Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis

24 (2001) 1005–1010
www.elsevier.com/locate/jpba

Validasi metode HPLC untuk kuantifikasi ambroxol

hidroklorida dan asam benzoat dalam sirup sebagai uji tekanan
bentuk farmasi untuk evaluasi stabilitas
Maarit Heina¨ nen,Coral Barbas b,*
Laboratorium
KimiaAnalitik, Uni6ersity dariHelsinki, Helsinki, Finlandia
b
Facultad de CC Experimentales yTe'cnicas, Uni6ersidadS. Pablo-CEU, Urbanizacio´n Monteprncipe, Ctra. Boadilla del Monte, km 5,3 28668
Madrid, Spanyol

Diterima 16 Mei 2000; diterima dalam bentuk revisi 24 Oktober 2000; diterima 27 Oktober 2000

Abstrak

Sebuah metode dijelaskan untuk ambroxol, trans-4-(2-amino-3,5-dibromobenzylamino) sikloheksanol hidroklorida, dan

pemisahan asam benzoat dengan HPLC dengan deteksi UV pada 247 nm dalam sirup sebagai presentasi farmasi. Kondisi optimal
adalah: Column Symmetry Shield RPC8, 5 mm 250×4,6 mm, dan metanol/(H3PO4 8,5 mM/trietilamin pH=2,8) 40:60 v/v. Validasi
dilakukan dengan menggunakan standar dan sediaan farmasi yang mengandung senyawa yang dijelaskan di atas. Hasil dari standar
dan sampel menunjukkan parameter validasi yang sesuai. Bahan kelas farmasi diuji oleh faktor-faktor yang dapat mempengaruhi
stabilitas kimia. Campuran reaksi ini dianalisis untuk mengevaluasi kemampuan metode untuk memisahkan produk degradasi.
Produk degradasi tidak mengganggu penentuan zat yang diuji dengan pengujian. © 2001 Elsevier Science BV Hak cipta dilindungi
undang-undang.

Kata kunci: Ambroxol; Asam benzoat; HPLC; Sirup; Farmasi

1. Pendahuluan benzoat dengan pka.

Ambroxol hidroklorida dapat ditemukan dalam
Ambroxol, trans-4-(2-amino-3,5-dibromoben sediaan farmasi seperti tetes, butiran, suntikan, sirup dan
zylamino)sikloheksanol hidroklorida, adalah senyawa tablet. Beberapa
dengan aktivitas mukolitik kuat, yang digunakan
sebagai ekspektoran dan bronkosekretolitik dalam terapi
[1,2 ]. Ini adalah metabolit aktif farmakologis dari
bromhexine, N-cyclohexyl-N

