedansi media pertumbuhan (Sawai dkk., 2002)
1. Metode Difusi

Dalam teknik difusi, reservoir yang mengandung senyawa uji pada konsentrasi
yang diketahui dibawa ke dalam kontak dengan media yang diinokulasi dan diameter
zona bening di sekitar reservoir (diameter hambatan) diukur pada akhir periode
inkubasi. Untuk meningkatkan batas deteksi, sistem yang diinokulasi disimpan pada
suhu yang lebih rendah selama beberapa jam sebelum inkubasi untuk mendukung
difusi senyawa lebih dari pertumbuhan mikroba, sehingga meningkatkan diameter
penghambatan. Berbagai jenis reservoir dapat digunakan, seperti cakram kertas
saring, silinder baja tanpa noda yang diletakkan di permukaan dan lubang yang
dilubangi dalam medium.

Metode hole-punch adalah satu-satunya teknik difusi yang cocok untuk ekstrak
air, karena gangguan oleh bahan partikulat jauh lebih sedikit dibandingkan dengan
jenis reservoir lainnya. Untuk memastikan bahwa sampel tidak bocor di bawah
lapisan agar, agar tetap dibiarkan di bagian bawah lubang. (Cole, 1994). Persyaratan
sampel kecil dan kemungkinan untuk menguji hingga enam ekstrak per piring
terhadap mikroorganisme tunggal adalah keuntungan spesifik (Hadacek dan Greger,
2000).

Metode difusi tidak sesuai untuk menguji sampel atau sampel non-polar yang
tidak mudah berdifusi ke dalam agar-agar. Secara umum, potensi antimikroba relatif
dari sampel yang berbeda mungkin tidak selalu dibandingkan, terutama karena
perbedaan sifat fisik, seperti kelarutan, volatilitas dan karakteristik difusi dalam agar.
Selain itu, metode difusi agar sulit dijalankan pada platform penyaringan berkapasitas
tinggi.

Adapun beberapa teknik difusi adalah sebagai berikut :

a. Teknik difusi paper disc (difusi cakram).

Pengujian ini digunakan untuk menetapkan kurva respons dosis untuk
strain bakteri tertentu terhadap senyawa atau ekstrak yang diberikan. Yaitu
dengan cara: Piring agar yang berisi agar volume tetap dituang. Agar dapat
 7

diunggulkan dengan bakteri, dalam hal ini kepadatan inokulum harus

diketahui. Kepadatan ini kemudian harus digunakan untuk seluruh isolasi
bioassay yang dipandu. Inokulum harus didistribusikan secara merata ke
seluruh media agar. Jika agar saja dituang, pelat dibiarkan mengering selama
24 jam, dan kemudian diunggulkan dengan volume tetap dari suspensi
bakteri, dari kerapatan inokulum yang diketahui. Ini harus disebar merata ke
seluruh pelat menggunakan batang kaca steril.
Tes disc dimuat dengan larutan ekstrak uji atau senyawa, dan kemudian
dikeringkan. Pendekatan ini berarti bahwa berbagai jenis ekstrak atau
senyawa dapat diuji, asalkan pelarut mengering darinya. Beberapa pekerja
mencelupkan disk ke dalam solusi. Meskipun metode ini cepat, itu berarti
bahwa memuat ke disk yang berbeda mungkin tidak tepat. Metode yang lebih
baik adalah memuat disk dengan volume larutan yang tetap dari konsentrasi
yang diketahui. Disk dan disk yang tidak dirawat yang hanya ditambahkan
pelarut pembawa, serta kontrol positif, semua harus dimasukkan. Disk
diletakkan di atas agar agar, setiap lempeng harus termasuk positif dan
negative kontrol, selain cakram yang dirawat.
Setelah interval waktu yang sesuai, dan ketika zona hambatan terlihat
jelas di sekitar kontrol positif, zona hambatan harus diukur ke 0,1 mm
terdekat, menggunakan sepasang kaliper vernier. Ini harus dilakukan dengan
melintasi dua diameter tegak lurus untuk setiap disk.
Kertas atau Cakram serat kaca dapat digunakan, meskipun jenis standar
harus digunakan di seluruh isolasi bioassay yang dipandu senyawa aktif.
Cakram serat kaca memiliki keuntungan karena mereka secara nutrisi bersifat
inert terhadap mikroorganisme (tetapi tidak secara kimia, karena mereka
dapat menyerap senyawa yang sangat polar). Cakram kertas lebih murah,
tetapi dapat digunakan sebagai sumber karbon oleh mikroorganisme. Jenis
apa pun yang dipilih, mereka harus diautoklaf sebelum digunakan.
b. Teknik agar baik
Sumur kecil dipotong agar-agar menggunakan penggerek gabus atau
instrumen serupa. Perawatan harus diambil untuk memastikan bahwa
instrumen disterilkan sebelum memotong masing-masing sumur, dan bahwa
lubang yang dipotong melingkar. Seperti halnya tes antijamur, beberapa
pekerja menutup sumur di bagian bawah dengan volume agar-agar cair yang
sedikit. Ini mengurangi risiko rembesan ekstrak antara agar-agar dan dasar
wadah. Volume larutan yang tetap dimasukkan ke sumur yang sesuai. Kontrol
 8

