UJI KEMURNIAN DNA MENGGUNAKAN METODE SPEKTROFOTOMETER

UV-Vis

Dwi Susilowati
Magister Ilmu Forensik Fakultas Pascasarjana
Universitas Airlangga

ABSTRAK
DNA (Deoxyribonucleic acid) merupakan suatu unit struktural gen dimana DNA
terbentuk dari untaian panjang nukleotida atau yang dikenal dengan polimer nukleotida
yang tidiri dari satu gugus fosfat, suatu gula pentosa, dan satu basa N yang mempunyai
ikatan hidrogen pada basa nukleotida kemudian berubah rantai saling berikatan. Dalam
forensik DNA digunakan sebagai sampel untuk identifikasi namun sebelum identifikasi
dilakukan DNA perlu di lakukan pengujian. Pengujian dapat dilakukan dengan
menggunakan metode spektrofotometer. Spektrofotometer merupakan salah satu metode
yang dapat digunakan untuk mengukur kadar dan kemurnian atau kuantifikasi DNA.
Dimana spektrofotometer UV memiliki prinsip radiasi sinar ultraviolet yang dapat diserap
oleh nuklotida DNA dan protein dalam larutan. Dimana dalam penyerapannya maksimal
oleh DNA pada Panjang gelombang (λ) 260 nm sedangkan protein pada panjang
gelombang (λ) 280 nm.
Kata kunci: spektrofotometri UV-Vis, DNA

PENDAHULAN
DNA (Deoxyribonucleic acid) 2016). Dalam forensik DNA dapat
merupakan suatu unit struktural gen digunakan sebagai sampel untuk
dimana DNA terbentuk dari untaian dilakukan identifikasi namun sebelum
panjang nukleotida atau yang dikenal identifikasi dilakukan DNA perlu di
dengan nama polimer nukleotida yang lakukan pengujian. Pengujian tersebut
tidiri dari satu gugus fosfat, suatu gula berupa kadar dan kemurnian atau
pentosa, dan satu basa N yang kuantifikasi DNA yang bertujuan untuk
mempunyai ikatan hidrogen pada basa mengetahui kualitas DNA yang didapat.
nukleotida kemudian berubah rantai Saat melakukan pengujian bisa dengan
saling berikatan (Santoso dan Santri,
menggunakan metode spektrofotometri Spektrofotometer UV-Vis
(Fatchiyah et al, 2011). merupakan pengukuran serapan cahaya
di daerah ultraviolet (200-350nm) dan
Spektrofotometri merupakan
sinar (350-800nm) oleh sutau senyawa.
salah satu metode yang dapat digunakan
Serapan cahaya UV atau Vis (cahya
untuk mengukur kadar dan kemurnian
tampak) yang mengakibatkan transisi
atau kuantifikasi DNA. Prinsip dasar
elektronik, yaitu promosi elektron-
pada spektrofotometri adalah sampel
elektron dari oribital keadaan dasar yang
yang digunakan harus jernih dan larutan
berenergi rendah ke orbital keadaan
sempurna, tidak ada partikel koloid atau
tereksitasi berenergi lebih rendah.
duspensi. Dimana spektrofotometer UV-
Vis memiliki prinsip radiasi sinar DNA
ultraviolet yang dapat diserap oleh Deoxyribonucleic acid atau
nuklotida DNA dan protein dalam larutan DNA adalah suatu unit struktural gen,
(Yudianto, 2015). dimana DNA ini terbentuk dari untaian
panjang nukleotida atau yang dikenal
Spektrofotometer merupakan
dengan nama polimer nukleotida yang
alat untuk mengukur transmitan atau
terdiri dari satu gugus fosfat, satu gula
absorban suatu sampel sebagai fungsi
pentosa, dan satu basa N yang memiliki
panjang gelombang, tiap media akan
ikatan hidrogen di antara basa nukleotida
menyerap cahaya pada panjang
kemudian berubah kedua rantai saling
gemlombang tertentu dan tergantung
berikatan (Santoso dan Santri, 2016).
pada senyawa atau warna yang terbentuk
Menurut Yudianto (2015) menjelaskan
(Cairns, 2009). Spektrofotometer
bahwa basa nitrogen DNA terdiri atas
merupakan alat yang dapat digunakan
basa Guanin (G) dan Adenin (A) disebut
untuk mengukur absorban dengan
purin, serta Sitosin (C) dan Timin (T)
menggunakan cara yaitu melewatkan
disebut pirimidin. Dari hal inilah setiap
cahaya dengan panjang gelombang
urutan basa nitrogen yang membentuk
tertentu pada suatu objek kaca atau kuvet.
DNA yang menjadi pembeda antara
Sebagian dari cahaya tersebut akan di
individu satu dengan individu lainnya,
serap dan sisanya akan dilewatkan. Nilai
disebabkan setiap individu tersebut
absorbansi dari cahaya yang di serap
memiliki susanan basa yang berbeda-
sebanding dengan konsentrasi larutan di
beda. (Yudianto, 2015).
dalam kuvet (Sastrohamidjojo, 2007).
 Dalam forensik DNA dapat Spektrofotometer
digunakan sebagai sampel untuk Spektrofotometer adalah alat
dilakukan identifikasi namun sebelum yang terdiri dari spektrometer dan
identifikasi dilakukan DNA perlu di fotometer. Spektrofotometer yang dapat
lakukan pengujian. Pengujian tersebut menghasilkan sinar dari spectrum dengan
berupa mengukur kadar dan kemurnian panjang gelombang tertentu, sedangkan
atau kuantifikasi DNA yang bertujuan fotometer merupakan alat pengukur
untuk mengetahui kualitas DNA yang intensitas cahaya yang ditransmisikan
didapat. Dapat lakukan pengujian atau dapat di absorbsi. Sehingga
terlebih dahulu dengan menggunakan spektrofotometer bisa digunakan sebagai
spektrofotometri (Fatchiyah, 2011). pengukur energi relatif jika energi