* Penulis yang sesuai. Faks: +34-91-3510475. E-

mail:cbarbas@ceu.es (C. Barbas).
metil-(2-amino-3,5-dibromobenzil)amina hidro klorida.
Ambroxol merangsang pengangkutan sekresi kental di
organ pernapasan dan mengurangi kemandekan sekresi.
Asam benzoat adalah pengawet antimikroba yang sering
dimasukkan dalam bentuk farmasi cair. Gambar 1
menunjukkan struktur kimia ambroxol dan asam
0731-7085/01/$ yang berbeda - lihat materi depan © 2001 Elsevier Science BV Hak cipta
dilindungi undang-undang. PII: S 0 7 3 1 - 7 0 8 5 ( 0 0 ) 0 0 5 3 3 - 1
1006 M. Heina¨nen, C. Barbas / J. Farmasi. Bioma. anal. 24 (2001)1005-1010penentuan
Metodetelah digunakan untukindividu ambroxol
hidroklorida dalam larutan farmasi dan tablet termasuk
TLC [3,4], spektrofotometri [2], HPLC [5], injeksi
aliran [6,7] dan elektroforesis kapiler [8]. Metode yang
lebih kompleks telah dilaporkan untuk penentuan
ambroxol dalam cairan biologis [1,2,8,9].
Tak satu pun dari mereka menggabungkan analisis
satu asam dan senyawa basa dan hanya satu dari mereka
[8] telah diterapkan pada sirup, yang memiliki masalah
karena adanya eksipien, zat penstabil dan zat penyedap.
Selain itu, elektroforesis kapiler belum menjadi teknik
rutin dalam pengendalian kualitas farmasi dan
parameter validasi lengkap tidak disajikan dalam
makalah ini.
Karena karakteristik asam-basa dari senyawa yang
dianalisis di sini, pemisahan sangat bergantung pada pH,
sehingga pengaruh variabel ini telah dipelajari. Dua
jenis fase diam yang berbeda diuji serta strategi yang
berbeda untuk menghindari tailing di puncak: perubahan
pH fase gerak atau penambahan pengubah.
Setelah mengoptimalkan pemisahan, metode
divalidasi untuk standar dan sirup dari sediaan farmasi
yang mengandung zat-zat ini dengan menentukan
linearitas, presisi dan akurasi. Secara bersamaan, karena
metode ini dapat digunakan untuk pengujian stabilitas,
standar dan sampel mengalami kondisi degradasi untuk
membuktikan bahwa tidak ada gangguan yang muncul.
Gambar 1. Struktur kimia dari dua analit: (a) ambroxol hidroklorida;
(b) asam benzoat.
2. Eksperimental
2.1. Analisis instrumentasi dan kromatografi
M. Heina¨nen, C. Barbas / J. Farmasi. Bioma.
anal. 24 (2001) 1005–1010 1007 2.4. Validasi
Sistem HPLC Beckman (Palo Alto, USA) yang
dilengkapi dengan pompa 126, injektor otomatis (507e),
detektor Array Dioda 168 dan pemroses data Sistem
Emas digunakan. Analisis grafikdilakukan pada5
mkromatokolomm Sym metry Shield RP8 (Waters)
(25×0,46 cm) yang disimpan dalam oven kolom Biorad
pada suhu 35°C.
Eluen memiliki laju alir 1 ml/menit dan fase gerak
yang memberikan hasil terbaik adalah metanol/(H3PO4
8,5 mM/trietilamin pH= 2,8) 40:60 v/v. Deteksi
dilakukan pada 247 nm dan puncak diidentifikasi
dengan waktu retensi dibandingkan dengan standar dan
dikonfirmasi dengan spektrum karakteristik
menggunakan detektor array fotodioda.
2.2. Reagen
Semua pelarut adalah kualitas kelas HPLC yang
dibeli dari Scharlau (Barcelona, Spanyol). Reagen
umum berasal dari Merck (Darmstadt, Jerman) dan
standar ambroxol hidroklorida, asam benzoat, sirup
yang mengandung senyawa aktif ini, ambroxol cinfa 15
mg, dan semua komponen plasebo dipasok oleh Lab
oratorios CINFA SA (Pamplona, Spanyol ).
2.3. Metode
Fase gerak terdiri dari buffer berair-metanol dengan
proporsi 60:40. Buffer siap dengan 8,5 mM H 3PO4 dan
pH diatur dengan menambahkan trietilamina. Nilai pH
yang diuji berada dalam rentang kerja yang
direkomendasikan untuk kolom (dari 2,5 hingga 7,5)
dan diukur dalam semua kasus sebelum penambahan
metanol.
Untuk optimasi, larutan sampel disiapkan melarutkan
analit dalam fase gerak untuk memberikan konsentrasi
0,3 mg/ml am broxol hidroklorida dan 0,2 mg/ml asam