harus mencakup kontrol positif, kontrol pelarut pembawa, dan kontrol tanpa
sampel. Setelah periode waktu yang sesuai, ketika zona hambatan di sekitar
kontrol positif didefinisikan dengan baik, zona hambatan diukur.
c. Penilaian kritis uji difusi agar untuk aktivitas antibakteri
Dalam pengujian difusi cakram dan dalam teknik sumur agar, ukuran zona
hambatan dapat dipengaruhi oleh sejumlah faktor. Mungkin salah satu yang
paling penting adalah inokulum densit, semakin besar densitasnya, semakin
kecil zona hambatannya. Untuk alasan ini inokulum yang tetap harus
digunakan di seluruh isolasi komponen aktif dari campuran. Faktor lain yang
sangat penting adalah volume solusi yang diterapkan. Meningkatkan jumlah
cairan yang ditempatkan di sumur meningkatkan difusi senyawa atau
mengekstrak melalui agar-agar. Volume tetap harus selalu digunakan untuk
melepaskan campuran uji atau senyawa. Pengaruh ketiga pada lebar zona
hambatan adalah lamanya waktu pengujian diizinkan untuk dilanjutkan.
Seiring meningkatnya durasi pengujian, maka zona hambatan berkurang. Ini
bisa jadi karena (i) ada kemungkinan bahwa dalam mikroorganisme suatu
mekanisme detoksifikasi diinduksi, dan / atau (ii) senyawa-senyawa tersebut
berdifusi dari sumur, menghasilkan konsentrasi yang lebih rendah.
Dengan menggunakan pengujian tersebut, jika sejumlah senyawa diuji
dalam kondisi yang identik, hubungan struktur-aktivitas dapat ditentukan.
Akan tetapi, ini membuat asumsi bahwa molekul-molekul berbeda dari jenis
yang diberikan semuanya memiliki mobilitas yang serupa dalam medium agar.
Mungkin bukan ini masalahnya.
Seperti halnya uji antijamur, teknik difusi cakram tidak memungkinkan
konsentrasi senyawa uji atau ekstrak yang mencapai mikroorganisme
diketahui. Lebih lanjut, nasib senyawa uji tidak dapat ditentukan

Tes difusi cakram dan sumur telah menjadi metode pilihan banyak pekerja untuk
perbandingan aktivitas antimikroba dari minyak atsiri. Prinsip metode ini adalah
bahwa sampel uji akan berdifusi ke dalam media agar, menghasilkan gradien
konsentrasi. Jika antimikroba efektif terhadap mikroorganisme uji, zona
penghambatan akan terbentuk di sekitar sumur atau cakram. Ukuran zona
memberikan beberapa indikasi aktivitas relatif zat, namun, sejumlah faktor termasuk
volume dan jenis media, konsentrasi dan usia inokulum, kondisi inkubasi dan ukuran,
muatan ion dan konformasi dari bahan-bahan aktif semua akan mempengaruhi hasil .
Teknik ini telah distandarisasi untuk pengujian antibiotik untuk memberikan hasil
 9

yang dapat direproduksi, yang berkorelasi dengan nilai MIC, tetapi ada sejumlah
kelemahan ketika metode ini diterapkan pada pengujian yang tidak larut dalam air.
minyak esensial, dan hasil yang tidak konsisten dan kurangnya korelasi dengan nilai
MIC.

2. Metode Dilusi (Pengenceran)

Dalam metode pengenceran, senyawa uji dicampur dengan media yang sesuai
yang sebelumnya telah diinokulasi dengan organisme uji. Ini dapat dilakukan dalam
media cairan maupun di media padat dan pertumbuhan mikroorganisme dapat
diukur dengan beberapa cara. Dalam metode pengenceran agar, Minimal Inhibitory
Concentration (MIC) didefinisikan sebagai konsentrasi terendah yang mampu
menghambat pertumbuhan mikroba yang terlihat. Dalam metode pengenceran
cairan atau kaldu, indikator kekeruhan dan redoks paling sering digunakan.
Kekeruhan dapat diperkirakan secara visual atau diperoleh dengan lebih akurat
dengan mengukur kepadatan optik pada 405 nm. Namun, sampel uji yang tidak
sepenuhnya larut dapat mengganggu pembacaan kekeruhan, menekankan perlunya
kontrol negatif atau kontrol sterilitas, yaitu ekstrak dilarutkan dalam media kosong
tanpa mikroorganisme. Metode cairan-pengenceran juga memungkinkan penentuan
apakah suatu senyawa atau ekstrak memiliki aktivitas cidal atau statis pada
konsentrasi tertentu. Konsentrasi bakterisidal atau fungisidal minimal (MBC atau
MFC) ditentukan oleh sampel pelapisan kultur pengenceran yang sepenuhnya
dihambat dan menilai pertumbuhan (statis) atau tidak ada pertumbuhan (cidal)
setelah inkubasi. Saat ini, indikator redoks MTT dan resazurin sering digunakan untuk
mengukur bakteri dan pertumbuhan jamur. (Eloff, 1998).
Resazurin memiliki keuntungan untuk tidak mengendap pada pengurangan,
memungkinkan pembacaan langsung. Pengukuran yang mudah dan dapat
direproduksi dapat diperoleh dengan microplate-reader, tetapi pembacaan visual
juga dapat digunakan dalam kasus di mana spektrofotometri tidak tersedia.
Pengujian lain mengeksploitasi prinsip bahwa hanya sel-sel hidup yang mengubah
fluorescein-diasetat menjadi fluoresen, menghasilkan fluoresensi kekuningan-hijau di
bawah sinar UV. Namun, itu membutuhkan investasi yang lebih signifikan dalam
peralatan dan validasi tidak mudah: Sabouraudliquidmedium dapat menyelesaikan
hingga 95% offluorescence, dan buffer natrium fosfat menghidrolisis fluorescein-
diasetat. Konstituen fluoresen hadir dalam ekstrak tanaman mentah juga dapat
mengganggu. Secara umum, metode pengenceran sesuai untuk menguji ekstrak
 10