Spektrofotometri merupakan tersebut ditransmisikan, direfleksikan

salah satu metode yang dapat digunakan atau diemiskan sebagai fungsi panjang
gelombang. Keunggulan dari
untuk mengukur kadar dan kemurnian
atau kuantifikasi DNA. Prinsip dasar spektrofotometer adalah panjang

pada spektrofotometri adalah sampel gelombang dari sinar putih yang dapat di

harus jernih dan larutan sempurna, tidak deteksi, dan cara ini diperoleh dengan

ada partikel koloid apalagi duspensi. alat pengurai yaitu prisma, grating atau

Dimana spektrofotometer UV memiliki celah optis. Pada fotometer filter dari

prinsip radiasi sinar ultraviolet yang berbagai warna yang mempunyai

dapat diserap oleh nuklotida DNA dan spesifikasi melewatkan trayek pada

protein dalam larutan (Yudianto, 2015). panjang gelombang tertentu (Gandjar,

2007).
Dalam menguji kadar dan
kemurnian DNA dapat menggunakan Spektrofotometer UV-Vis adalah
teknik spektro yang menggunakan
metode seperti spektrofotometer UV
dimana memiliki prinsip radiasi sinar sumber radiai elektromagnetik ultraviolet
dekat (190nm-380nm) dan sinar tampak
ultaraviolet yang diserap oleh nukleotida
(DNA) dan protein dalam larutan. (380nm-780nm) dengan memakai

Dimana dalam penyerapannya maksimal instrumen spektrofotometer. Umumnya

oleh DNA pada Panjang gelombang (λ) spektrofotometer UV-Vis bekerja

260 nm sedangkan protein pada panjang berdasarkan teori dimana setiap unsur

gelombang (λ) 280 nm. pada tabel periodik adalah unik. Setiap
unsur berupa atom atau ion yang hanya
dapat menyerap satu cahaya dengan cuplikan dengan blanko atau pun
panjang gelombang tertentu dan pembanding.
memantulkan yang lainnya, dan hanya
Prinsip Kerja Spektrofotometer
pada panjang gelombang elektron dapat
Prinsip kerja spektrofotometer
tereksiasi atau berpindah dari orbital satu
adalah penyerapan cahaya pada Panjang
ke orbital lain.
gelombang tertentu pada bahan yang
Kegunaan dari Spektrofotometer UV- diperiksa. Setiap zat memiliki absorbansi
Vis pada Panjang gelombang tertentu yang
Spektroskopi UV-Vis adalah khas. Panjang gelombang dengan
metode penting yang mapan, andal dan absorbansi tertinggi digunakan untuk
akurat. Dengan menggunakan mengukur kadar zat yang diperiksa.
spektroskopi UV-Vis, substansi tak Dengan banyaknya cahaya yang
dikenal dapat diidentifikasi dan diabsorbsi oleh zat berbanding lurus
konsentrasi substansi yang dikenal dapat dengan kadar zat.
ditentukan. Pelarut untuk spektroskopi
Spektrum elektromagnetik
UV harus memiliki sifat pelarut yang
dibagi dalam beberapa daerah cahaya.
baik dan memancarkan sinar UV dalam
Suatu daerah akan diabsorsi oleh atom
rentang UV yang luas. Spektroskopi UV-
atau molekul dan Panjang gelombang
Vis juga digunakan untuk cairan
dan cahaya yang diabsorbsi dapat
berwarna.
menunjukan struktur senyawa yang lebih