benzoat. Volume injeksi adalah 50 ml untuk
menghasilkan respon UV yang memadai untuk
mendeteksi produk degradasi ketika ada.
 Setelah kondisi kromatografi
ditetapkan, validasi metode dilakukan mengikuti
spesifikasi ICH [10,11]. Standar dan
linieritas sampel diverifikasi dengan analisis dalam rangkap tiga
dari lima titik dalam kisaran 0,15-0,45
mg/ml untuk ambroxol hidroklorida dan 0,10-0,30
mg/ml untuk asam benzoat yang sesuai dengan
50-150% dari nilai sampel yang diharapkan.
Pemulihan dievaluasi dengansama
metode yangdengan membandingkan konsentrasi yang
dihitung dan konsentrasi yang diukur.
Pengulangan instrumental dan presisi menengah
ditentukan dengan memproses dua seri injeksi dengan
standar yang sama, yang sesuai dengan titik tengah
dalam rentang linieritas, pada 2 hari yang berbeda.
Reatabilitas dan presisi antara dari metode yang
diterapkan pada produk akhir ditentukan dengan
memproses dua seri 10 sampel, yang disiapkan seperti
dijelaskan di bawah, pada 2 hari yang berbeda dan
dengan standar yang sesuai untuk kuantifikasi.
Perlakuan sampel: 2.9081 g sampel ditimbang dalam
labu takar 25 ml dan diisi hingga volume dengan fase
gerak. Sampel disaring melalui membran nilon0,45
mberukuran porim sebelum dilewatkan ke vial injeksi.
2.5. Degradasi yang dipercepat
Pengujian stabilitas [12] dilakukan untuk
memastikan bahwa produk obat tidak terdegradasi
sampai tanggal jual habis. Metode analitis yang akan
digunakan untuk pengujian stabilitas harus dapat
memisahkan produk degradasi dari zat aktif.
Kondisi degradasi meliputi: media asam dengan
buffer fosfat 0,2 M, pH= 1,0; air; media basa dengan
Na2HPO4 0,4 M pH=8,9 dan media pengoksidasi
dengan H0,3%2O2. Dalam semua kasus 1% (b/v)
standar atau sampel dipanaskan dalam autoklaf selama
1 jam pada 120 °C. Pengenceran dilakukan untuk
mencapai konsentrasi yang sama seperti pada penilaian.
1008 M. Heina¨nen, C. Barbas / J. Farmasi. Bioma. anal. 24 (2001) 1005–1010pelarut
Hal lain yang perlu dipertimbangkan adalahorganik
yang digunakan dalam fase gerak. Kehadiran metanol
dalam campuran memiliki pengaruh yang kuat dalam
disosiasi buffer dan zat terlarut dasar. Kandungan
metanol dalam fase gerak juga berpengaruh pada
karakteristik retensi zat terlarut dasar, [13]. Jadi,
langkah selanjutnya adalah mengubah asetonitrilo
menjadi metanol dan menganalisis standar dan plasebo
lagi dengan berbagai jenis fase gerak, perubahan pH
buffer fosfat dan jumlah MeOH. Hasil terbaik, Gambar
3, diperoleh dengan fase gerak berikut: H 3PO4 8,5 mM
pH 2,8 (dengan trietilamina)/MeOH=60:40.
Urutan elusi ambroxol hidroklorida dan asam benzoat
berubah dengan pH dalam fase gerak. Suatu senyawa
Gambar 2. Kromatogram standar: (a) asam benzoat 2,45 menit dan
ambroxol hidroklorida t=12,56 menit, dan plasebo; (b) Kondisi: Kolom
Symmetry Shield RP8, aceto nitrile/(H3PO4 8,5 mM/tryethylamine
pH=2,8) 40:60 v/v, laju alir 1 ml/menit dan deteksi UV pada 247 nm.
3. Hasil dan pembahasan
Ada banyak cara yang mungkin untuk menekan
interaksi sisa silanol pada permukaan silika-gel dengan
analit basa, yang sering mengarah pada pemisahan yang
lebih rendah karena tailing dari puncak. Pengurangan
ionisasi situs SiOH asam dengan menggunakan fase
gerak pH rendah (pHB4) atau, sebaliknya, penurunan
ionisasi sampel basa dengan meningkatkan pH fase
gerak adalah metode yang paling mudah. Pendekatan
lain memanfaatkan penambahan 'silanol blocker' [13],
misalnya trietilamina ke fase gerak dan ini terbukti
menarik untuk memungkinkan elusi ambroxol dalam
penelitian ini.
Optimasi dimulai dengan fase gerak buffer fosfat 8,5
mM pH 6,5/ACN 60:40 (v/v), pH 6,5 dicapai dengan
trietilamina. Nilai ini dipilih karena dianggap kompromi