polar dan non-polar atau senyawa untuk penentuan nilai MIC dan MBC / MFC.
Dengan menggunakan indikator redoks atau titik akhir turbidimetri, efek dosis-
respons memungkinkan perhitungan nilai IC 50 dan IC90, yang merupakan konsentrasi
yang diperlukan untuk menghasilkan penghambatan pertumbuhan 50 dan 90%.
Dengan menggunakan metode dilusi agar, dapat menentukan sebuah konsentrasi
terendah ekstrak tumbuhan dan asam fenolat yang dapat dinyatakan sebagai nilai
MIC, dalam kondisi pengujian, dapat menghambat pertumbuhan bakteri. Secara
umum nilai MIC yang diperoleh dengan metode pengenceran agar 3-20 kali lebih
rendah dari nilai MIC yang diperoleh dengan metode difusi disk, terlepas dari
pengujian ekstrak tanaman.
Korelasi yang baik dalam kisaran sensitivitas diperoleh untuk aktivitas antibakteri
yang diukur dengan metode pengenceran agar dan pengenceran kaldu untuk bakteri
gram positif seperti B. cereus dan S. aureus tetapi tidak untuk bakteri gram negatif di
mana lebih rendah konsentrasi ekstrak tanaman cukup untuk menghambat
pertumbuhan dengan metode dilusi kaldu
Metode pengenceran agar mengatasi masalah kekeruhan dan indikator yang
terkait dengan metode kaldu dan dapat dimodifikasi agar sesuai dengan organisme
apa pun dengan mengubah media pertumbuhan dan kondisi inkubasi. (Griffin dkk.,
tanpa tahun)
3. Metode Bio-autographic
Bio-autografi adalah teknik yang berguna untuk menentukan senyawa bioaktif
dengan aktivitas antimikroba dari ekstrak tumbuhan. Metode bioautografi TLC
menggabungkan pemisahan kromatografi dan penentuan aktivitas in situ yang
memfasilitasi lokalisasi dan isolasi target-diarahkan dari konstituen aktif dalam
campuran. Secara tradisional, teknik bioautografi telah menggunakan penghambatan
pertumbuhan mikroorganisme untuk mendeteksi komponen anti-mikroba dari
ekstrak yang dikromatografi pada lapisan TLC. Metodologi ini telah dianggap sebagai
uji yang paling manjur untuk mendeteksi senyawa anti-mikroba (Shahverdi dkk.,
2007) .
Zona penghambatan yang dihasilkan pada pelat TLC oleh salah satu teknik
bioautografi yang akan digunakan untuk memvisualisasikan posisi senyawa bioaktif
dengan aktivitas antimikroba dalam sidik jari TLC dengan mengacu pada nilai Rf. Pelat
TLC preparatif dengan ketebalan 1mm disiapkan menggunakan fase diam dan
bergerak yang sama seperti di atas, dengan tujuan mengisolasi komponen bioaktif
yang menunjukkan aktivitas antimikroba terhadap strain uji. Daerah-daerah ini
diambil dari lempengan, dan zat dielusi dari silika dengan etanol atau metanol.
 11

Sampel yang dielusi selanjutnya dimurnikan menggunakan metode kromatografi

preparatif di atas. Akhirnya, komponen diidentifikasi oleh HPLC, LCMS dan GCMS.
Metode bioautography agar lapisan menguntungkan dalam hal itu, pertama
menggunakan sampel sangat sedikit jika dibandingkan dengan metode difusi cakram
normal dan karenanya, dapat digunakan untuk isolasi senyawa yang dipandu oleh
bioassay. Kedua, karena ekstrak kasar dipecah menjadi komponen-komponen yang
berbeda, teknik ini menyederhanakan proses identifikasi dan isolasi senyawa bioaktif
(Rahalison dkk., 1991)
Bioautografi, sebagai metode untuk melokalisasi aktivitas antibakteri pada
kromatogram, telah menemukan aplikasi luas dalam pencarian antibiotik baru.
Namun, hampir semua prosedur yang diterbitkan didasarkan pada apa yang disebut
teknik difusi agar, di mana senyawa antibakteri dipindahkan dari lapisan kromatografi
ke pelat agar yang diinokulasi melalui proses difusi. Zona hambatan kemudian
divisualisasikan oleh noda vital yang sesuai. Prosedur ini memiliki beberapa
kelemahan dan membutuhkan penggunaan peralatan mikrobiologis yang sesuai.
Mempertimbangkan masalah yang timbul karena difusi senyawa yang berbeda dari
kromatogram ke lempeng agar.
Prinsip uji ini adalah sebagai berikut: Suspensi mikroorganisme dalam kaldu yang
cocok diterapkan pada pelat tlc lalu dikembangkan. Inkubasi pada atmosfer yang
lembab memungkinkan pertumbuhan bakteri. Zona inhibisi kemudian
divisualisasikan oleh reagen pendeteksi aktivitas dehrogenase, yaitu, garam
tetrazolium. Bakteri aktif secara metabolik mengubah garam tetrazolium menjadi
formazan berwarna pekat. Dengan demikian, senyawa antibakteri muncul sebagai
bintik-bintik bening terhadap latar belakang berwarna.
Bio-autografi melokalkan aktivitas antimikroba pada kogramogram menggunakan
tiga pendekatan: (a) bio-autografi langsung, di mana mikroorganisme tumbuh
langsung pada pelat kromatografi lapis tipis (TLC), (b) contactbio-autography, di
mana senyawa antimikroba dipindahkan dari lempeng TLC ke lempeng agar yang
diinokulasi melalui kontak langsung dan (c) bioreautografi agar-overlay, di mana
media agar berbiji diterapkan langsung ke pelat TLC. (Cordell dan Hamburger, 1987).
Meskipun sensitivitasnya tinggi, aplikasinya terbatas pada mikroorganisme yang
mudah tumbuh di pelat TLC. Masalah lain adalah perlunya penghapusan lengkap
pelarut volatil rendah residu, seperti n-BuOH, asam trifluoroasetat dan amonia dan
transfer senyawa aktif dari fase diam ke lapisan agar dengan difusi. Karena bio-
autografi memungkinkan pelokalan aktivitas antimikroba dari ekstrak pada
kromatogram, ia mendukung pencarian cepat untuk agen antimikroba baru melalui
 12