Adapun kegunaan lain dari teliti. Spektrum elektromagnetik meliputi

spektrofotometer UV-Vis yaitu alat yang suatu daerah dan Panjang gelombang

digunakan untuk mengukur transmitansi, yang luas dari sinar gamma gelombang

reflektansi dan absorbs dari cuplikan pendek berenergi tinggi sampai pada

sebagai fungsi dari Panjang gelombang. panjang gelombang mikro (Marzuki

Spektrofotometer digunakan untuk Asnah 2012).

diemisikan sebagai fungsi dari Panjang Keuntungan utama dari metode

gelobang. Suatu spektrofotometer spektrofotometer adalah metode yang
tersusun dari sumber spektrum sinar memberikan cara sederhana untuk
terlihat yang seimbang dan menetapkan kuantitas zat yang sangat
monokromatis. Sel pengabsorbi untuk kecil. Selain itu, hasil yang didapatkan
mengukur perbedaan absorbs antara cukup akurat, dimana angka yang terbaca
langsung dicatat oleh detector dan  Sinar yang digunakan dianggap
tercetak dalam bentuk angka digital monokromatis
ataupun grafik yang sudah diregresikan  Penyerapan terjadi dalam suatu
(Yahya S, 2013). Secara sederhana volume yang mempunyai
instrument spektrofotometeri yang penampang yang sama
disebut spektrofotometer terdiri dari :  Senyawa yang menyerap dalam
larutan tersebut tidak tergantung
terhadap yang lain dalam larutan
tersebut
 Tidak terjasi fluorensensi atau
fosforisensi
 Indeks bias tidak tergantung pada

Gambar 1. Spektrofotometer UV-Vis konsentrasi larutan.

Hukum Lambert Beer dinyatakan dalam
rumus sebagai berikut :
Cahaya dari lampu akan
A=e.b.c
dipancarkan lurus kearah sampel, sampel
Dimana :
akan terkesitasi, dan hasil dari eksitasi
A = absorban
electron pada sampel akan ditangkap
e = absorptivitas molar
oleh detector. Hal yang perlu
b = tebal kuvet (cm)
diperhatikan dalam perinsip kerja
c = konsentrasi
spektrofotometer UV-Vis merupakan
Spektrum cahaya yang dapat
sampel yang tidak dapat langsung
terlihat oleh mata terentang antara 400
disinari oleh cahaya lampu namun perlu
nm sampai 800 nm. Pada Teknik
diwarnai terlebih dahulu yaitu dengan
sptrofometri, cahaya dari sumberr cahaya
menanbahkan zat aditif yang bereaksi
diuraikan menggunakan prisma sehingga
dengan kation atau anion yang ingin
diperoleh cahaya monokromatis yang
diukur.
diserap oleh zat yang akan diperiksa.
Hukum Lambert Beer
Cahaya monokromatis merupakan
menyatakan hubungan linier antara
cahaya satu warna dengan satu Panjang
absorbansi dengan konsentrasi larutan
gelombang, sehingga cahaya yang
analit dan berbanding terbalik dengan
diserap oleh larutan berwarna dapat
transmitan. Dalam hukum Lambert Beer
diukur (Sastrohamidjojo, 2013).
tersebut ada beberapa pembatasan, yaitu:
 Warna yang dapat diserap oleh memisahkan campuran potongan
suatu senyawa merupakan warna DNA sesuai dengan ukurannya
komplementer dari warna yang telah secara akurat, dibanding dengan
diamati. Beberapa warna yang terlihat densitas gradient sentrifugasi.
dan warna komplementernya terdapat Selanjutnya, lokasi DNA dalam
pada table berikut : gel tersebut dapat diidentifikasi
(Day,R.A et al, 2002) secara langsung dengan

Panjang Warna Warna menggunakan pewarna

Gelomba Terlihat Komplemen berfluorescen (Yuwono, 2006).