untuk senyawa asam dan basa. Namun, pada kondisi
tersebut kromatogram yang ditumpangkan menunjukkan
bahwa plasebo mengganggu standar asam benzoat
seperti dapat dilihat pada Gambar 2. Optimasi
dilanjutkan dengan mengubah jumlah asetonitrilo dan
pH buffer serta menambahkan tetrahydrofuran. .
Senyawa terakhir ini dapat mempengaruhi selektivitas
ester yang muncul pada plasebo. Namun demikian, tidak
satu pun dari perubahan ini yang cukup baik untuk
mendapatkan resolusi yang memadai antara komponen
yang berbeda.
basa, seperti ambroxol hidroklorida, lebih tertahan
dalam RP HPLC dalam bentuk molekuler atau tidak
terionisasi, yaitu dengan nilai pH yang lebih tinggi
dalam fase gerak. Hal sebaliknya terjadi pada asam
benzoat dan itulah penyebab perubahan urutan elusi
yang diamati antara pH= 6,5 dan 2,8.
Meskipun pengujian pengembangan awal dilakukan
dengan kolom yang digambarkan memiliki aktivitas
hidrofobisitas dan silanol menengah, seperti NovaPak
C18, kolom Symmetry Shield RP8 kemudian diuji
karena memiliki salah satu aktivitas hidrofobisitas dan
silanol terendah, dan telah terbukti memiliki perilaku
yang lebih baik. dengan senyawa terionisasi seperti
yang terlihat pada karya sebelumnya di laboratorium
[14].
Gambar 3. Kromatogram standar: (a) am broxol hidroklorida 7 menit
dan asam benzoat 14,45 menit, dan plasebo; (b) Kondisi: Simetri
Perisai kolom RP8, metanol/(H3PO4 8,5 mM/tryetilamin pH=2,8)
40:60 v/v, laju alir 1 ml/menit dan deteksi UV pada 247 nm.
Fase diam dengan aktivitas hidrofobisitas dan silanol
yang lebih rendah (Symmetry Shield RP8) dipilih untuk
mengurangi interaksi sekunder yang mengarah pada
tailing di puncak dan faktor kapasitas yang lebih tinggi
untuk senyawa dasar.
Dorsey dan Cooper [15] menunjukkan gulungan fase
diam dalam kromatografi fase terbalik, sebagai fungsi
dari kepadatan rantai dan bahwa kekuatan pendorong
utama dalam retensi berubah dari mekanisme entalpi ke
mekanisme entropik. Symmetry Shield dengan beban
karbon 15,0% dan C8 diharapkan memiliki densitas
rantai yang lebih tinggi daripada Nova Pak dengan
karbon 7,3% dan C18.
M. Heina¨nen, C. Barbas / J. Farmasi. Bioma. anal. 24 (2001) 1005–1010 1009
Kondisi akhir dimana metode divalidasi adalah:
Kolom Symmetry Shield RP8, dan metanol/(H3PO4 8,5
mM/trietilamin pH=2,8) 40:60 v/v.
Hasil validasi muncul pada Tabel 1. Standar dan
sampel menunjukkan linearitas yang baik untuk kedua
analit dengan koefisien korelasi lebih dari 0,999; RSD
lereng berkisar antara 0,6 dan 0,7 untuk dua senyawa
dalam standar dan sampel yang menunjukkan
kecocokan masing-masing titik pada garis regresi.
Ambroxol hidroklorida, yang memilikieksperimental
lebih kecil t nilaidari yang ditabulasi (P=95%) tidak
menunjukkan bias yang signifikan. Di sisi lain, asam
benzoat memilikieksperimen t nilailebih unggul dari
tabulasi satu (2.160 untuk n-2=13 dan P=95%). Ini
menyajikan bias yang signifikan secara statistik yang
tidak banyak mempengaruhi konsentrasi ekstrim,
terutama karena kecocokan titik-titik dalam garis
regresi. Pada konsentrasi terkecil errornya hanya 1,7%.
Perolehan yang diperoleh adalah 100% 90,93 untuk
ambroxol dan 100% 91,38 untuk asam benzoat dalam
bahan baku dan 101% 91,42 dan 100% 91,76 dalam
bentuk farmasi. RSD maksimum dalam presisi adalah
0,9 untuk presisi menengah ambroxol.
Sehubungan dengan degradasi yang dipercepat,
hasilnya menunjukkan bahwa, ketika masing-masing zat
yang diuji didekomposisi dengan uji stres, produk
dekomposisi tidak mengganggu penentuan zat utama,
kecuali untuk puncak kecil pada plasebo di netral.
=13,8 dan luas 0,12631). Kali ini cor
media (tr merespon
dengan waktu retensi asam benzoat, (tr=13,9 dan luas
10,29446) dalam kondisi yang sama