isolasi yang dipandu oleh bioassay. Namun demikian, teknik ini tidak secara langsung
dapat diterapkan dalam desain penyaringan kapasitas tinggi saat ini.
Salah satu cara untuk memecahkan masalah menentukan berapa banyak senyawa
yang telah ditemui adalah dengan menggunakan bioautografi TLC. Sejumlah senyawa
yang diketahui diaplikasikan pada pelat TLC dan dikembangkan dalam fase gerak
yang sesuai. Setelah pengeringan, pelat TLC disemprot dengan suspensi bakteri
dengan kepadatan inokulum yang diketahui, dan pertumbuhan bakteri dapat
diamati. Namun, setelah inkubasi telah terjadi, mungkin sulit untuk menentukan
apakah bakteri telah tumbuh. Salah satu metode untuk mengatasi masalah ini adalah
menyemprot pelat TLC, setelah di inkubasi, dengan pewarnaan peka redoks. Contoh
yang diberikan pada Tabel 1. Di bawah cahaya putih yang terjadi, zona
penghambatan pertumbuhan bakteri muncul sebagai bintik-bintik cahaya pada latar
belakang berwarna. Perlakuan dan kontrol yang sama diterapkan pada bioautografi
jamur harus diterapkan pada bioautografi antibakteri. Bakteri uji yang sesuai
termasuk Pseudomonas syringae, Bacillus subtilis, Sarcina lutea dan Escherichia coil.

Tabel 2. Garam Tetrazolium digunakan sebagai visualisasi bioautography

antibakteri. (Cole, 1994)
TLC adalah prosedur sederhana, cepat, dan murah yang memberikan peneliti
jawaban cepat untuk berapa banyak komponen dalam campuran. TLC juga dapat
digunakan untuk mendukung sebuah identitas suatu senyawa dalam suatu campuran
ketika Rf suatu senyawa dibandingkan dengan Rf dari suatu senyawa yang dikenal.
Tes tambahan melibatkan penyemprotan reagen skrining fitokimia, yang
menyebabkan perubahan warna sesuai dengan fitokimia yang ada dalam ekstrak
tanaman; atau dengan melihat pelat di bawah sinar UV. Ini juga telah digunakan
untuk konfirmasi kemurnian dan identitas senyawa yang terisolasi.
 13

B. Skrining antibakteri
Seiriring bertambahnya kegagalan antimikroba yang ada untuk mengobati suatu
penyakit, banyak dari ahli dan peneliti fokus untuk mengidentifikasi dari produk bahan alam
untuk memproduksi molekul bioaktive untuk terapi pengobatan (Valgas dkk., 2007).
Bermacam macam metode telah ditemukan, hasil yang diperoleh akan sangat dipengaruhi
tidak hanya dari metode, namun juga oleh mikroorganisme yang digunakan untuk melakukan
pengujian, dan oleh tingkat kelarutan dari komponen bahan yang di uji (Valgas dkk., 2007).
Untuk melakukan skrining produk alam seperti: ekstrak mentah, fraksi kromatografi, senyawa
murni, atau aktivitas antimikroba, diperlukan sistem pengujian yang baik, ideal , simpel, cepat,
efisien, sensitif, aman, mudah direproduksi, dan tidak terlalu mahal dengan hasil yang
semaksimal (Sarker dkk., 2007). Dalam skrining antibakteri terdapat beberapa hal dan
komponen yang harus diperhatikan, yaitu:
1. Panel organisme uji
Pilihan dari organisme uji tergantung tujuan spesifik dari penelitian yang dilakukan
(Cos dkk., 2006). pada skrining primer, strain referensi yang sensitif terhadap obat lebih
suka digunakan dan seharusnya merepresentasikan perbedaan kelas dari spesies yang
patogen. Berbagai kombinasi bisa digunakan, namun panel harus setidaknya terdiri dari
bakteri gram positif dan bakteri gram negatif, seperti tertera pada tabel (1) (Cos dkk.,
2006). Dari hasil tabel menunjukkan bahwa bakteri gram positif lebih banyak yang sensitif
untuk aksi obat daripada bakteri gram negatif. Ekstrak dengan aktivitas yang menonjol
melawan bakteri cocus gram positif seharusnya juga diuji terhadap resisten methicillin
Staphylococcus aureus (MRSA) dan resisten vancomicin Enterococci (VRE), untuk mewakili
kebutuhan medis pada saat ini (Mah dan Toole, 2001). Banyak bakteri yang tumbuh bebas
dalam bentuk planktonik dengan memproduksi polimer ekstraseluler di bagian
permukaan seperti biofilm (Mah dan Toole, 2001).
Pada penelitian yang dilakukan oleh (Sarker dkk., 2007) dilakukan diabawah kondisi
aspetis menggunakan plate 96 steril yang sudah dilabeli, terlihat pada gambar (1).
 14