ng ter b. Analisis Kuantitatif

< 400 Ultraviol - Uji kuantitatif
et spektrofotometri UV-Vis
400 – 450 Violet Kuning dengan sampel DNA murni
450 – 490 Biru Jingga dapat menyerap cahaya
490 – 550 Hijau Merah ultraviolet karena terdapat
550 – 580 Kuning Ungu
basa-basa purin dan pirimidin.
580 – 650 Jingga Biru
Pita ganda yang terdapat pada
650 – 700 Merah Hijau
DNA dapat menyerap cahaya
>700 Inframer
UV dengan 𝜆 260 nm,
ah
sedangkan kontaminan protein
Tabel 1. Warna terlihat dan warna
komplementer atau phenol akan menyerap
cahaya pada 𝜆 280 nm. Sehingga
Analisis Sampel Spektroskopi UV/Vis
kemurnian DNA dapat diukur
Spektrofotometer UV/Vis dapat
dengan menghitung nilai
digunakan untuk analisis kualitatif
absorbansi 𝜆 260 nm dibagi
maupun analisis kuantitatif.
a. Analisis Kualitatif dengan nilai absorbansi 𝜆 280

Metode standar yang dapat (Å260/Å280), dan niali

digunakan untuk memisahkan, kemurnian DNA berkisar antara

mengidentifikasi dan untuk 1,8-2,0 (Fachtiyah et al, 2011).

memurnikan fragmen DNA Mengukur konsetrasi DNA

dengan elektroforesis gel digunakan rumus sebagai

agorose. Tekni ini sederharna, berikut:

cepat terbentuk, dan mampu

(DNA) = Å260 x 50 x factor ultraviolet terentang dari 100nm
pengenceran sampai 400nm.
Å260 = Nilai absorbansi pada 𝜆 260 nm Kuantitas energi yang dapat
50 =Larutan dengan nilai diserap oleh suatu senyawa
absorbansi 1,0 sebanding dengan 50 ug
berbanding terbalik dengan Panjang
untai ganda DNA per ml (dsDNA)
gelombang radiasi :
Penggunaan sinar UV dalam analisis
kuantitatif memberikan beberapa
keuntungan, diantaranya :
 Dapat digunakan secara luas
 Memiliki kepekaan tinggi
 Keselektifannya cukup baik
dan terkadang tinggi
 Ketelitian tinggi dan tidak
rumit
Adapun langkah-langkah utama Violet : 400 – 420 nm
dalam analisis kuantitatif adalah: Indigo : 420 – 440 nm
Biru : 440 – 490 nm
 Pembentukan warna (untuk
Hijau : 490 – 570 nm
zat yang yang tak berwarna
Kuning : 570 – 585 nm
atau warnanya kurang kuat)
Oranye : 585 – 620 nm
 Penentuan panjang
Merah : 620 – 780 nm
gelombang maksimum
 Pembuatan kurva kalibrasi
 Pengukuran konsentrasi
sampel
Panjang gelmbang cahaya
UV/Vis jauh lebih pendak, spektrum
sinar tampak terentang dari sekitar
400nm (ungu) sampai 750nm Gambar 2. Spektrum UV
(merah), sedangkan spektrum
Analisis ini dapat digunakan yakni
dengan penentuan absorbansi dari
larutan sampel yang diukur. Prinsip
penentuan spektrofotometer UV/Vis
adalah aplikasi dari Hukum Lambert-
Beer, yaitu:
A = - log T = - log It / Io = ε . b . C
Dimana :
A = Absorbansi dari sampel
yang akan diukur
T = Transmitansi
I0 = Intensitas sinar masuk
It = Intensitas sinar yang
diteruskan
ε = Koefisien ekstingsi
b = Tebal kuvet yang
digunakan
c = Konsentrasi dari sampel
Hubungan antara spektrofotometri
UV-VIS dengan materi fisika listrik,
magnet, gelombang, dan optik
Spektrofotometri sebagai salah
satu metode dalam kimia analisis yang
digunakan untuk menentukan komposisi
atau konsentrasi suatu sampel baik secara
kuantitatif dan kualitatif menggunakan
teori dari fisika dasar terutama pada
masalah interaksi antara materi dengan
cahaya atau radiasi elektromagnetik,
radiasi elektromagnetik kemungkinanan
dihamburkan, diabsorbsi, atau
dihamburkan, sehingga dikenal adanya
spektroskopi hamburan, spektroskopi
absorbsi, ataupun spektroskopi emisi.
Radiasi elektromagnetik
memiliki sifat ganda yang disebut
sebagai sifat dualistik cahaya yaitu:
1. Sebagai gelombang.
2. Sebagai partikel-partikel
energi yang disebut foton.
Karena sifat tersebut, maka
beberapa parameter perlu diketahui,
misalnya panjang gelombang, frekuensi,
dan energi tiap foton. Panjang gelombang
(l) didefinisikan sebagai jarakantara dua
puncak.
Grafik 2.6.1 Hubungan antara
Panjang Gelombang dengan
Jarak
Hubungan dari ketiga parameter
di atas dirumuskan oleh Planck yang
dikenal dengan persamaan Planck.
Hubungan antara panjang gelombang
frekuensi dirumuskan sebagai
𝑐=𝜆𝑣
Persamaan Planck merupakan
persamaan yang menggambarkan kuvet. Sebagian dari cahaya tersebut
akan di serap dan sisanya akan
hubungan antaraenergi tiap foton dilewatkan. Nilai absorbansi dari
dengan frekuensi.
cahaya yang di serap sebanding
ℎ𝑐 dengan konsentrasi larutan di dalam
E=h.v= λ
kuvet .
Dimana:
E = energi tiap foton Spektrofotometri merupakan
salah satu metode yang dapat
h = tetapan Planck (6,626 x 10-32 J . s digunakan untuk mengukur kadar dan
)
kemurnian atau kuantifikasi DNA.
v = frekuensi sinar Prinsip dasar pada spektrofotometri
c = kecepatan cahaya (3 x 108 m.s-1) adalah sampel harus jernih dan
larutan sempurna, tidak ada partikel
Dari rumus tersebut, dapat koloid apalagi duspensi. Dimana
spektrofotometer UV memiliki
diketahui bahwa energi dan
prinsip radiasi sinar ultraviolet yang
frekuensi suatu foton akan dapat diserap oleh nuklotida DNA
berbanding terbalik dengan panjang dan protein dalam larutan.
gelombang, tetapi energi yang DAFTAR PUSTAKA
dimiliki suatu foton akan berbanding Anggereini, Evita. "Random Amplified
lurus dengan frekuensinya. Polymorphic DNA (RAPD),
Misalnya, energi yang suatu metode analisis DNA