Tabel 1
Ringkasan parameter validasi metodea

ra9CL b9CL Kisaran

Linearitas dan kisaran bahan baku
Ambroxol 0.9997 0.15–0.45 mg 0.795.5 1117917 /ml Asam benzoat 0.9995 2497 1752935 0.1–0.3 mg/ml
Linearitas dan jangkauan produk akhir
Ambroxol 0.9992 299 1126927 50–150% Asam benzoat 0,9988 50–150% 17911 1798952
Presisi produk akhir RSD (%)
Pengulangan Presisi menengah
Hari 1 Hari 2 Hari 1+2
Instrumen
Ambroxol 0,44 0,43 0,46 Asam benzoat 0,30 0,44 0,80
Metode
Ambroxol 0,80 0,86 0,90 Asam benzoat 0,54 0,71 0,59
Rata-rata perolehan (%) RSD (%)
Keakuratan bahan baku
Ambroxol 100 0,93
Asam benzoat 100 1,38
Akurasi produk akhir
Ambroxol 101 1,43
Asam benzoat 100 1,76

a
a, intersep; b, kemiringan; CL, batas kepercayaan.

Ucapan Terima Kasih
Gambar. 4. Kromatogram dari: (a) asam benzoat; dan (b) plasebo
(setelah kondisi stres di media netral). Kondisi: Kolom Symmetry
Shield RP8, methanol/(H3PO4 8,5 mM/ tryethylamine pH=2,8) 40:60
v/v, laju alir 1 ml/menit dan deteksi UV pada 247 nm.
tion. Namun demikian, luas puncak pada plasebo hanya
1,2% dari puncak asam benzoat. Gambar 4 mencakup
kromatogram dari kedua zat ini.
Kesimpulannya, metode yang dipelajari cocok untuk
pemisahan, kuantifikasi dan pengujian stabilitas
1010 M. Heina¨nen, C. Barbas / J. Farmasi. Bioma. anal. 24 (2001) 1005–1010
[6] T. Pe´rez-Ruiz, C. Martine´z-Lozano, A. Sanz, MT San Miguel,
Talanta 43 (1996) 1029–1034.
[7] P. Benli, M. Tunc¸el, Pharmazie 3 (1998) 203. [8] T. Perez-Ruiz,
C. Martinez-Lozano, A. Sanz, E. Bravo, J. Chromat. B. Bioma. Sci.
aplikasi 692 (1997) 199-205. [9] MH Botterblom, TJ Janssen, PJ
Guelen, TB Vree, J. Chromat. 421 (1987) 211–215.
[10] ICH, ICH Harmonized Tripartit Guideline Langkah 4, (1996).
[11] ICH, ICH Harmonized Tripartit Guideline Langkah 3, (1996).
ambroxol dan asam benzoat dalamfarmasi
sediaan.
Studi ini telah direalisasikan dengankolaborasi
orasiCINFA SA
Referensi
[1] M. Nobilis, J. Pastera, D. Svoboda, J. Kvetina, J. Chro mat. 581
(1992) 251–255.
[2] G. Indrayanto, R. Handajani, J. Pharm. Bioma. dubur. 11 (1993)
781–784.
[3] G. Musumarra, G. Scarlata, G. Cirma, G. Romano, S. Palazzo, S.
Clementi, G. Giulietti, J. Chromat. 350 (1985) 151–168.
[4] G. Musumarra, G. Scarlata, G. Romano, G. Cappelo, S. Clementi,
G. Giulietti, J. Anal. racun. 11 (1987) 154. [5] V. Brizzi, U. Pasetti, J.
Pharm. Bioma. dubur. 8 (1990) 107–109.
.
[12] Wolfgang Grimm, D-Biberach/Rib, dalam: W. Grimm, K.
Krummer (Eds.), Pengujian stabilitas di EC, Jepang dan Amerika
Serikat, Persyaratan Ilmiah dan Peraturan 191, Asosiasi
Internasional untuk Teknologi Farmasi, Paperback APV ed.,
Stuttgart, 1993.
[13] D. Sy´kora, E. Tesarova, M. Popl, J. Chromat. A 758 (1997) 37–
51.
[14] C. Barbas, A. Garca, L. Saavedra, M. Castro, J. Chro mat. A 870
(2000) 97-103.
[15] JG Dorsey, WT Cooper, Anal. Kimia 66 (1994) 857A– 867A.