Material dengan volume 100 μl pada 10% (v/v) DMSO atau air steril dipipet kedalam baris
pertama. Untuk semua sumuran lainnya diberikan 50 μl nutrien broth atau normal saline,
pengenceran dilakukan dengan menggunakan pipet multichannel, untuk setiap 10 μl,
indikator resazurin ditambahkan. Lalu menambahkan broth
 15

Tabel 3. (Cos dkk., 2006)

Gambar 1. (Sarker dkk., 2007)

isosensitif pada setiao sumuran untuk memastikan volume akhir dari nutrien both.
Terakhir, 10 μl suspensi bakteri (5x10 6 cfu/ml), setiap plate diberi plastik wrap untuk
menjamin bakteri tidak dehidrasi, setiap plat memiliki kontrol: kolom dengan antibiotik
spektrum luas sebagai kontrol positif. Sebuah kolom dengan semua dengan semua
larutan dengan pengecualian larutan bakteri ditambahkan 10 μl nurtien broth (Sarker
dkk., 2007). Plate yang sudah disuapkan dalam 3 replikasi, dan ditempatkan dalam
inkubator pada suhu 37 0C selama 18-24 jam, perubahan warna dilihat secara visual.
Setiap perubahan warna menjadi pink atau tidak berwarna maka positif (Sarker dkk.,
2007). Pada penelitian yang dilakukan oleh (Kloucek dkk., 2005) menggunakan strain
bakteri dari Bacillus cereus ATCC 11778, Bacillus subtilis ATCC 6633, Bacillus fragilis ATCC
25285, Enterococcus faecalis ATTC 29212, Eschericia coli ATCC 25922, Pseudomonas
aeruginosa ATCC 27853, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Staphylococcus
epidermidis ATCC 12228, dan Streptococcus pyogenes ATCC 19615. Pengujian aktivitas
antimikroba secara in-vitro ditentukan dengan metode microdilusi menggunakan
mikroplate 96 sumuran. Pertumbuhan mikroorganisme diamati kekeruhannya dengan
menggunakan spektrofotometer UV vis pada 600 nm (Kloucek dkk., 2005).
 16

Pada penelitian yang dilakukan oleh (Essawi dan Srour, 2000) pada pengujian
aktivitas antimikroba menggunakan kultur bakteri Bacillus subtillis sebagai bakteri
anaerobik bentuk spora, Escherichia coli, Staphylococcus aureus yang sensitif terhadap
methicillin, Staphylococcus aureus yang resisten terhadap methicillin. Strain bakteri yang
digunakan adalah Escherichia coli ATCC 25922, Staphylococcus aureus ATCC 25923,
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, dan Enterococcus faecalts ATCC 29212.
Selanjutnya bakteri dikultur semalaman pada suhu 35 0C dalam nutrien agar (Essawi dan
Srour, 2000). Aktivitas antibakteri ditentukan dengan metode difusi disc dengan cara
melarutkan ekstrak tanaman pada dimethylsulfoksida (DMSO), 1 g/1 ml, dan ekstrak cair
dilarutkan dalam air 1 g/1 ml, lalu kedua ekstrak disterilisasi dengan filtrasi
menggunakan membran filter ukuran 0,45 μm (Essawi dan Srour, 2000). Hasilnya,
terdpat perbedaan yang dapat dikaitkan fakta bahwa dinding sel dari bakteri gram
positif terdiri dari satu lapis, sedangkan pada bakteri gram negatif memiliki dinding sel
terdiri dari beberapa lapis dan lebih kompleks. Sebagian ekstrak menunjukkan aktivitas
antimikroba terhadap Staphylococcus aureus resisten terhadap methicillis MRSA.

Pada penelitian yang dilakukan oleh (Valgas dkk., 2007) dilakukan uji aktivitas
antimikroba menggunakan dua spesies bakteri yaitu Staphylococcus aureus ATCC 25923
dan Escherichia coli ATCC 25922 yang disimpan dalam BHI pada suhu -20 0C. 300ml pada
setiap kultur stok ditambah 3 ml BHI broth lalu di tunggu semalam pada suhu 36 0C ± 10C
dan kultur yang murni di cek setelah 8 jam inkubasi. Pada penelitian yang dilakukan oleh
(Chen dkk., 1989) melakukan uji antibakteri dengan menggunakan bakteri Streptococcus
mutans MT 5091 dan Streptococcus mutans OMZ 176, kedua bakteri diamati pada brain
heart infusion agar dan di subkultur setiap dua bulan.