dihasilkan cahaya UV lebih besar dalam menjelaskan berbagai

fenomena
daripada energi yang dihasilkan
biologi." Biospecies 1,2008
sinar tampak. Hal ini disebabkan UV
Day,R.A dan A.L.Underwood. Analisa
memiliki panjang gelombang (λ)
Kimia Kuantitatif.Erlangga:
yang lebih pendek (100–400 nm)
Jakarta 2002
dibanding panjang gelombang yang
Fachtiyah, ELA Rumingtyas, S
dimiliki sinar tampak (400–800 nm).
Widyarti, S Rahayu.

Simpulan Biologi Molekular, Erlangga.

Spektrofotometer adalah alat Jakarta (2011).
yang dapat digunakan untuk
Gandjar, Ibnu Gholib. Kimia Farmasi
mengukur absorban dengan
menggunakan cara yaitu melewatkan Analisis. Yogyakarta : Pustaka
cahaya dengan panjang gelombang Pelajar. 2007
tertentu pada suatu objek kaca atau Marzuki, Asnah. Kimia Analisis
 Farmasi. Makassar : Dua Satu
Press. (2012).
Pertiwi, Kartika Ratna. "Penerapan
Teknologi DNA dalam
Identifikasi Forensik." Jurnal
Ilmiah WUNY 16, no. 4 (2014).
Pharmatutor.org.Applications of
Absorption Spectroscopy
(UV,Visible).(2016).
Sastrohamidjojo, Hardjono. Dasar
Dasar Spektroskopi.
Yogyakarta: UGM Press
(2013).
Soewoto Hafiz,dkk.Biokimia
Eksperimen Laboratorium
Bagian Biokimia
FKUI. Widya Medika.
Jakarta. (2001).
Suharsono & Widyastuti, U.
Penuntun Praktikum
Pelatihan Teknik Pengklonan
Gen”. Pusat Penelitian
Sumber Daya Hayati &
Bioteknologi. Institut
Pertanian Bogor (2006).
Syauqi,A.UV-Vis Spectrophotometry,
Bontang: LNG Academy-Gas
Processing. (2014).
Teaching.shu.ac.uk.UV-Vis
Absorption Spectroscopy
Theory. (2016).
Universitas Negeri Yogyakarta.
Pendahuluan Spektroskopi
(2016)
Yahya.sripatundita.JURNAL
SPEKTROFOTOMETER-UV-
VIS. (2015)
Yudianto, Ahmad, and Nola Margaret.
"Effect Of Room Temperature
On The Quality Of DNA From
Earphone Swab by Observing
Mitochondrial Dna [mtDNA]
D-LOOP REGION OF 126 bp
(HVS II, nt 34-159) AND 143 bp
(HVS I, nt 16268 16410)." Folia
Medica Indonesiana 53, no. 2
(2017)
Yuwono,T.Teori dan Aplikasi
Polymerase Chain Reaction.
Penerbit Andi Yogyakarta
(2006).