2. Medium pertumbuhan
Medium pertumbuhan digunakan untuk media pertumbuhan dari mikroba yang
akan diuji. Terdapat berbagai macam jenis dari media pertumbuhan yang bisa
digunakan, secara umum dapat menggunakan Mueller Hinton (MH) agar atau broth dan
trypict soy agar atau broth (TSA atau TSB) yang biasa digunakan untuk bakteri (Cos dkk.,
2006). Pertumbuhan dari mikroorganisme yang sangat rewel, seperti Streptococcus
penumonae dan Legionella pneumophilla, dapat memerlukan media yang lebih
kompleks, penyuburan dari atomsfer inkubasi dengan 5% CO 2 dan atau extension pada
waktu inkubasi. Adanya sedikit perbedaan pada komposisi medium pertumbuhan dapat
sangat mempengaruhi aktivitas antibakteri pada komponen (Cos dkk., 2006).
Contohnya, pada penelitian yang dilakukan oleh (Butaye, 2000) bahwa pada medium
Mueller Hinton, semua strain dari E. foecium, E. hirae, E. gallinaum, dan E. casseliflavus
 17

menunjukkan peningkatan MIC pada flavomycin yaitu sebesar 0,12 sampai 1mg/L,
ditemukan dengan bakteri strain E. faecalts, E. durans, dan E. avium. Pada saat medium
ditambahkan suplemen berupa darah domba, hasilnya meningkakan MIC sebanya 11
kali lipat, dari sebelumnya 0,12 mg/L menjadi 256 mg/L (Butaye, 2000). Oleh karena itu,
pilihan pasti untuk medium pertumbuhan sangat penting untuk membandingkan
perbedaan komponen antibakteri atau ekstak.
Mueller Hinton (MH) agar juga baik untuk pertumbuhan bakteri yang tidak rewel
dan secara umum lemah dalam melawan. Pada penelitian yang dilakukan oleh National
Comitte for Clinical Laboratory Standar (NCCLS) Amerika Serikat (Testing, 2000) bahwa
suplemen tidak seharusya digunakan kecuali kalau digunakan untuk menumbuhkan
organisme. Lima persen darah defibrinasi ditambahkan untuk organisme yang rewel,
seperti Streptococcus dan Moraxella catarrhalis. Beberapa supleme untuk Haemophillus
sp, dan Neisseria sp, telah disarankan namun masih diperlukan evidence lebih lanjut.
Lima persen darah defibrinasi dengan 20 mg/L NAD, lima persen darah coklat, dan
suplemen agar GC telah disarankan (Testing, 2000). Mueller Hinton agar juga dipakai
pada penelitian yang dilakukan oleh (Paulo dkk., 1994), dengan metode mikrodilusi pada
rentang konsentrasi 1 mg/ml sampai 15 μg/ml untuk ekstrak 100 μg/ml untuk 1,5 μg/ml
untuk isolasi alkaloid. Sampel ditambahkan pada medium Mueller Hinton steril sebagai
larutan di 10% metanol kecuali ekstrak air. Pelarut ditambahkan dan diukur nilai MIC
pada konsentasi terendah yang mana menghambat pada pertumbuhan dan pengujian
mikroorganisme setelah 24 jam inkubasi pada suhu 37 0C (Paulo dkk., 1994).
Medium pertumbuhan lain yang sering digunakan untuk penelitian adalah nutrien
agar seperti pada penelitian yang dilakukan oleh (Hood dkk., 2003). Nutrien agar
digunakan pada metode uji absorbsi agar. Nutrien agar dikeringkan di inkubator pada
suhu 370C, lalu 500 μl sampel minyak esensial dipipet kedalam permukaan agar,
spreader digunakan untuk spread semua permukaan dari plate agar dan sampel minyak
dapat masuk ke agar. Plate kemudian dapat dipindahkan ke temperatur ruang selama 30
menit, lalu dikeringkan dalam inkubator suhu 37 0C selama 30 menit, kemudian
dimasukkan kedalam wadah selama semalam (Hood dkk., 2003). Selain menggunakan
metode uji absorbsi agar, media pertumbuhan nutrien agar juga digunakan pada
metode uji disc diffusion (Hood dkk., 2003). 20 ml nutrien agar dibalik dan dikeringkan
pada suhu 370C selama 30 menit, bakteri yang telah dikultur selama semalam sebanyak
0,5 ml disebar diatas permukaan plate agar menggunakan spreader yang steril,
kemudian diinkubasi pada suhu 370C selama 30 menit. 10 μl tiap sampel minyak
ditempatkan dalam 6mm cakram antimikroba (Hood dkk., 2003).
 18

Selain menggunakan metode uji absorbsi agar dan disc diffusion, medium
pertumbuhan dapat menggunakan metode yang lain yaitu uji broth dilution. Pada
penelitian yang dilakukan oleh (Hood dkk., 2003), minyak dengan bentuk emulsi
dimasukkan kedalam media larutan yang akan diuji, sampel minyak ditambahkan pada
sterile eppendorf tube dan 1/10 volume dari minyak pada 10% larutan dari tween 80 di
air, lalu di campur dengan cara di vortex. Lalu campuran alikuot ditambahkan dalam 10 –
20 μl alikuot, dilakukan vortex singkat diantara setiap penambahan. Kemudian
dilanjutkan sampai perbandingan larutan dengan minyak adalah 2:1 dan volume akhir
adalah sebesar 4,5 ml. Kemudian ditambah dengan bakteri yang sudah diklultur selama
satu malam dengan volume 500 μl pada setiap tube. Tiga kontrol tube yang salah satu
mengandung 0,02 % tween 80 dalam nutrien broth dan satunya mengandung 100 μl
minyak kanola, dan satunya hanya berisi nutrien broth disiapkan. Selanjutnya
diencerkan 10 kali dengan nutrien broth steril untuk mendapatkan konsentrasi akhir 10 -
7
. 500 μl untuk 10-5, 105, dan 107 merupakan hasil pengenceran menggunakan nutrien
agar dengan spreader mengandung alkohol menyala, lalu plate diinkubasi selama satu
malam pada suhu 370C dan dihitung jumlah koloni bakteri yang tumbuh (Hood dkk.,
2003).
Pada penelitian yang dilakukan oleh (Hood dkk., 2003), selain menggunakan
medium pertumbuhan nutrien agar padat, juga menggunakan nutrien agar cair, medium
pertumbuhan ini digunakan pada metode uji dilusi agar. 15 ml nutrien agar cair dialikuot
kedalam cawan petri plastik dan di set, 5 ml agar yang mengandung konsentrasi 2%
sampel minyak, dengan atau tanpa 0,02% tween 80 dtiambahkan ke setiap plate. Dua
plate kontrol digunakan, satu dengan agar saja dan satunya agar dan ditambahkan
0,02% tween 80. Setelah diinokulasi selanjutnya diinkubasi pada suhu 37 0C selama
semalam, pertumbuha bakteri diukur pada skala nol (tidak ada pertumbuhan) sampai
empat (kontrol pertumbuhan) (Hood dkk., 2003). Selain menggunakan metode uji dilusi
agar, medium pertumbuhan nutrien agar cair digunakan pada metode difussion
sumuran (Hood dkk., 2003). 19 ml nutrien agar cair diinokulasi dengan 0,5 ml bakteri
Staphylococcus aureus atau Escherichia coli yang telah dkultur semalam. Inokulan
dituang pada cawan petri dan dibiarkan set. Empat sumuran dibuat menggunakan 6 mm
pengerek gabus, lalu memasukkan kedalam sumuran sebanyak 100 μl salah satu minyak
murni M alternifolia, minyak S spicatum. Plate diinkubasi pada suhu 37 0C selama
semalam dan diamati zona penghambatannya.
Pada penelitian yang dilakukan oleh (Sarker dkk., 2007) menggunakan medium iso
sensitest, ini sebagai buffer pH. Pada hasil pengujian dengan menggunakan medium iso
 19

sensites menunjukkan hasil yang komparable untuk sebagian strain yang diuji. Pada
penelitian yang dilakukan oleh (Dimayuga dan Garcia, 1991) untum medium
pertumbuhan digunakan peptone agar dengan konsentrasi 10 – 20 % agar pada pH 7,0 –
7,4. Lalu agar disterilisasi selama 15 menit pada suhu 120 0C. Sekitar 20 ml medium
ditambahkan ke setiap 100 mm cawan petri steril dan dijaga selam 24 jam dengan
mengontrol secara steril.
3. Inokulum
Tingkatan infeksi, yaitu konsentrasi inokulum dapat memberikan pengaruh yang
mendalam pada potensi antibakteri dan antijamur sampel, mendukuk kebutuhan
standarisasi inokulum (Testing, 2000). Standarisasi kepadatan inokulum untuk
memberikan 104 colony forming unit (CFU) tiap spot dari agar, penggunaan empat atau
5 koloni dari kultur murni untuk menghindari seleksi varian yang atipikal. Inokulum
disiapkan dengan mengemulsi koloni selama semalam dari medium agar atau dengan
dilusi kultur broth, broth yang digunakan harus yang tidak antagonis terhadap agen yang
diuji. 0,5 Mc Flaran standar dapat digunakan untuk membandingkan visual dari suspensi
untuk menyesuaikan kepadatan suspensi sekitar 10 8 CFU/ml. Kemudian plat
diinokulaskan dalam 30 menit inokulum standar, untuk menghindari kepadatan
inokulum (Testing, 2000). Proses untuk inokulum kedalam plate yaitu dengan menandai
plate sehingga orientasinya jelas. Lalu pindahkan suspesi bakteri yang sudah di delusi ke
dalam sumuran dari replikasi inokulum. Gunakan apparatus untuk memindahkan
inokulum ke plate agar, termasuk mengontrol plate dari agen antimikroba. Kemudian
replikator pin dengan diameter 2,5 mm dipindahkan sebanyak 1 μl inokulum 10 4
CFU/spot, atau alternatifnya mikropipet atau lingkaran standar dapat digunakan untuk
plate inokulum. Taruh spot inokulum untuk dikeringkan pada temperatur ruang sebelum
dibalik pada plat untuk dilakukan inkubasi. Pada inokulum dengan konsentrasi yang
sangat rendah seperti 102 CFU/ml akan menghambat pembacaan endpoint dan
peningkatan peluang dari kultur semalam atau dari stok biofreeze yang ada, ini dapat
direkomendasikan untuk mengumpulkan kultur selama pertumbuhan selama fase
logaritmik dan selalu diambil empat atau lima koloni dari kultur murni pada agar (Cos
dkk., 2006). Pada penelitian yang dilakukan oleh (Valgas dkk., 2007) inokulum berupa
suspensi bakteri diencerkan dengan larutan fisiologi steril, untuk difusi dan tes
bioautigrafi indirect. Untuk tes bioautografi direct sspensi bakteri (inokulum) diencerkan
dengan BHI broth untuk mencapai kepadatan 10 9 CFU/ml. Pada penelitian yang
dilakukan oleh (Chen dkk., 1989) dilakukan penyiapan inokulum, dengan cara organisme
di inokulas pada 2 ml brain heart infusion broth dan diinkubasi selama 16 sampai 18 jam
 20

pada suhu 350C, kultur kemudian disesuaikan dengan salin steril untuk mendapatkan
turbiditas yang komparable terhadap standar Mc Farland nomor 0,5 yang mana ekivalen
dengan 2 – 5 x 107 koloni forming unit (CFU) per ml. Inokulum dibuat dalam 30 menit
setelah preparasi dari inokula, untuk uji aktivitas antibakteri pada adanya 5 % sukrosa,
sel Streptococcus mutans dilakukan prekultur pada brain heart infusion broth yang
mengandung 5% sukorsa dan konsentrasi sel disesuaikan dengan standar Mc Farland
nomor 0,5 yang mana ekivalen dengan 2 – 5 x 10 7 koloni forming unit (CFU) per ml (Chen
dkk., 1989).
 21

Daftar Pustaka

Butaye, P. 2000. Influence of different medium components on the in vitro activity of the growth-
promoting antibiotic flavomycin against enterococci. Journal of Antimicrobial Chemotherapy.
46(5):713–716.

Chen, C. P., C. C. Lin, dan N. Tsuneo. 1989. Screening of taiwanese crude drugs for antibacterial
activity against streptococcus mutans. Journal of Ethnopharmacology. 27(3):285–295.

Cole, M. D. 1994. Key antifungal, antibacterial and anti-insect assays-a critical review. Biochemical
Systematics and Ecology. 22(8):837–856.

Cordell, A. G. dan M. O. Hamburger. 1987. A direct bioautographic tlc assay for compounds.
Journal of Natural Products. 50(I):19–22.

Cos, P., A. J. Vlietinck, D. Vanden Berghe, dan L. Maes. 2006. Anti-infective potential of natural
products: how to develop a stronger in vitro “proof-of-concept”. Journal of
Ethnopharmacology. 106(3):290–302.

Dimayuga, R. dan S. Garcia. 1991. Antimicrobial screening of medicinal plants from baja california
sur, mexico. 31:181–192.

Eloff, J. N. 1998. A sensitive and quick microplate method to determine the minimal inhibitory
concentration of plant extracts for bacteria. Planta Medica. 64(8):711–713.

Essawi, T. dan M. Srour. 2000. Screening of some palestinian medicinal plants for antibacterial
activity. Journal of Ethnopharmacology. 70(3):343–349.

Griffin, S. G., J. L. Markham, dan D. N. Leach. tanpa tahun. An agar dilution method for the
determination of the minimum inhibitory concentration of essential oils. (July 2013):37–41.

Hadacek, F. dan H. Greger. 2000. Testing of antifungal natural products: methodologies,

comparability of results and assay choice. Phytochemical Analysis. 11(3):137–147.

Hood, J. R., J. M. Wilkinson, H. M. A. Cavanagh, J. R. Hood, J. M. Wilkinson, dan H. M. A. Cavanagh.

2003. Evaluation of common antibacterial screening methods utilized in essential oil
research evaluation of common antibacterial screening methods utilized in essential oil
research. (December 2003):425–433.

Hostettman, K., J. Wolfender, dan S. Rodriguez. 1997. Rapid detection and subsequent isolation of
bioactive constituents of crude plant extracts. 63:2–10.
 22

Kloucek, P., Z. Polesny, B. Svobodova, E. Vlkova, dan L. Kokoska. 2005. Antibacterial screening of
some peruvian medicinal plants used in callería district. Journal of Ethnopharmacology.
99(2):309–312.

Mah, T. C. dan G. A. O. Toole. 2001. Mechanisms of biofilm resistance to antimicrobial agents.

9(1):34–39.

Paulo, A., A. Duarte, dan E. T. Gomes. 1994. In vitro antibacterial screening of cryp tolepis
sanguinolen ta alkaloids. 44:127–130.

Rahalison, L., M. Hamburger, dan K. Hostettmann. 1991. A bioautographic agar overlay method
for the detection of antifungal compounds from higher plants. 2(June):199–203.

Sarker, S. D., L. Nahar, dan Y. Kumarasamy. 2007. Microtitre plate-based antibacterial assay
incorporating resazurin as an indicator of cell growth, and its application in the in vitro
antibacterial screening of phytochemicals. Methods. 42(4):321–324.

Sawai, J., R. Doi, Y. Maekawa, T. Yoshikawa, dan H. Kojima. 2002. Short communication: indirect
conductimetric assay of antibacterial activities. Journal of Industrial Microbiology and
Biotechnology. 29(5):296–298.

Shahverdi, A. R., F. Abdolpour, H. R. Monsef-esfahani, dan H. Farsam. 2007. Short communication

a tlc bioautographic assay for the detection of nitrofurantoin resistance reversal compound.
850:528–530.

Testing, E. C. for A. S. 2000. EUCAST definitive document e.def 3.1, june 2000: determination of
minimum inhibitory concentrations (mics) of antibacterial agents by agar dilution. Clinical
microbiology and infection : the official publication of the European Society of Clinical
Microbiology and Infectious Diseases. 6(9):509–515.

Valgas, C., S. M. De Souza, E. F. A. Smânia, dan A. Smânia. 2007. Screening methods to determine
antibacterial activity of natural products. Brazilian Journal of Microbiology. 38(2):369–380.